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문제 정의
- 본 연구는 대목용으로 이용되는 박에 있어서 형질전환에 이용 가능한 품종을 선발하고 재분화 효율 및 형질전환 효율을 높이기 위하여 수행되었다. 3 mg/L BA가 첨가된 MS배지에서 덩굴마름병 저항성 순계계통의 평균 신초 형성 수는 0 ~ 7.
- 본 연구에서는 대목용으로 이용되는 박의 형질전환 효율을 높이고 농업적 특성이 우수하여 접목에 이용 가능한 대목용 박 대목 품종인 국립원예특작과학원에서 개발한 덩굴쪼김병 저항성이 있는 순계계통과 상용품종을 이용하여 실험을 수행하였다. 또한 재분화 효율을 증진시킬 수 있는 생장조절제를 선발하고자 하였으며, 선발된 생장조정제를 가지고 형질전환을 통하여 형질전환 효율을 검정하였다.
제안 방법
- pCAMBIA1304 벡터로 형질전환된 절편체는 도입된 세포와 조직에서 GFP와 gus 유전자를 동시에 발현하게 되므로 agrobacterium 접종 6일 후에 분석기기를 이용하여 GFP 발현을 조사하였다. 3 mg/L BA와 2 mg/L zeatin 공동배양 배지에서 공동배양된 절편체 에서 GFP 발현을 확인하였다(Fig. 2). 선발배지에 옮겨서 2주마다 계대배양을 하면서 8주째에 신초발생을 조사하였으나 hygromycin에 치상한 절편체에서는 신초가 발생하지 않았다.
- BA가 첨가된 선발배지에서 분화된 신초는 페트리디쉬 아래면에서 분화되는 것을 확인할 수 있었고 zeatin 선발배지에서 분화된 신초는 신장하여 배지 위로 성장하였다. 6주 후 zeatin이 첨가된 배지에서 분화된 신초는 빠르게 신장하여 발근 배지에서 발근을 유도하였으며 BA가 첨가된 배지에서 분화된 신초는 신장유도 배지로 옮겨져 신초신장을 유도하였다. 8주 후 BA배지와 zeatin 배지에서 각각 분화된 8개와 6개의 절편체에서 분화된 신초의 잎을 gus 염색한 결과 zeatin에서 분화된 1개의 신초에서 gus 염색이 확인되어 안정적으로 유전자 가 도입된 것을 확인할 수 있었다.
- GFP (green fluorescence protein)의 발현을 조사하기 위해 agrobacterium 접종 6일 후에 분석기기(model: Ez capture, Atto)를 이용하여 GFP 발현을 조사하였다. Gus분석은 박 형질전환체의 신초 조직을 gus 침지액(5 mM EDTA, 0.
- 1). pCAMBIA1304 벡터로 형질전환된 절편체는 도입된 세포와 조직에서 GFP와 gus 유전자를 동시에 발현하게 되므로 agrobacterium 접종 6일 후에 분석기기를 이용하여 GFP 발현을 조사하였다. 3 mg/L BA와 2 mg/L zeatin 공동배양 배지에서 공동배양된 절편체 에서 GFP 발현을 확인하였다(Fig.
- 선발배지에 옮겨서 2주마다 계대배양을 하면서 8주째에 신초발생을 조사하였으나 hygromycin에 치상한 절편체에서는 신초가 발생하지 않았다. pCAMBIA2301벡터로 형질전환된 절편체는 도입 세포나 조직에서 gus 유전자만 발현하므로 형질전환한 절편체의 일부를 이용하여 gus 발현을 조사하였다. 한처리 구에서 형질전환한 절편체 중 105개를 gus 용액에 침지한 결과 7개의 절편체의 절단면에서 GUS 발현을 확인할 수 있었다(Table 3, Fig.
- 형질전환에 일반적으로 사용되는 G5 품종의 자엽 절편 체를 이용하여 다양한 재분화 배지에서 신초 형성율을 조사하였다. 각각 3가지 농도의 zeatin 또는 kinetin 배지에 절편체를 치상한 후 신초가 형성된 절편의 숫자를 조사하였다. 4주 후 신초형성 정도를 조사하였을때 3 mg/L BA 처리구에서는 9.
- 또한 BA배지 실험에서 선발된 순계계통 및 시판 품종 박을 2 mg/L zeatin 배지에 2반복으로 치상하여 신초 발생을 비교하였다. 간접 신초 유도를 위한 배지조합을 위하여 1, 3, 5 mg/L의 BA가 첨가된 배지에 2,4-D를 0, 0.1, 0.5, 1 mg/L 를 각각 첨가하여 12조합의 배지를 만든 후 페트리디쉬에 5개씩 치상하고 3반복으로 실험하였다.
- 박 대목용 품종 선발을 위하여 시판 품종 ‘FR-단토스’, ‘동장군’, ‘불로장생’과 덩굴쪼김병 저항 계통의 종자 5종을 MS 기본배지에 BA (6-benzylaminopurine) 3 mg/L를 첨가한 배지에서 3반복하여 검정하였다(Table 1). 또한 BA배지 실험에서 선발된 순계계통 및 시판 품종 박을 2 mg/L zeatin 배지에 2반복으로 치상하여 신초 발생을 비교하였다. 간접 신초 유도를 위한 배지조합을 위하여 1, 3, 5 mg/L의 BA가 첨가된 배지에 2,4-D를 0, 0.
- 본 연구에서는 대목용으로 이용되는 박의 형질전환 효율을 높이고 농업적 특성이 우수하여 접목에 이용 가능한 대목용 박 대목 품종인 국립원예특작과학원에서 개발한 덩굴쪼김병 저항성이 있는 순계계통과 상용품종을 이용하여 실험을 수행하였다. 또한 재분화 효율을 증진시킬 수 있는 생장조절제를 선발하고자 하였으며, 선발된 생장조정제를 가지고 형질전환을 통하여 형질전환 효율을 검정하였다. 형질전환 효율을 높이기 위한 방법으로 캘러스 단계를 통해 신초를 유도할 수 있는 생장조정제 조합을 선발하였다.
- 박 대목용 품종 선발을 위하여 시판 품종 ‘FR-단토스’, ‘동장군’, ‘불로장생’과 덩굴쪼김병 저항 계통의 종자 5종을 MS 기본배지에 BA (6-benzylaminopurine) 3 mg/L를 첨가한 배지에서 3반복하여 검정하였다(Table 1).
- 그러나 zeatin 2 mg/L배지에서 유도된 신초는 줄기 신장유도 단계 없이 신초를 발근 배지에 이식 하는 것이 가능할 정도로 빠르게 신장하였다. 박 대목으로 사용되는 품종을 이용하여 재분화 효율을 검정하고자 순계 6계통과 상용품종 3품종의 재분화 실험을 수행하였다. 6 종류의 덩굴쪼김병 저항성 순계계통 중 3종은 식물체가 재분화 되지않았다.
- 박 재분화 효율을 높이기 위하여 G5 절편체를 MS 기본 배지(MS Powder 4.4 g, 3% sucrose, 0.5 mg/L의 AgNO3, pH 5.8)에 0.5, 2, 5 mg/L 농도의 사이토카이닌의 호르몬인 zeatin과 kinetin을 각각 첨가하여 7조합의 호르몬 배지에서 3반복으로 검정하였다. 박 대목용 품종 선발을 위하여 시판 품종 ‘FR-단토스’, ‘동장군’, ‘불로장생’과 덩굴쪼김병 저항 계통의 종자 5종을 MS 기본배지에 BA (6-benzylaminopurine) 3 mg/L를 첨가한 배지에서 3반복하여 검정하였다(Table 1).
- 재분화 실험에서 선발 된 zeatin 재분화 배지를 이용하여 박의 형질전환 효율을 검정하기 위하여 hygromycin과 kanamycin으로 선발되는 두 벡터 pCAMBIA1304과 pCAMBIA2301이 도입된 아그로박테리아를 이용하여 형질전환을 수행하였다(Fig. 1). pCAMBIA1304 벡터로 형질전환된 절편체는 도입된 세포와 조직에서 GFP와 gus 유전자를 동시에 발현하게 되므로 agrobacterium 접종 6일 후에 분석기기를 이용하여 GFP 발현을 조사하였다.
- 파종 후 4일 된 자엽을 3등분 횡절단 하여 절편체를 캘러스 형성에 사용하였다. 절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 페트리디쉬(SPL, South Korea)에 5개씩 치상하고 3 반복으로 하여 신초 수를 조사하였다.
- 파종 후 4일 된 자엽 절편체를 운반체가 도입된 아그로 박테리움(GV3101)에 침지한 한 후 3 mg/L BA와 2 mg/L zeatin이 첨가된 MS배지에서 공동 배양한 후 기본배지 250mg/L의 cefatoxime이 공통적으로 포함된 배지에 3 mg/L BA와 10 mg/L hygromycin, 2 mg/L zeatin과 10 mg/L hygromycin, 3 mg/L BA와 50 mg/L kanamycin과 2 mg/L zeatin과 50mg/L kanamycin이 첨가된 배지에서 선발하였다. 신초가 분화되면 신초를 분리하여 호르몬이 없는 신장유도 배지(MS Powder 4.
- 또한 재분화 효율을 증진시킬 수 있는 생장조절제를 선발하고자 하였으며, 선발된 생장조정제를 가지고 형질전환을 통하여 형질전환 효율을 검정하였다. 형질전환 효율을 높이기 위한 방법으로 캘러스 단계를 통해 신초를 유도할 수 있는 생장조정제 조합을 선발하였다.
- 형질전환에 일반적으로 사용되는 G5 품종의 자엽 절편 체를 이용하여 다양한 재분화 배지에서 신초 형성율을 조사하였다. 각각 3가지 농도의 zeatin 또는 kinetin 배지에 절편체를 치상한 후 신초가 형성된 절편의 숫자를 조사하였다.
대상 데이터
- 종자는 칼날을 이용하여 종피를 제거하였고 70% 에탄올에 1분 30%락스에 20분 소독한 후 멸균수를 이용하여 5회 세척한 후 멸균한 필터 페이퍼 위에서 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 종자를 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에 3%의 sucrose와 0.8 g의 agar를 첨가하여 장일인광 조건에서 발아를 유도하였으며 유근이 출연된 자엽을 절편체로 이용하였다. 파종 후 4일 된 자엽을 3등분 횡절단 하여 절편체를 캘러스 형성에 사용하였다.
- 실험재료는 국립원예특작과학원에서 육성한 덩굴쪼김병저항성 순계계통 5종(‘3381’, ‘3385’, ‘747’, ‘756’, ‘789’) 및 시판품종 3종(‘FR-단토스’, ‘동장군’, ‘불로장생’)이 사용되었으며 대조구로 린네계통의 G5가 사용되었다.
성능/효과
- 3). 2주마다 계대 배양하면서 신초 발생을 조사한 결과 4주부터 절단면에서 신초가 활발하게 분화되기 시작하였다. BA가 첨가된 선발배지에서 분화된 신초는 페트리디쉬 아래면에서 분화되는 것을 확인할 수 있었고 zeatin 선발배지에서 분화된 신초는 신장하여 배지 위로 성장하였다.
- 본 연구는 대목용으로 이용되는 박에 있어서 형질전환에 이용 가능한 품종을 선발하고 재분화 효율 및 형질전환 효율을 높이기 위하여 수행되었다. 3 mg/L BA가 첨가된 MS배지에서 덩굴마름병 저항성 순계계통의 평균 신초 형성 수는 0 ~ 7.3개였으며 3종류의 상용 품종의 신초형성 수는 2.0 ~ 6.5개였다. 덩굴마름병 저항성 순계 계통의 재분화율은 품종 간 편차가 상용품종에 비하여 컸다.
- 각각 3가지 농도의 zeatin 또는 kinetin 배지에 절편체를 치상한 후 신초가 형성된 절편의 숫자를 조사하였다. 4주 후 신초형성 정도를 조사하였을때 3 mg/L BA 처리구에서는 9.5개의 신초가 분화되었으며 zeatin 처리 구에서는 농도에 따라 0.5 ~ 9.5개의 신초가 분화되었고 kinetin 처리구에서는 신초분화 없이 뿌리만 분화하였다(Table 1). 이 결과는 신초의 재분화 효율이 호르몬의 농도와 종류에 따라서도 영향을 받는다는 오이의 연구결과와 일치한다(Jang et al.
- 6주 후 zeatin이 첨가된 배지에서 분화된 신초는 빠르게 신장하여 발근 배지에서 발근을 유도하였으며 BA가 첨가된 배지에서 분화된 신초는 신장유도 배지로 옮겨져 신초신장을 유도하였다. 8주 후 BA배지와 zeatin 배지에서 각각 분화된 8개와 6개의 절편체에서 분화된 신초의 잎을 gus 염색한 결과 zeatin에서 분화된 1개의 신초에서 gus 염색이 확인되어 안정적으로 유전자 가 도입된 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 볼 때 박 대목의 형질전환에서 재분화 배지에 2 mg/L zeatin을 첨가하는 것이 형질전환체를 획득하는 시간을 단축시킬 수 있었다.
- 박 대목의 경우 뿌리와 배축 조직을 이용하여 사이토카이닌과 옥신을 이용하여 재분화를 시도하였지만 캘러스가 발생되지 않았다(데이터 미제시). BA와 2.4-D를 혼용처리한 배지에서 자엽의 절단부위에서 신초가 발생하였으며 4주 후 BA를 단독으로 1 mg/L 처리한 배지에서 발생한 신초 수는 14.5개로 대조 구(9.5개)에 비하여 높았으며 한 개의 절편체에서 발생하는 신초의 수 및 신장도 매우 양호하였다(Table 4). 옥신류 생장조절제인 2,4-D를 BA와 혼용했을때 신초발생은 신초가 발생하지 않거나 1개로 더 낮아졌다.
- Zeatin을 첨가한 재분화 배지에서 대조 구인 G5품종은 신초형성 수가 증가하지 않았지만 신초형성 정도는 3.5 ~ 9개로 ‘불로장생’을 제외하고 4개 품종의 신초형성 수가 증가하였다(Table 2).
- 5 ~ 9개로 ‘불로장생’을 제외하고 4개 품종의 신초형성 수가 증가하였다(Table 2). Zeatin이 포함된 배지에서 재분화된 순계 및 시판품종에서 유래한 신초는 4주 후 발근배지 이식이 가능할 정도로 신장하였고 발근 배지에서 정상적으로 뿌리가 유도되었다.
- Zeatin 2 mg/L가 첨가된 배지의 신초 수는 기본배지(BA 3 mg/L)와 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 zeatin 2 mg/L배지에서 유도된 신초는 줄기 신장유도 단계 없이 신초를 발근 배지에 이식 하는 것이 가능할 정도로 빠르게 신장하였다. 박 대목으로 사용되는 품종을 이용하여 재분화 효율을 검정하고자 순계 6계통과 상용품종 3품종의 재분화 실험을 수행하였다.
- 5개의 절편체에서 신초가 분화되어 높은 재분화 효율을 보였다. 덩굴쪼 김병 저항성 순계 계통의 재분화 효율은 G5보다 낮았지만 시판 품종 보다는 높은 효율을 보였다. Zeatin을 첨가한 재분화 배지에서 대조 구인 G5품종은 신초형성 수가 증가하지 않았지만 신초형성 정도는 3.
- 순계계통 중에서는 ‘747’과 ‘756’이 각각 9개와 6.5개의 절편체에서 신초가 분화되어 가장 높은 효율을 보였으며 시판 품종에서는 ‘불로장생’과 ‘동장군’이 각각 6.5개와 5.5개의 절편체에서 신초가 분화되어 높은 재분화 효율을 보였다.
- 형질전환 효율을 검정하기 위해 GFP와 gus발현을 조사한 결과 공동배양 과정 중에 GFP가 67%와 100% 로 높은 일시적인 발현을 보였다. 식물체 재분화는 BA와 2.4-D를 조합한 배지조합에서 자엽의 절단부위에서 신초가 발생하였으며, 4주 후 BA를 단독으로 1 mg/L 처리한 배지에서 한 개의 절편체에서 발생하는 신초의 개수 및 신초의 신장도 좋았다. 캘러스의 발생은 1 mg/L BA와 2,4-D를 0.
- 8주 후 BA배지와 zeatin 배지에서 각각 분화된 8개와 6개의 절편체에서 분화된 신초의 잎을 gus 염색한 결과 zeatin에서 분화된 1개의 신초에서 gus 염색이 확인되어 안정적으로 유전자 가 도입된 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 볼 때 박 대목의 형질전환에서 재분화 배지에 2 mg/L zeatin을 첨가하는 것이 형질전환체를 획득하는 시간을 단축시킬 수 있었다.
- 사이토카이닌과 옥신을 혼합하여 처리했을 때 옥신이 신초형성을 억제하는 결과는 수박의 결과와 일치한다(Comptom and Gray 1993). 캘러스의 발생은 신초의 발생이 좋았던 1 mg/L BA 조건에 2,4-D를 0.1 mg/L 첨가한 배지에서 가장 활발하게 분화하였으며 1 mg/L BA 및 3 mg/L BA 조건에 2,4-D를 0.1 mg/L 첨가한 조합에서 분화된 캘러스를 2주마다 계대배양 하면서 신초 발생을 조사한 결과 13주 후에 신초로 분화하여 박에서 캘러스 과정을 통한 간접적 신초발생 가능성을 보여주었다(Fig. 4).
- pCAMBIA2301벡터로 형질전환된 절편체는 도입 세포나 조직에서 gus 유전자만 발현하므로 형질전환한 절편체의 일부를 이용하여 gus 발현을 조사하였다. 한처리 구에서 형질전환한 절편체 중 105개를 gus 용액에 침지한 결과 7개의 절편체의 절단면에서 GUS 발현을 확인할 수 있었다(Table 3, Fig. 3). 2주마다 계대 배양하면서 신초 발생을 조사한 결과 4주부터 절단면에서 신초가 활발하게 분화되기 시작하였다.
- 덩굴마름병 저항성 순계 계통의 재분화율은 품종 간 편차가 상용품종에 비하여 컸다. 형질전환 효율을 검정하기 위해 GFP와 gus발현을 조사한 결과 공동배양 과정 중에 GFP가 67%와 100% 로 높은 일시적인 발현을 보였다. 식물체 재분화는 BA와 2.
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