선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 방사선 조사에 의한 염색체 손상정도를 측정하기 위하여 시행하였다. Chinese Hamster Ovary(CHO) cell에 시료를 처리하여 3시간 배양한 후 fflCo- / 선을 100 cGy/min의 선량율로 200 cGy 조사하였다.
- 외 에서 아직 나오지 않고 있다. 이에 본 연구에서 인진쑥의 방사선 장해경감 효과를 살펴보고자 방사선에 의한 DNA 손상 방호효과를 마우스 림프구에서 단세포전기 영동법 (single-cell gel electrophoresis, SCGE; comet assay)과 Chinese hamster ovary(CHO) 세포에서 미소핵 형성시 험 (micronuclei formation test) 그리고 마우스의 간고]■ 흉선 조직 DNA에 서 8~hydroxy-2, -deoxyguanosine (8 OHdG)의 형성정도를 관찰하였다.
제안 방법
- 각 실험군당 5마리의 마우스를 공시하였으며 방사선은 叱。- / 선을 100 cGy/min의 선량율로 800 cGy를 1회 전신 조사하였다. 시료는 방사선 조사 36시간, 12시간 전에 복강내 로 2회 주사하였다.
- 방사선 조사 2일 후 마우스를 희생시켜 간 및 융선을 적출하여 genomic DNA purification kit(Pro- mega, Madison, USA)을 이용해 DNA를 추출하였다. 50~ 100 Jig의 DNA를 40 mM sodium acetate(pH 5.0)에 녹여 1 Unit의 nuclease Pl을 처리한 후 37°C에서 30분간 배양하 여 nucleotide monophosphate 형태로 만들고, 1 M Tris-HCl (pH 8.5) 10 UL와 1 Unit의 alkaline phosphatase를 처리한 후 37°C에서 1시간 배양하여 nucleoside 형태로 만들었다. 이 nucleoside mixture를 electrochemical detector(ECD), UV spectrophotometeric dectector(UVD) 및 reverse phase C18 HPLC column (5 Um, 250 x 4.
- 염색 및 관찰 : 슬라이드를 건조시킨 후 60 虬의 ethidium bromide(20 Ug/mL)로 염색하였다. CCD 카메라가 부착된 형광현미경(Leica, Germany)를 사용하여 515 — 560 nm의 excitation filter와 590 nm의 barrier filter에서 대물렌즈 40 배의 배율로 관찰하였다. 세포의 DNA 손상정도를 이미지분 석 프로그램 (Komet 4.
- 방사선 조사에 의한 염색체 손상정도를 측정하기 위하여 시행하였다. Chinese Hamster Ovary(CHO) cell에 시료를 처리하여 3시간 배양한 후 fflCo- / 선을 100 cGy/min의 선량율로 200 cGy 조사하였다.
- , Korea)를 이용하여.검경용 slide표본을 만들고 건조 후 Gie msa 염색을 하였다.
- 마우스를 경추탈골로 희생시킨 다음 비장을 무균적으로 적출하여 분리한 마우스 비장림프구를 96-well flat-bot tomed microplate(Corning Co., New York, USA)의 각 well 에 1 x IO*5개씩 분주하고, 시료를 각 농도별로 첨가한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후 well 당 10 11L의 MTT(5.
- 시료는 방사선 조사 36시간, 12시간 전에 복강내 로 2회 주사하였다. 방사선 조사 2일 후 마우스를 희생시켜 간 및 융선을 적출하여 genomic DNA purification kit(Pro- mega, Madison, USA)을 이용해 DNA를 추출하였다. 50~ 100 Jig의 DNA를 40 mM sodium acetate(pH 5.
- 방사선에 의한 DNA 손상에 따른 염색체 절단에 대한 인진쑥 추출물의 방어효과를 살펴보기 위하여, 인진쑥 추출물을 첨가한 배양액 에서 CHO 세포를 배양하고 방사선을 조사한 다음 세포분열중에 형성된 소핵을 관찰하였다.
- 방사선에 의한 산화적 DNA 손상의 주요 지표중의 하나 인 8 OHdG의 형성에 대한 인진쑥 추출물의 억제효과를 살펴보기 위하여, 인진쑥 추출물을 투여한 마우스를 방사선 조사한 후 간과 흉선에서 8- OHdG 형성 정도를 관찰하였다. 간에서 측정한 8-OHdG 형성 정도는 105 dG 당 15.
- 방사선에 의한 산화적 손상에 대한 인진쑥의 DNA 방어효 과를 확인하기 위하여 마우스 림프구에서 단세포전기 영동법과 CHO 세포에서 미소핵 형성 시험 그리고 마우스의 간과 흉선 조직의 DNA에서 8-OHdG의 형성정도를 관찰하였다. 그 결과 단세포전기영동법 및 미소핵 형성 시험에서는 50 Ug/mL의 농도에서 가장 높은 DNA 손상 억제 효과를 나타내었 으며, 8-OHdG 형성 시험 에 서 는 간과 흉선 모두 30 mg/kg 농도 투여 마우스에서 높은 방어효과를 관찰할 수 있었다.
- , New York, USA)의 각 well 에 1 x IO*5개씩 분주하고, 시료를 각 농도별로 첨가한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후 well 당 10 11L의 MTT(5.0 mg/mL)를 가하여 4시 간 더 배양한 후 형성 된 formazan 염을 0.07 N HC1 이 함유된 isopropanol로 완전히 용해시켜, microplate reader(Emax, Molecular Devices, USA)로 560 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포생존율 을 계산하였다.
- 마우스의 말초혈액을 채취하여 Ficoll-Histopaque gra dient 방법(23)으로 림프구를 분리하고 H珥SS로 2회 수세 후 완전배지 에 부유시켰다. 분리된 림프구는 시료처리 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 3시간 배양한 다음 한국원자력연구소 저준위 조사실에서 2()0 cGy의 7 -ray를 100 cGy/min의 선량율로 1회 조사하였다. 시료처리 및 방사선 조사된 림프구는 방사선 조사 후 DNA 수복을 차단하기 위하여 전기영동을 시행하기 전까지 4°C로 유지하였다.
- 세포독성을 나타내지 않는 시료의 농도 범위를 알아보기 위하여 마우스 비장세포에서 3 -(4, 5-dimethyIthiazol-zy 1)- 2, 5 diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) assay를 수행하 였다.
- 세포독성을 나타내지 않는 시료의 농도 범위를 정하기 위하여 마우스 비장 림프구에 인진쑥 추출물을 4, 20, 100, 200, 500 Hg/mL의 농도로 처리 하여 배양한 후 MTT assay를 수행 하였다. 4, 20, 100 Ug/mL의 처리 농도에서 각각 101, 100, 99%의 생존율을 나타내어 세포독성을 보이지 않았으나 200, 500 Rg/mL의 처리 농도에서 는 63, 40%의 생존율로 세포 독성 을 나타내 었다(Fig.
- CCD 카메라가 부착된 형광현미경(Leica, Germany)를 사용하여 515 — 560 nm의 excitation filter와 590 nm의 barrier filter에서 대물렌즈 40 배의 배율로 관찰하였다. 세포의 DNA 손상정도를 이미지분 석 프로그램 (Komet 4.0, Kinetic Imaging Ltd., Great Brit- ain)을 통해 60개의 세포를 무작위로 선택하여 분석하였다. DNA 손상정도는 tail 길이와 tail내 DNA 파편(fragment)을 수치화시 킨 tail moment(TM)로 나타내었으며, TM 값이 증가할수록 DNA가 손상을 많이 받은 것을 의미한다.
- 소핵의 검경 : 소핵은 유침하에서 1, 000배 배율의 현미경으로 기존의 검경 기준(24)을 적용하여 binucleated cell 1, 000 개당 소핵 형성 세포를 계수하였다. 간단히 기술하면, 소핵 은 주핵 에 서 분리된 구형으로 지름이 주핵의 50% 이 하이 며 세포질 내에 존재하여야 하고 빛의 반사와 같은 형상이 없고 염색성이 주핵에 비하여 진하지 않은 것을 소핵으로 판정하 였다.
- 각 실험군당 5마리의 마우스를 공시하였으며 방사선은 叱。- / 선을 100 cGy/min의 선량율로 800 cGy를 1회 전신 조사하였다. 시료는 방사선 조사 36시간, 12시간 전에 복강내 로 2회 주사하였다. 방사선 조사 2일 후 마우스를 희생시켜 간 및 융선을 적출하여 genomic DNA purification kit(Pro- mega, Madison, USA)을 이용해 DNA를 추출하였다.
- 5) 10 UL와 1 Unit의 alkaline phosphatase를 처리한 후 37°C에서 1시간 배양하여 nucleoside 형태로 만들었다. 이 nucleoside mixture를 electrochemical detector(ECD), UV spectrophotometeric dectector(UVD) 및 reverse phase C18 HPLC column (5 Um, 250 x 4.6 mm column; Shiseido Co., Tokyo, Japan)0] 부착된 HPLC에 주입하여 deoxyguanosine 은 UVD로 8-OHdG는 ECD로 검출하였다. 표준 8-OHdG 및 dG를 standard로 사용하여 각 물질을 정량하였고 8-OHdG의 함량은 정상 dG IO, 개당의 8-OHdG 개수로 환산하여 표시하였다.
- 3)를 붓고 20분간 정치시켜 DNA의 양가닥이 풀리게 한 다음 25 V, 300 mA에서 20분간 전기 영동을 시행 하였다. 이상의 모든 과정은 추가적인 DNA 손상을 막기 위해 어두운 조명 상태에서 수행하였다. 고알칼리 상태를 중화시 키기 위해 Tris buffer(0.
- 인진쑥 추출물을 첨가하여 배양한 림프구를 방사선 조사한 후DNA 외가닥절단에 미치는 인진쑥의 영향을 단세포전 기 영 동분석 으로 살펴 보았다.
- 인진쑥의 방사선에 의한 산화적 손상에 대한 DNA 방어 효과를 확인하기 위하여 마우스 림프구에서 단세포전기 영동법과 CHO 세포에서 미소핵 형성 시험 그리고 마우스의 간과 흉선 조직의 DNA에서 8-OHdG의 형성정도를 관찰하였다. 그 결과 단세포전기영동법 및 미소핵 형성 시험에서는 50 )ig/mL의 농도에서 가장 높은 DNA 손상 억제 효과를 나타내 었으며 , 8-OHdG 형성 정도는 간과 흉선 모두 30 mg/kg 농도 투여군에서 높은 방어효과를 나타내 었다.
- 5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10% DMSO, pH 10)에 담구어 4°C에서 1시간동안 유지하면서 세포를 용해시켰다. 전기영동 : 증류수로 슬라이드에 남아 있는 염을 닦은 후 슬라이드를 전기 영동기 (Agagel Maxi, Biometra, Germany) 에 올려놓고 Electrophoretic buff er (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH>12.3)를 붓고 20분간 정치시켜 DNA의 양가닥이 풀리게 한 다음 25 V, 300 mA에서 20분간 전기 영동을 시행 하였다. 이상의 모든 과정은 추가적인 DNA 손상을 막기 위해 어두운 조명 상태에서 수행하였다.
- , Tokyo, Japan)0] 부착된 HPLC에 주입하여 deoxyguanosine 은 UVD로 8-OHdG는 ECD로 검출하였다. 표준 8-OHdG 및 dG를 standard로 사용하여 각 물질을 정량하였고 8-OHdG의 함량은 정상 dG IO, 개당의 8-OHdG 개수로 환산하여 표시하였다.
대상 데이터
- 서울의 경동시장에서 구입한 인진쑥(Artemisia capillaris) 100 g 에 1, 000 mL의 증류수를 가하여 추출기 (DWP-1800T, 대웅약탕기, Korea)에서 8시간 중탕 주줄한 뒤 고형분을 제거하고, 현탁액을 l, 000xg에서 10분간 원심분리시켰다. 상층액을 여과지로 여과하고 여과액을 감압농축기 (VV2000, Heidolph, Germany)로 농축한 다음 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 실험동물은 대한바이오링크에서 분양받은 생후 5주령의 ICR계 수컷 생쥐를 22 + 1°C의 실내온도와 12시간 주기의 조명이 유지되는 사육실에서 2주간 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물용 펠렛사료(삼양사료)와 물은 자유로이 섭식 하도록 하였다.
- 실험에 사용한 세포 배양액은 RPMI 1640(GIBCO BRL; Grand Island Co., NY., USA)에 2 mg/mL sodium bicar- bonate(GIBCO), 2 x 10 2 M HEPES buffer(GIBCO), 10% 우 태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS; GIBCO), 100 Ug/mL penicillin(GIBCO), 100 Ug/mL streptomycin(GIBCO), 5x 10 ° M 2-mercaptoethanoKSigma Chemical Co., St. Louis, USA)를 첨가하여 완전배지로 사용하였다.
이론/모형
- 방사선 조사에 의한 혈액 림프구의 DNA 손상정도를 측정하기 위하여 Singh 등(22)의 방법에 준해 시행하였다. 마우스의 말초혈액을 채취하여 Ficoll-Histopaque gra dient 방법(23)으로 림프구를 분리하고 H珥SS로 2회 수세 후 완전배지 에 부유시켰다. 분리된 림프구는 시료처리 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 3시간 배양한 다음 한국원자력연구소 저준위 조사실에서 2()0 cGy의 7 -ray를 100 cGy/min의 선량율로 1회 조사하였다.
- 방사선 조사에 의한 혈액 림프구의 DNA 손상정도를 측정하기 위하여 Singh 등(22)의 방법에 준해 시행하였다. 마우스의 말초혈액을 채취하여 Ficoll-Histopaque gra dient 방법(23)으로 림프구를 분리하고 H珥SS로 2회 수세 후 완전배지 에 부유시켰다.
- 방사선 조사후 DNA의 산화적 손상의 지표로써 생체조직 의 DNA에서 8-OHdG의 함량을 Floyd 등(25)의 방법에 준하여 정량하였다.
성능/효과
- 76개로 증가되었다. 30 mg/kg B.W.(p<0.05) 및 70 mg/ kg B.W.(p<0.01) 용량의 시료투여군에서 유의적인 8-OHdG 형성 억제효과를 관찰할 수 있었으며, 30 mg/kg B.W. 투여군에서 보다 높은 억제효과를 나타내었다(Table 2).
- 세포독성을 나타내지 않는 시료의 농도 범위를 정하기 위하여 마우스 비장 림프구에 인진쑥 추출물을 4, 20, 100, 200, 500 Hg/mL의 농도로 처리 하여 배양한 후 MTT assay를 수행 하였다. 4, 20, 100 Ug/mL의 처리 농도에서 각각 101, 100, 99%의 생존율을 나타내어 세포독성을 보이지 않았으나 200, 500 Rg/mL의 처리 농도에서 는 63, 40%의 생존율로 세포 독성 을 나타내 었다(Fig. 1). 따라서 세포독성 을 나타내 지 않 는 100 Ug/mL 이하의 농도에서 실험을 수행하였다.
- 방사선에 의한 산화적 DNA 손상의 주요 지표중의 하나 인 8 OHdG의 형성에 대한 인진쑥 추출물의 억제효과를 살펴보기 위하여, 인진쑥 추출물을 투여한 마우스를 방사선 조사한 후 간과 흉선에서 8- OHdG 형성 정도를 관찰하였다. 간에서 측정한 8-OHdG 형성 정도는 105 dG 당 15.0 + 2.38개 였고, 방사선 조사군에서는 105 dG 당 26.7±4.31개로 증가되 었匸방사선 조사 전 30 mg/kg B.W. 용량의 시료 투여군에 서 10'5 dG 당 15.1 ±207개 로 유의적 인 억제 효과를 나타내었다 (p<0, 05).
- 인진쑥의 방사선에 의한 산화적 손상에 대한 DNA 방어 효과를 확인하기 위하여 마우스 림프구에서 단세포전기 영동법과 CHO 세포에서 미소핵 형성 시험 그리고 마우스의 간과 흉선 조직의 DNA에서 8-OHdG의 형성정도를 관찰하였다. 그 결과 단세포전기영동법 및 미소핵 형성 시험에서는 50 )ig/mL의 농도에서 가장 높은 DNA 손상 억제 효과를 나타내 었으며 , 8-OHdG 형성 정도는 간과 흉선 모두 30 mg/kg 농도 투여군에서 높은 방어효과를 나타내 었다. 이상의 결과에서 인진쑥 추출물은 DNA 상해를 효과적으로 방어하였고 특히, 기존에 알려진 방사선 방호물질에 비하여 독성이 적은 천연물이라는 관점에서 방사선 방어제로 적용이 가능할 것으로 사료된다.
- 방사선에 의한 산화적 손상에 대한 인진쑥의 DNA 방어효 과를 확인하기 위하여 마우스 림프구에서 단세포전기 영동법과 CHO 세포에서 미소핵 형성 시험 그리고 마우스의 간과 흉선 조직의 DNA에서 8-OHdG의 형성정도를 관찰하였다. 그 결과 단세포전기영동법 및 미소핵 형성 시험에서는 50 Ug/mL의 농도에서 가장 높은 DNA 손상 억제 효과를 나타내었 으며, 8-OHdG 형성 시험 에 서 는 간과 흉선 모두 30 mg/kg 농도 투여 마우스에서 높은 방어효과를 관찰할 수 있었다. 대부분의 방사선 방호제가 자유라디칼 소거제로 작용하여 산화적 손상을 억제한다는 보고(36, 37)와 인진쑥의 라디칼 소거 효과에 관한 보고(34, 35)에 근거하여 볼 때, 자유라디칼 소거작용이 인진쑥의 방사선 장해 경감효과에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
- 마우스 림프구에서 방사선에 의한 DNA 외가닥 절단정도 를 측정한 결과, TM 값은 정 상대조군에서 2.02土0.11 이 었고 방사선조사군의 경우 8.54±0.21로 증가되었다. 인진쑥추출 물 처리 군의 경 우 25, 50, 100 Ug/mL 농도에서 각각 5.
- 소핵 형성 빈도는 정상대조군에서 binucleated cell 1, 000 개당 19 七4.2개이었고 방사선조사군의 경우 373土24.0개로 증가되 었다、방사선 조사 전 인진쑥 추출물 처리군의 경우 25, 50, 100 Pg/mL 농도에서 유의적 인 소핵 형성 감소효과를 관찰할 수 있었으며(p<©05), 50 Jig/mL의 처리농도에서 53.6%의 가장 높은 억제효과를 관찰할 수 있었다(Table 1).
- 21로 증가되었다. 인진쑥추출 물 처리 군의 경 우 25, 50, 100 Ug/mL 농도에서 각각 5.80 + 0.17, 5.28士0.1& 6.08土0.24로서 DNA 외가닥절단에 대한 인진쑥 추출물의 유의한 억제효과를 관찰할 수 있었으며(p< 0.01), 50 Hg/mL의 농도에서 50.04%의 가장 높은 DNA 손상 억제효과를 나타내었다(Fig. 2).
후속연구
- 이상의 결과에서 인진쑥 추출물은 DNA 상해를 효과적으로 방어하였 고 특히, 기존에 알려진 방사선 방호물질에 비하 여 독성이 적은 천연물이라는 관점에 서 방사선 방어제로 적용이 가능할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에서 인진쑥 추출물은 DNA 상해를 효과적으로 방어하였 고 특히, 기존에 알려진 방사선 방호물질에 비하 여 독성이 적은 천연물이라는 관점에 서 방사선 방어제로 적용이 가능할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.