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문제 정의
- 상태이다. 그럼에도 불구하고, 최근 galectin-3 와 더불어 일련의 laminin binding protein들이 prion protein과 결합하여 prion 단백질의 발현 조절기능 가능성이 제시됨에 따라 [24] 본 실험에서는 galectin-3의 rat 뇌 조직에서의 발현을 검토하였다. 본 실험에서는 이를 위하여 우선 galectin-3의 발현을 mRNA와 단백질 수준에서 검증하였다.
제안 방법
- 다시 20, 000 g 로 1시간 동안 원심분리 하여 얻은 상청액은 asialofetuin 을 이용한 affinity chromatography로 분획 되었다. Asialofetuin affinity columne 수화시킨 cyanate-activated sepharose 4B beads (Sigma, St. Louis, USA asialofetuin 50 mg/m/을 포함한 PBS (pH 8.0) 에 담가 4oC 에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 phosphate buffer (10 mM phosphate with 2 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM MgSO4, 0.2 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 그리고 0.2% NaN& pH 7.2)로 평형을 맞춰 작성하였다. Column 을 통한 단백질 함유액은 다시 column에 흘려주어 회수율의 증대를 꾀하였고, 3-5배의 column volume의 phosphate buffer로 세척하였다.
- DNA 를 72oC 에서 10분간 신장시켰다. PCR 산물은 2% Nusieve agarose gel (FMC Co. Ltd., USA) 에 전기영동 하였다.
- RT-PCR을 통하여 galectin-3에 특이한 RNA를 검출하기 위해 각각 특이적인 염기서열의 oligonucleotide primer 들을 고안 (Table 1), 합성하여 이용하였다.
- 각각 sense 와 antisense의 primer 들을 제조하였으며 제작은 Takara사 (Shiga, Japan) 에 의뢰하였다.
- 따라서 본 연구에서는 지금까지 뇌에서 발현되지 않는다는 기존의 연구결과에 반하여 신경세포에서의 prion 결합단백으로 작용하기 위해서는 galectin-3 가 뇌 조직에서 발현되어 야 한다는 점 에서 RT-PCR 법과 Western blot analysis를 이용함으로서 기존의 면역 염색방법으로는 지금까지 확인하지 못했던 뇌조직에서의 galectin-3 발현을 확인하였다.
- 본 실험에서는 기존의 일반적인 면역 염색 방법으로는 검출되지 않았던 뇌 조직에서의 galectin-3 발현을 galectin-3의 정제 및 Western blot과 RT-PCR 방법으로 확인하였다. RT-PCR을 이용한 뇌 조직에서의 galectin-3 mRNA 의 발현 정도는 폐 조직에 비해 8분의 1 정도인 것으로 확인되었다.
- 본 실험에서는 이를 위하여 우선 galectin-3의 발현을 mRNA와 단백질 수준에서 검증하였다. 본 실험에서는 뇌 조직내에 축적되어 있는 galectin-3 의 양이 극히 적어 검출이 어려울 것이 예상되었으므로 미량의 mRNA의 발현의 확인과 발현량의 검증을 위해서 보다 민감도가 높은 RT-PCR을 이용하여 mRNA 의 발현을 확인하였고 Southern blot analysis 를 수행하여 이를 검증하는 방법을 선택하였다. Galectin-3 에대한 특이 primer 쌍 (G3F과 G3R)으로 cDNA를 증폭시켰을 경우 예상되는 PCR 반응 산물의 크기는 약 430 bp 정도로 예상된다.
- 그럼에도 불구하고, 최근 galectin-3 와 더불어 일련의 laminin binding protein들이 prion protein과 결합하여 prion 단백질의 발현 조절기능 가능성이 제시됨에 따라 [24] 본 실험에서는 galectin-3의 rat 뇌 조직에서의 발현을 검토하였다. 본 실험에서는 이를 위하여 우선 galectin-3의 발현을 mRNA와 단백질 수준에서 검증하였다. 본 실험에서는 뇌 조직내에 축적되어 있는 galectin-3 의 양이 극히 적어 검출이 어려울 것이 예상되었으므로 미량의 mRNA의 발현의 확인과 발현량의 검증을 위해서 보다 민감도가 높은 RT-PCR을 이용하여 mRNA 의 발현을 확인하였고 Southern blot analysis 를 수행하여 이를 검증하는 방법을 선택하였다.
- 5% stacking gel 을 사용하여 환원 조건하에서 수행되었다. 전기영동이 끝난 gel 싱의 band는 PVDF membrane에 30 V에서 3시간 동안 이동시켰으며, galectin-3 를 확인하기 위해 특이적인 M3/38 hybridoma 세포배양 상청액을 1 차 항체로서 이용하였다 [10]. 2차 항체로서는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rat antibody (Promega Biotec, Adison, WI)를 사용하였고, 3, 3'-diaminutesobenxidine tetrahydrochloride solution으로 상온에서 30초 동안 발색시켰다 [21].
- 주줄 된 RNA를 ethidium bromide가 첨가된 1%의 agarose gel 에 전기 영동하여 분리 한 후 OD260에서 흡광도를 측정 하여 정량하였다. RNA를 다루는 모든 실험에 있어 사용된 증류수와 초자기구들은 diethylpyrocarbonate 를 처리한 후 사용하였다.
대상 데이터
- Ether 처리한 생후 5-6주령의 Sprague-Dawley 종의 수컷 rat의 뇌와 폐조직를 채취하여 homogenizer (M. Zipperer, Germany)로 파쇄한 후, 14, 000 g로 3아분 동안 1차 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 다시 20, 000 g 로 1시간 동안 원심분리 하여 얻은 상청액은 asialofetuin 을 이용한 affinity chromatography로 분획 되었다.
- 같다. 전방의 primer로서 (위치; 415-495) G3F (actgactagtgccctacgatatgccctgcc)를, 후방의 primer로서 (위치; 815-846) G3R (gcccaccccttctggcttaga)을 실험에 사용하였다.
이론/모형
- RT-PCR 산물이 원하던 mRNA 에 의한 것임을 확인하기 위해 Southern blot analysis를 수행하였다. RT-PCR 산물을 2% agarose gel 에 전기 영동한 후, MeOH로 활성화시킨 nylon membrane (Boehringer-Mannheim, Germany) 에 옮기고 UV를 5분간 쬐어 고정하였다.
- 생후 5-6주령의 Sprague-Dawley 종의 수컷 rat의 뇌와 폐 조직에서 RNA를 주줄하기 위해 acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform법을 사용하였다 [6]. 주줄 된 RNA를 ethidium bromide가 첨가된 1%의 agarose gel 에 전기 영동하여 분리 한 후 OD260에서 흡광도를 측정 하여 정량하였다.
- 4 M lactose 와 2 mM DTT 을 함유한 PBS 로 회수하였다. 정제 과정 중의 얻어진 분획 내의 단백질 양은 Lowry법에 따라 정량되었다. 한편, 양성 대조군으로는 E.
- 조직에서 추출한 단백질과 affinity chromatography로 정제한 단백질은 Laemmli 방법에 따라 제조된 sodium dodecyl sulfate (SDS) 12% polyacrylamide gel과 3.5% stacking gel 을 사용하여 환원 조건하에서 수행되었다. 전기영동이 끝난 gel 싱의 band는 PVDF membrane에 30 V에서 3시간 동안 이동시켰으며, galectin-3 를 확인하기 위해 특이적인 M3/38 hybridoma 세포배양 상청액을 1 차 항체로서 이용하였다 [10].
- 한편, 세포에 있어서 발현된 mRNA 가 기능적 단백질로 정상적인 translation 과정을 거치지 않는 경우는 이미 잘 알여져 있는 사실이므로 Western blot analysis를 실시하여 galectin-3 단백질의 발현을 확인하였다. 조직에서 단백질을 추출한 후 전기영동하여 galectin-3 단클론성 항체를 이용하여 검증하였을 때, 양성 대조군으로 사용한 recombinanat galectin-3 와 폐 조직에서 추출한 시료 에서만 galectin-3의 30 kDa 부위에서 발색 반응을 확인할 수 있었다(Fig.
- 한편, 이렇게 얻어진 band가 galectin-3의 mRNA에서 증폭되었는지를 확인하기 위해 cDNA를 특이적으로 인식하는 internal probe 을 이용한 Southern blot analysis를 수행하였다. Fig.
성능/효과
- 한편, 이렇게 얻어진 band가 galectin-3의 mRNA에서 증폭되었는지를 확인하기 위해 cDNA를 특이적으로 인식하는 internal probe 을 이용한 Southern blot analysis를 수행하였다. Fig. 1B 에서 관찰된 바와 같이 증폭된 band는 galectin-3의 mRNA에서 유래되었음이 확인되었고, RT-PCR에 의해 얻어진 결과를 densitometric analysis (Molecular analyst, Bio-Rad, USA) 정량적으로 분석해 보았을 때 뇌 조직 band의 농도는 폐 조직에 비해 8분의 1 정도인 것으로 확인되었다.
- RT-PCR을 이용한 뇌 조직에서의 galectin-3 mRNA 의 발현 정도는 폐 조직에 비해 8분의 1 정도인 것으로 확인되었다. 뇌 조직에서 추출한 단백질을 asialofetuin affinity chromatography로 정제한 후 Western blot analysis를 수행한 결과 폐 조직에서 분리된 단백질에서 검출된 것과 동일한 크기의 galectin-3가 발현되는 것을 확인하였다.
- RT-PCR을 이용한 뇌 조직에서의 galectin-3 mRNA 의 발현 정도는 폐 조직에 비해 8분의 1 정도인 것으로 확인되었다. 뇌 조직에서 추출한 단백질을 asialofetuin affinity chromatography로 정제한 후 Western blot analysis를 수행한 결과 폐 조직에서 분리된 단백질에서 검출된 것과 동일한 크기의 galectin-3가 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 본 연구 결과는 지금까지 중추신경조직에서는 발현되지 않는 것으로 알려진 galectin-3가 뇌조직에서 발현되고 있다는 것을 보여주고 있기에 galectin-3 가 뇌신경세포에서 prion에 결합하는 단백질 중의 하나라는 연구결과를 지지하는 것으로서 앞으로 prion 성 질병 연구에 있어서 galectin-3의 역할 규명이 필요함을 제시하고 있다.
- Galectin-3 에대한 특이 primer 쌍 (G3F과 G3R)으로 cDNA를 증폭시켰을 경우 예상되는 PCR 반응 산물의 크기는 약 430 bp 정도로 예상된다. 본 연구의 결과는 galectin-3 mRNA 의 뇌 조직에서 발현 정도는 폐 조직에 비해 낮아 기존의 방법으로 검출되지 않았던 이전의 결과와 일치한다 [8].
- 조직에서 단백질을 추출한 후 전기영동하여 galectin-3 단클론성 항체를 이용하여 검증하였을 때, 양성 대조군으로 사용한 recombinanat galectin-3 와 폐 조직에서 추출한 시료 에서만 galectin-3의 30 kDa 부위에서 발색 반응을 확인할 수 있었다(Fig. 2A).
- 한편, 조직에서 추출한 단백질을 affinity chromatography 로 정제한 후 Western blot analysis 를 수행한 결과 뇌 조직의 단백질에서도 폐 조직에서 분리된 단백질에서 검출된 것과 일치하는 크기의 band가 발현되는 것이 확인되었다. 이는 galectin-3의 뇌에서의 발현은 비록 기존의 면역화학염색법이나 Western blot 등의 통상적인 방법으로는 검출이 되지 않을 정도로 낮지만, affinity를 이용한 chromatography 와 분자생물학적 방법을 이용함으로서검출할 수 있으며, 또한 생체 내에서 galectin-3는 극소량으로도 생리활성을 나타내고 있음을 시사하고 있다.
후속연구
- 뇌 조직에서 추출한 단백질을 asialofetuin affinity chromatography로 정제한 후 Western blot analysis를 수행한 결과 폐 조직에서 분리된 단백질에서 검출된 것과 동일한 크기의 galectin-3가 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 본 연구 결과는 지금까지 중추신경조직에서는 발현되지 않는 것으로 알려진 galectin-3가 뇌조직에서 발현되고 있다는 것을 보여주고 있기에 galectin-3 가 뇌신경세포에서 prion에 결합하는 단백질 중의 하나라는 연구결과를 지지하는 것으로서 앞으로 prion 성 질병 연구에 있어서 galectin-3의 역할 규명이 필요함을 제시하고 있다.
- 한편, glioma 나 astrocytoma에서 galectin-3가 발현되었다는 보고가 있기 때문에 [9, 26] 본 연구에서의 결과가 brain 신경세포에 의한 것이 아니고 뇌조직 중에 존재하는 macrophage성 세포에 의하여 양성으로 나왔을 가능성도 생각할 수 있지만, 그러한 보고는 종양세포에서 관찰된 것으로서 세포의 종양화 과정에서 galectin-3 의 발현 증가 현상은 이미 잘 알려져 있기에 [16, 30] 정상 뇌 조직을 이루고 있는 다양한 세포에서의 galectin-3 발현에 대한 면밀한 연구는 앞으로 검토해야 될 부분으로 남아 있다.
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