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문제 정의
- 따라서 본 연구는 환경 및 온도에 민감하여 증식이 용이하지 않은 홍경천의 캘러스 최적 배양 조건 및 중국산 뿌리와 유도 배양된 캘러스에서 생리활성물질인 salidroside의 생산여부를 확인하였다.
- 8%)에 비해서는 낮은 값이다. 따라서, 본 연구의 결과를 토대로 추후 배양 환경의 적절한 조절로 salidroside의 함량 및 생산성의 개선을 이루고자 한다.
- 본 실험은 기내 배양된 홍경천으로부터 캘러스를 유도하고 가장 잘 자라는 생장조건을 찾기 위해 수행되었다. 실험 결과를 종합해 보면 캘러스의 증식을 위한 배양조건은 최적 배지를 조사한 결과, 2B5배지에서 생장율이 가장 좋았으며, 탄소원으로는 sucrose를 3%로 첨가했을 때 생장율이 가장 높았다.
- 식물은 종에 따라 탄소원의 종류 및 이용률이 다르게 나타나기 때문에 본 실험에서는 적정 탄소원 및 적정농도의 규명을 위하여 서로 다른 탄소원에서 캘러스의 생장율을 조사하였다. 배지에 첨가되는 탄소원으로는 조직배양시 가장 널리쓰이는 sucrose와 glucose, fructose, sorbitol를 생장조절제 (BA 1 ㎎/L, NAA 05 ㎎/L)가 처리된 2B5배지에 각각 3%로 사용하였다.
제안 방법
- v/v/v)를 사용하여 전개시켰다. 10% sulfuric acid를 분무하여 가열 발색시켜 salidroside의 함유 여부를 확인하였다. HPLC 분석은 Waters (Water Co.
- 기내에서 무균배양 중인 유식물체의 줄기와 잎을 절취하여MS 및 1/2MS배지에 2, 4-D와 NAA를 각각 0.1, 0.5, 1, 2 ㎎/L 를 BA를 0.1, 0.5, 1, 2 ㎎/L를 각각 혼합한 16종의 배지(Table 1)에 치상하여 온도 25±1℃ 암조건에서 배양 후 캘러스의 유도율을 조사하였다. 그 결과 1/2MS 기본배지에 NAA 0.
- 유식물체의 뿌리와 현탁배양세포를 동결건조후 건조시료 1 g을 methanol (MeOH) 2-3 mL로 추출하여 감압농축 하였다. 농축된 시료를 H2O와 CH2CI2 (1:1) 혼합한 후 분리된 수층에 ethyl acetate (EtOAc)를 1:1의 비율로 혼합한 후 EtOAc층만 분리하여 rotary evaporator로 농축시켰다. 농축된 시료를 MeOH 0.
- 1997). 따라서 본 실험에서는 캘러스의 생장에 가장 적합한 배지를 선정하기 위하여 같은 농도의 호르몬이 처리된 (BA 1 ㎎/L,NAA 0.5 ㎎/L) 1/4MS, 1/2MS, MS, 1/2WPM, WPM, 2WPM, 3WPM, 1/4B5, 1/2B5, B5, 2B5, 3B5 배지 (sucrose 3%)에 3주간배양한 캘러스의 생장율을 조사한 결과, MS와 WPM 배지류 (데이터 미제시)에 비교하여 2B5배지가 다른 배지에 비하여 생장율이 월등이 높았으므로 2B5배지를 최적배지로 선택하였다 (Figure 1).
- Bor)은농촌진흥청 작물과학원 특용작물과로부터 종자를 분양 받아70% ethanol (v/v)로 3분간, 5% sodium hypochiarite (v/v)로 6분간 각각 표면살균 후, 멸균수로 3회 세척하였다. 무균발아에 사용한 배지는 생장조절제가 들어 있지 않는 MS 기본배지에0.8% agar (w/v), 3% sucrose (w/v)를 첨가하였고 pH는 5.7-5.8 사이로 조정하였다. 배양조건은 25±1℃에서 광도 50 m-2s-1 16/8시간의 광주기하에서 발아시켰다.
- 5, 1,2 ㎎/L를, BA를 각각 혼합한 16종의 배지를 조제하였고 1/2MS배지에 똑같은 농도의 2, 4-D와 NAA를 BA와 각각 혼합한 16종의 배지를 조제한 후 줄기와 잎을 치상하였다. 배지의 멸균은 3% sucrose와 0.8% agar를 첨가한 후 pH를 5.7~5.8사이로 조절한 뒤 멸균한 후 petri dish (87×15 ㎜)에 30 mL씩 분주하여 사용하였다. 실험재료의 치상이 끝난 petri dish는 밀봉하여 25℃ 에서 암배 양하였으며, 배양 3주째에 캘러스 형성율을 조사하고, 유도된 캘러스를 식물체 절편으로부터 분리하여 동일 조성의 새로운 배지에 배양하였다.
- 생장율이 양호한 배지를 기준으로 하여 질소원인 NH4+NO3-의 비율 및 인산의 농도, 탄소원의 종류 및 농도, 화학적인 요인과 광조건 (50 µmolm-1s-1), pH, 암조건과 같은 물리적 변화가 캘러스 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 조사방법은 100 mL의 삼각플라스크에 30mL 배지를 넣고 각각의 플라스크에 캘러스를 0.
- 8사이로 조절한 뒤 멸균한 후 petri dish (87×15 ㎜)에 30 mL씩 분주하여 사용하였다. 실험재료의 치상이 끝난 petri dish는 밀봉하여 25℃ 에서 암배 양하였으며, 배양 3주째에 캘러스 형성율을 조사하고, 유도된 캘러스를 식물체 절편으로부터 분리하여 동일 조성의 새로운 배지에 배양하였다.
- 유도된 캘러스의 다량증식용 액체배지에서의 배양에 적합한 생장조절제의 농도를 규명하기 위해 0.5~ 1 ㎎/L의 BA와 0.1 ~ 1 ㎎/LNAA가 첨가된 1/2MS 기본액체배지 (3% sucrose, pH 5.7)에 배양하였고, MS, WPM, B5 등의 배지를 이용하여 적정배지를 규명하였다.
- 유도된 캘러스의 대량증식을 위해 고체배지에서 탈분화되어 발생한 캘러스를 NAA 0.5㎎/L와 BA 1 ㎎/L 첨가된 1/2MS기본배지에서 현탁배양을 실시하였다. 고체배지에서 생장 중인 캘러스는 노랑 색의 덩어리진 모양으로 활발하게 증식되었으나, 캘러스들이 갈변되며 생장율도 좋지 않았다.
- 캘러스 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 조사방법은 100 mL의 삼각플라스크에 30mL 배지를 넣고 각각의 플라스크에 캘러스를 0.2 g (fresh wt)를 접종하여 회전교반기에서 100 rpm으로 3주간 진탕배양 후 수확하여 증류수로 세척 후, 흡습지에 습기를 제거하고 생체량을 측정하고, 동결건조기에 동결건조하여 건중량을 측정하였다. 모든 실험구의 pH는 5.
- 배양하였다. 캘러스 유도는 MS배지에 2, 4-D와 NAA를 각각 0.1, 0.5, 1,2 ㎎/L와, 0.1, 0.5, 1,2 ㎎/L를, BA를 각각 혼합한 16종의 배지를 조제하였고 1/2MS배지에 똑같은 농도의 2, 4-D와 NAA를 BA와 각각 혼합한 16종의 배지를 조제한 후 줄기와 잎을 치상하였다. 배지의 멸균은 3% sucrose와 0.
대상 데이터
- 10% sulfuric acid를 분무하여 가열 발색시켜 salidroside의 함유 여부를 확인하였다. HPLC 분석은 Waters (Water Co., U.S.A)를 이용하였으며, 컬럼은 µ-Bondapak C18을, 이동상으로는 20% MeOH을 사용하였다. 시료 5 µL 주입 후 1 mL/min의 속도로 214 ㎚에서의 자외선 흡광도로 검출하였다.
- 시료 5 µL 주입 후 1 mL/min의 속도로 214 ㎚에서의 자외선 흡광도로 검출하였다. TLC와 HPLC의 분석에 이용한 salidroside 표품은 Linch 등 (2000)의 방법에 의하여 홍경천 뿌리에서 분리한 후 NMR, IR 등으로 동정한 다음 본 실험에 이용하였다 (현재 투고중).
- 기내에서 무균배양 중인 식물체의 줄기와 잎을 절취하여 캘러스 유도배지에 치상하여 25±1℃ 암조건에서 배양하였다. 캘러스 유도는 MS배지에 2, 4-D와 NAA를 각각 0.
- 배지에 첨가되는 탄소원으로는 조직배양시 가장 널리쓰이는 sucrose와 glucose, fructose, sorbitol를 생장조절제 (BA 1 ㎎/L, NAA 05 ㎎/L)가 처리된 2B5배지에 각각 3%로 사용하였다. 그 결과 sucrose가 다른 탄소원에 비하여 월등히 높은 생장을 보였으며 sorbitol 이 첨가된 처리구에서는 세포의 생장이 거의 이루어지지 않았다 (데이터 미제시).
- 본 연구에 사용된 홍경천 (Rhodiola sachalinensis A. Bor)은농촌진흥청 작물과학원 특용작물과로부터 종자를 분양 받아70% ethanol (v/v)로 3분간, 5% sodium hypochiarite (v/v)로 6분간 각각 표면살균 후, 멸균수로 3회 세척하였다. 무균발아에 사용한 배지는 생장조절제가 들어 있지 않는 MS 기본배지에0.
이론/모형
- Salidroside의 추출 및 분리 과정은 Wenzhe 등 (2001)의 방법에 의하였다. 유식물체의 뿌리와 현탁배양세포를 동결건조후 건조시료 1 g을 methanol (MeOH) 2-3 mL로 추출하여 감압농축 하였다.
성능/효과
- 17%으로 나타났으며. 5% sucrose 처리구에서 0.41%의 생산성을 보여, 자연산 홍경천의 뿌리에 비하여 캘러스에서 salidroside의 함량이 높은 것으로 나타났다.
- 광조건 (50 µM m-2s-1), 암조건 및 pH등 물리적인 요소가 생장율에 미치는 영향을 보기 위하여 광배양과 암배양을 실시한 결과 암배양에서 생장율이 좋았다 (Figure 5). 캘러스의 생장에 미치는 pH의 영향은 pH5~6에서 최대생장을 나타냈으며 pH 4.
- 5, 1, 2 ㎎/L를 각각 혼합한 16종의 배지(Table 1)에 치상하여 온도 25±1℃ 암조건에서 배양 후 캘러스의 유도율을 조사하였다. 그 결과 1/2MS 기본배지에 NAA 0.5 ㎎/L와 BA 1 ㎎/L로 조성된 배지에서 캘러스 유도율이 높았다. 그러나 2, 4-D와 BA를 혼합한 1/2MS 기본배지 조건에서는 2, 4-D 0.
- 배지에 첨가되는 탄소원으로는 조직배양시 가장 널리쓰이는 sucrose와 glucose, fructose, sorbitol를 생장조절제 (BA 1 ㎎/L, NAA 05 ㎎/L)가 처리된 2B5배지에 각각 3%로 사용하였다. 그 결과 sucrose가 다른 탄소원에 비하여 월등히 높은 생장을 보였으며 sorbitol 이 첨가된 처리구에서는 세포의 생장이 거의 이루어지지 않았다 (데이터 미제시). 조사된 탄소원 중 sucrose에서 가장 높은 생장을 보여 2B5 배지에 sucrose 농도를 1 ~5%까지 변화시켜 배양한 결과 3%의 농도로 첨가했을 때 가장 높은 생장율을 보였으며 농도가 높아짐에 따라 생장율이 낮아지는 것으로 나타났다 (Figure 2).
- 암배양과 광배양을 비교했을 때 암배양의 경우가 생장율이 높았으며, pH 6에서 세포의 생장율이 가장 좋은 조건임을 확인되었다. 기내에서 배양된 캘러스와 자연산 뿌리는 TLC로 분석하여 salidroside를 확인하였으며, HPLC로 salidroside를 정량한 결과, 자연상태 홍경천의 뿌리는 건중량 당 0.17%으로 나타났으며. 5% sucrose 처리구에서 0.
- (Choi and Soh 1997). 생장율이 가장 좋은 B5배지의 질소원의 농도를 기준으로 하여 NH4+/NO3-의 비율을 달리하여 배양한 결과, NO3-는 B5 배지 농도보다 2배 높은 49.6 mM (2X), NH4+는 B5 배지 농도보다 2배 높은 2.0mM(2Y)가 첨가되었을 때 캘러스의 생장이 가장 좋았으며, NH4+ 단독처리구에서는 생장이 감소되었으나,현저한 차이는 나타나지 않았다 (Figure 3).
- 본 실험은 기내 배양된 홍경천으로부터 캘러스를 유도하고 가장 잘 자라는 생장조건을 찾기 위해 수행되었다. 실험 결과를 종합해 보면 캘러스의 증식을 위한 배양조건은 최적 배지를 조사한 결과, 2B5배지에서 생장율이 가장 좋았으며, 탄소원으로는 sucrose를 3%로 첨가했을 때 생장율이 가장 높았다. 질소원으로써는 49.
- 16 mM에서 높은 생장율을 보였다. 암배양과 광배양을 비교했을 때 암배양의 경우가 생장율이 높았으며, pH 6에서 세포의 생장율이 가장 좋은 조건임을 확인되었다. 기내에서 배양된 캘러스와 자연산 뿌리는 TLC로 분석하여 salidroside를 확인하였으며, HPLC로 salidroside를 정량한 결과, 자연상태 홍경천의 뿌리는 건중량 당 0.
- 5 ㎎/L와 BA 1 ㎎/L 첨가된 2B5배지에서 현탁배양을 실시한 결과 현탁배양 초기에는 캘러스의 생장율이 좋지 않았지만 계속적으로 계대배양을 실시하면 노랑 색의 세포들이 재생성 되면서 생장율도 회복되었다. 이렇게 얻어진 현탁 세포의 생장조건을 규명하기 위해 0.5~1 ㎎/L의 BA와 0.1-1 ㎎/L NAA가 첨가된 2B5 액체배지(3% sucrose, pH5.7)에 3주간 배양조사한 결과, 캘러스 유기시와 같은 처리구에서 생장역시 가장 좋았다.
- 자연산 홍경천의 뿌리와 기내에서 배양된 캘러스로부터 추출한 추출물을 µ-Bondapak C18컬럼을 사용하여 salidroside의 함량을 정량한 결과, 자연산 홍경천 뿌리에서 0.17% (dry wt)인데 비해, 현탁배양세포에서는 0.41% (dry wt)로 자연산 홍경천의 뿌리에 비하여 현탁배양세포에서 salidroside의 함량이 높은 것으로 나타났다 (Figure 7). 한편 캘러스의 최대생장을 보인 pH 6과 암조건에서 의 함량이 더 높게 나타났다 (데이터 미 제시).
- 그 결과 sucrose가 다른 탄소원에 비하여 월등히 높은 생장을 보였으며 sorbitol 이 첨가된 처리구에서는 세포의 생장이 거의 이루어지지 않았다 (데이터 미제시). 조사된 탄소원 중 sucrose에서 가장 높은 생장을 보여 2B5 배지에 sucrose 농도를 1 ~5%까지 변화시켜 배양한 결과 3%의 농도로 첨가했을 때 가장 높은 생장율을 보였으며 농도가 높아짐에 따라 생장율이 낮아지는 것으로 나타났다 (Figure 2). 일반적으로 세포배양에 있어서 배지 내 탄소원의 농도가 2~4% 경우 삼투압의 유지 및 배양세포의 최적 성장에 적절한 것으로 보고되어지고 있다.
- 실험 결과를 종합해 보면 캘러스의 증식을 위한 배양조건은 최적 배지를 조사한 결과, 2B5배지에서 생장율이 가장 좋았으며, 탄소원으로는 sucrose를 3%로 첨가했을 때 생장율이 가장 높았다. 질소원으로써는 49.6 mM KNO3와 2.0 mM (NH4)2SO4를 첨가했을 때 생장율이 가장 좋았으며, 인산의 농도는 2.16 mM에서 높은 생장율을 보였다. 암배양과 광배양을 비교했을 때 암배양의 경우가 생장율이 높았으며, pH 6에서 세포의 생장율이 가장 좋은 조건임을 확인되었다.
- 1 ㎎/L 와 BA 1 ㎎/L 에서 캘러스가 형성되었지만 갈변화 되어 생장하지 못했다. 한편 캘러스 유도에 대한 생장조절제의 영향은 옥신 (IBA, IAA, NAA)류의 단독 첨가구에서는 캘러스의 유도율이 저조한 반면 상대적으로 부정근의 발생율이 높게 나타났다.
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