프로폴리스에서 분리한 MDQ 및 quercetin의 작용기에 따른 항산화 효과를 비교 분석하고 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 있어서 두 화합물이 어느 정도의 방어효과가 있는지를 측정 하고자 하였다. 두 화합물의 항산화 활성 시험(DPPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성, superoxide anion 라디칼 소거활성)에서 quercetin이 MDQ보다 훨씬 강한 항산화 활성을 보였으며, 특히 superoxide anion라디칼 소거활성 시험에서 MBQ는 거의 활성을 보이지 않았지만 quercetin은 농도 의존적인 강한 소거활성을 보였다. 또한, mouse 림프구에서 방사선 조사에 의한DNA의 산화적 손상에 대한 두 화합물의 방어효과 시험에서 MDQ와 Quercetin은 동일 농도에서 거의 유사한 방사선 방어효과가 관찰되었다. 상기의 결과로부터 두 화합물의 작용기를 고려해 볼 때 B ring에 있는 catechol작용기의 존재 유무에 따라서 항산화 활성의 차이가 있으며 또한 MDQ화합물의 C ring에 존재하는 methoxy group은 quercetin에 존재하는 hydroxy group과 비교해 볼 때 항산화를 비활성화시키는 작용기의 하나로서 판단되어진다. 따라서 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 방사선 방어 효과는 항산화 활성에 미치는 메카니즘과 유사하게 작용하는 것으로 판단되어지며 아울러 일차적으로 항산화 활성 물질을 검색함으로써 산화적 스트레스에 의한 DNA에 대한 방어물질 검색 수단으로서 유용할 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 프로폴리스는 산화적 스트레스에 대한 경감제로서 그 가능성이 시사되었다.
프로폴리스에서 분리한 MDQ 및 quercetin의 작용기에 따른 항산화 효과를 비교 분석하고 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 있어서 두 화합물이 어느 정도의 방어효과가 있는지를 측정 하고자 하였다. 두 화합물의 항산화 활성 시험(DPPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성, superoxide anion 라디칼 소거활성)에서 quercetin이 MDQ보다 훨씬 강한 항산화 활성을 보였으며, 특히 superoxide anion라디칼 소거활성 시험에서 MBQ는 거의 활성을 보이지 않았지만 quercetin은 농도 의존적인 강한 소거활성을 보였다. 또한, mouse 림프구에서 방사선 조사에 의한DNA의 산화적 손상에 대한 두 화합물의 방어효과 시험에서 MDQ와 Quercetin은 동일 농도에서 거의 유사한 방사선 방어효과가 관찰되었다. 상기의 결과로부터 두 화합물의 작용기를 고려해 볼 때 B ring에 있는 catechol작용기의 존재 유무에 따라서 항산화 활성의 차이가 있으며 또한 MDQ화합물의 C ring에 존재하는 methoxy group은 quercetin에 존재하는 hydroxy group과 비교해 볼 때 항산화를 비활성화시키는 작용기의 하나로서 판단되어진다. 따라서 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 방사선 방어 효과는 항산화 활성에 미치는 메카니즘과 유사하게 작용하는 것으로 판단되어지며 아울러 일차적으로 항산화 활성 물질을 검색함으로써 산화적 스트레스에 의한 DNA에 대한 방어물질 검색 수단으로서 유용할 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 프로폴리스는 산화적 스트레스에 대한 경감제로서 그 가능성이 시사되었다.
Two flavonoids, 7-O-methyl-3',4'-didehydroxy quercetin (MDQ) and quercetin, isolated from Chinese propolis, which is the generic name for the resinous substance collected by honeybees from various plant sources, were tested for their antioxidant activity and protective effect against radiation-induc...
Two flavonoids, 7-O-methyl-3',4'-didehydroxy quercetin (MDQ) and quercetin, isolated from Chinese propolis, which is the generic name for the resinous substance collected by honeybees from various plant sources, were tested for their antioxidant activity and protective effect against radiation-induced DNA damage in mouse lymphocytes. In antioxidant test, both compounds provided a dose-dependent scavenging effect on DPPH radical and a dose-dependent inhibitory effect on lipid peroxidation in mouse liver. Quercetin showed stronger scavenging and inhibitory effect than MDQ, and it also provided strong inhibition on superoxide anion radical generated in xanthine-xanthine oxidase system, but there was no inhibitory ability for MDQ. In comet assay using single cell gel electrophoresis, MDQ and quercetin showed a protective effect against DNA damage caused by gamma irradiation. They reduced DNA damage to 54% (p<0.01) and 53% (p<0.01) at 25 $\mu$mol, respectively. These results suggest that free radical scavenging seems to be associated with their catechol form on the B ring, and radioprotection appears to be a likely mechanism of antioxidant activity by these flavonoids.
Two flavonoids, 7-O-methyl-3',4'-didehydroxy quercetin (MDQ) and quercetin, isolated from Chinese propolis, which is the generic name for the resinous substance collected by honeybees from various plant sources, were tested for their antioxidant activity and protective effect against radiation-induced DNA damage in mouse lymphocytes. In antioxidant test, both compounds provided a dose-dependent scavenging effect on DPPH radical and a dose-dependent inhibitory effect on lipid peroxidation in mouse liver. Quercetin showed stronger scavenging and inhibitory effect than MDQ, and it also provided strong inhibition on superoxide anion radical generated in xanthine-xanthine oxidase system, but there was no inhibitory ability for MDQ. In comet assay using single cell gel electrophoresis, MDQ and quercetin showed a protective effect against DNA damage caused by gamma irradiation. They reduced DNA damage to 54% (p<0.01) and 53% (p<0.01) at 25 $\mu$mol, respectively. These results suggest that free radical scavenging seems to be associated with their catechol form on the B ring, and radioprotection appears to be a likely mechanism of antioxidant activity by these flavonoids.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
이에 본 연구에서는 중국산 프로폴리스에서 7-O-methyl- 3" , 4, - di dehydroxy quercetin(MDQ) 과 quercetin-g- 분리하여 항산화 활성 (DPPH 라디 칼 소거 활성, 지 질과산화 억 제 활 성, superoxid anion 라디칼 소거활성)을 서로 비교검토한 후, comet assay를 이용한 단세포 전기영동(single cell gel electrophoresis)을 실시하여 이들 화합물이 방사선 방어효 과에 미치는 효과를 알아보고자 하였다.
프로폴리스에서 분리한 MDQ 및 quercetin의 작용기에 따른 항산화 효과를 비교 분석하고 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 있어서 두 화합물이 어느 정도의 방 어효과가 있는지를 측정하고자 하였다. 두 화합물의 항산화 활성 시험①PPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성, superoxide anion 라디칼 소거활성)에서 quercetin0] MDQ 보다 훨씬 강한 항산화 활성을 보였으며, 특히 superoxide anion 라디 칼 소거 활성 시험 에서 MDQ는 거의 활성을 보이지 않았지 만 quercetine 농도 의 존적 인 강한 소거 활성을 보였다.
제안 방법
용해 시 킨 slide는 electrophoretic buffer를 이 용 25 V, 300 mA에서 25분간 전기 영동을 시 행하였다. 60 UL의 ethidium bromide(20 pL)로 염색한 후 CCD 카메라가 부착 된 형광 현미경을 사용하여 이 미지 분석 프로그램任Comet 4.0, Kinetic imaging, Ltd., Great Britain)을 통해 60개의 세포를 선택하여 분석하였다. DNA 손상정도는 tail 길이와 tail내 DNA 파편 (fragment)을 수치 화시 킨 tail moment(TM)로 나 타내 었으며 TM 값이 증가할수록 DNA가 손상을 많이 받은 것을 의미한다.
Fe27ascorbate 반응계에 의하여 최종 생성된 hydroxyl radicale 지질원인 microsome을 산화시 켜 malondialdehyde (MDA)가 생성되는데, 이것을 thiobarbituric acid(TBA)와 반응시 켜 분광학적 방법으로 정 량하였다. 즉, Microsome(10 mg protein/mL) 50 虬, 50 mM Tris-buffer(pH 7.
8 mL씩을 가한 후 vortex mixer로 10초간 진탕하여 30분 후 분광광도계 (Shimadzu UV-1201, Japan)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디 칼 소거 활 성은 DPPH의 전자공여능(electron donating ability, EDA) 을 측정 하였으며 , 시료첨 가와 비 첨 가구의 흡광도 감소 차이를 백분율로 나타내었다.
된 RPMI 1640배지 에 부유시 켰다. 림프구 배양 시 험관에 시료를 첨가하여 3시간 동안 배 양한 다음, 산화적 스트레스를 부 가하기 위해 Co-60 감마선을 1 Gy/min의 선량율로 2 Gy 조사하였다. 림프구는 방사선 조사 후 DNA 수복을 차단하기 위하여 전기영동을 시행하기 전까지 4℃를 유지하였다.
분리한 두 화합물에 대한 구조분석은 분광학적 기기 및 참고문헌의 data와 비교하여 동정 하였다. PP02의 *H NMR 분석 에서 C ring의 3H 분에 해당하는 methoxy group의 단일 peak가 3.
Alkali 조건의 단세포 전기 영 동법 (single cell gel electrophoresis: Comet assay)은 DNA 외가닥 절단과 alkali 에 민 감한 부위 (Apurinic or Apyrimidinic site: AP site)를 민감하 게 즉정할 수 있기 때문에 유전독성물질을 감지하기 위한 생물학적 표지자로 각광을 받고 있다. 실험은 Singh 등(22) 의 방법에 따라 방사선에 의한 혈액 림프구세포)의 DNA 손상 정도를 측정하기 위하여 세포를 agarose와 혼합하고 이를 slide에 점적한 후 lysis buffer에서 4℃로 1시간 동안 용해 시 켰다. 용해 시 킨 slide는 electrophoretic buffer를 이 용 25 V, 300 mA에서 25분간 전기 영동을 시 행하였다.
안정한 자유 라디칼인 DPPH(1, 1*diphenyl- 2-picrylhy- drazyl) 소거 활성 에 미 치 는 MDQ 및 quercetin의 활성을 비교하여 Fig. 2에 제 시 하였다. 두 화합물은 10, 20, 50, 100 limol 에서 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거효과를 나타내었다.
유효성분의 분리를 위해 silica gel(230~400 mesh, Merk 사)을 충진제로 하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 즉, 프로폴리스를 칼럼에 loading 하여 hexane-ethyl acetate (4:1) 용매계로 용출한 후 재차 동일한 칼럼에서 aceton- MeOH(gradient), aceton-ethyl acetate(40:l) 및 hexaneethyl acetate(7:l) 용매계로 재 정제하여 두 개의 순수 단일 물질 (PP02, PP03)을 분리 하였다.
유효성분의 분리를 위해 silica gel(230~400 mesh, Merk 사)을 충진제로 하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하였다. 즉, 프로폴리스를 칼럼에 loading 하여 hexane-ethyl acetate (4:1) 용매계로 용출한 후 재차 동일한 칼럼에서 aceton- MeOH(gradient), aceton-ethyl acetate(40:l) 및 hexaneethyl acetate(7:l) 용매계로 재 정제하여 두 개의 순수 단일 물질 (PP02, PP03)을 분리 하였다. 분리한 두 화합물의 구조 분석은 *H NMR 및 13C NMR(Bruker AW-500 spectrophotometer)3!- JEOLJMS-700 mass spectrometer# 이용하여 분석을 실시하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 프로폴리 스는 중국산으로 (주)서 울프로 폴리스에서 구입한 것을 사용하였고 시료의 제조는 프로폴 리스 원괴의 중량대비 10배의 80% ethan이을 가하여 약 40 ℃에서 8시간 동안 교반 추출하였다. 추출 후, 여과 및 농축 을 거쳐 얻은 농축액을 -70℃에서 동결 건조시켜 시료로 사용하였다.
이론/모형
Mouse의 말초혈액을 채취하여 Ficoll-Histapaque gradient 방법으로 림프구를 분리하고 HBSS에 수세한 후 10 % fetal bovine sereum, L-glutamine, antibioticse卜 첨 7].된 RPMI 1640배지 에 부유시 켰다.
Superoxide anion 라디 칼 소거 능 시험 은 tetrazolium salt (WST-8 or CCK-8)환원법을 이용하여 측정하였다(21). 즉 superoxide anion 라디 칼 생성은 96-well plate에 시료 5 pL, 10 mU/mL xanthine oxidase를 함유하는 0.
성능/효과
2 ppm에서 multiple 및 doublet peak의 형태로 각각 나타났다. 13C NMR에서는 C ring의 대칭면 존재로 총 14개의 carbon 수가 관찰되었고 127.7과 128.4 ppm에서 2C 분으로 각각 적 분되었다. 본 결과를 바탕으로 PP02는 7-(9-methyl-3', 4'-didehydroxy quer- cetin(MDQ)으로 동정되었으며 PP03에 대한 구조분석에서 의 ‘H 및 13C NMR data는 문헌치(23)의 분석 결과와 비교하 였을 때 전형적인 quercetin과 일치하였다(Fig.
4에 제시하였다. MDQ는 2, 8, 30, 60μmol의 농도에서 소거활성이 관찰되지 않았고 동일 농도에서 quercetine 높은 소거 활성을 보였다. 특히 quercetine-8 Umol-^ 농도에서 50% 이상의 소거 활성을 나타냈다.
MDQ는 5 및 25 nmol의 농도에서 39% 및 54 %(p0.05)이 관찰되지 않았다.
두 화합물은 10, 20, 50, 100 limol 에서 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거효과를 나타내었다. MDQ는 최대 농도인 100 nmol에서 40% 이상의 소거 활성을 보였고 quercetine 동일농도에서 90% 이상의 강한 라디 칼 소거활성을 보였다.
3에 제시하였다. 두 화합물은 DPPH 라디 칼 소거활성 농도보다 낮은 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 岫이의 농도에서 농도 의존적인 지질과산화 억제효과를 보였으며 MDQ는 4.0pmol에서 약 50%의 억제활성을 quercetine 0.5 Enol에서 70% 이상의 높은 지 질과산화물 형 성 억 제 효과를 나타내었다.
프로폴리스에서 분리한 MDQ 및 quercetin의 작용기에 따른 항산화 효과를 비교 분석하고 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 있어서 두 화합물이 어느 정도의 방 어효과가 있는지를 측정하고자 하였다. 두 화합물의 항산화 활성 시험①PPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성, superoxide anion 라디칼 소거활성)에서 quercetin0] MDQ 보다 훨씬 강한 항산화 활성을 보였으며, 특히 superoxide anion 라디 칼 소거 활성 시험 에서 MDQ는 거의 활성을 보이지 않았지 만 quercetine 농도 의 존적 인 강한 소거 활성을 보였다. 또한, mouse 림프구에서 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 두 화합물의 방어효과 시험에서 MDQ 와 quercetine 동일 농도에서 거의 유사한 방사선 방어 효과가 관찰되었다.
두 화합물의 항산화 활성 시험①PPH 라디칼 소거활성, 지질과산화 억제활성, superoxide anion 라디칼 소거활성)에서 quercetin0] MDQ 보다 훨씬 강한 항산화 활성을 보였으며, 특히 superoxide anion 라디 칼 소거 활성 시험 에서 MDQ는 거의 활성을 보이지 않았지 만 quercetine 농도 의 존적 인 강한 소거 활성을 보였다. 또한, mouse 림프구에서 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 두 화합물의 방어효과 시험에서 MDQ 와 quercetine 동일 농도에서 거의 유사한 방사선 방어 효과가 관찰되었다. 상기의 결과로부터 두 화합물의 작용기를 고려 해 볼 때 B ring에 있는 catechol 작용기의 존재 유무에 따라서 항산화 활성의 차이가 있으며 또한 MDQ 화합물의 C ring 에 존재하는 methoxy groupe quercetin에 존재하는 hydroxy group과 비교해 볼 때 항산화를 비활성화시키는 작용기의 하나로서 판단되어진다.
4 ppm에서 2C 분으로 각각 적 분되었다. 본 결과를 바탕으로 PP02는 7-(9-methyl-3', 4'-didehydroxy quer- cetin(MDQ)으로 동정되었으며 PP03에 대한 구조분석에서 의 ‘H 및 13C NMR data는 문헌치(23)의 분석 결과와 비교하 였을 때 전형적인 quercetin과 일치하였다(Fig. 1, Table 1).
또한, mouse 림프구에서 방사선 조사에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 두 화합물의 방어효과 시험에서 MDQ 와 quercetine 동일 농도에서 거의 유사한 방사선 방어 효과가 관찰되었다. 상기의 결과로부터 두 화합물의 작용기를 고려 해 볼 때 B ring에 있는 catechol 작용기의 존재 유무에 따라서 항산화 활성의 차이가 있으며 또한 MDQ 화합물의 C ring 에 존재하는 methoxy groupe quercetin에 존재하는 hydroxy group과 비교해 볼 때 항산화를 비활성화시키는 작용기의 하나로서 판단되어진다. 따라서 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 방사선 방어효과는 항산화 활성 에 미치는 메카 니즘과 유사하게 작용하는 것으로 판단되어지 며 아울러 일 차적으로 항산화 활성 물질을 검색함으로써 산화적 스트레 스에 의한 DNA에 대한 방어물질 검색 수단으로서 유용할 것으로 사료된다.
따라서 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 방사선 방어효과는 항산화 활성 에 미치는 메카 니즘과 유사하게 작용하는 것으로 판단되어지 며 아울러 일 차적으로 항산화 활성 물질을 검색함으로써 산화적 스트레 스에 의한 DNA에 대한 방어물질 검색 수단으로서 유용할 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 프로폴리 스는 산화적 스트레스에 대한 경감제로서 그 가능성이 시사되었다.
후속연구
상기의 결과로부터 두 화합물의 작용기를 고려 해 볼 때 B ring에 있는 catechol 작용기의 존재 유무에 따라서 항산화 활성의 차이가 있으며 또한 MDQ 화합물의 C ring 에 존재하는 methoxy groupe quercetin에 존재하는 hydroxy group과 비교해 볼 때 항산화를 비활성화시키는 작용기의 하나로서 판단되어진다. 따라서 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 방사선 방어효과는 항산화 활성 에 미치는 메카 니즘과 유사하게 작용하는 것으로 판단되어지 며 아울러 일 차적으로 항산화 활성 물질을 검색함으로써 산화적 스트레 스에 의한 DNA에 대한 방어물질 검색 수단으로서 유용할 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 프로폴리 스는 산화적 스트레스에 대한 경감제로서 그 가능성이 시사되었다.
참고문헌 (23)
Fridovich I. 1974. Superoxide radical and the bacterial action of phagocytes. J Med 290: 624-625
McCord JM. 1974. Free radical and inflammation: Protection of synovial fluid by superoxide dismutase. Science 185: 529-531
Frenkel K, Wei H, Bhimani R, Ye J, Zaduanisky JA, Huang M, Ferraro T, Conney AH, Grunberger D. 1993. Inhibition of tumor promoter-mediated processes in mouse skin and bovine lens by caffeic acid phenethyl ester. Cancer Res 53: 1255-1261
Tatefuji T, Izumi N, Ohta T, Arai S, Ikeda M, Kurimoto M. 1996. Isolation and identification of compounds from Brazilian which enhance macrophage spreading and mobility. Biol Pharm Bull 19: 966-970
Lin S, Lin Y, Chen C, Chung C, Hsu S. 1977. The hepatoprotective and therapeutic effects of propolis ethanol extract on chromic alcohol-induced liver injuries. Am J Chin Med 25: 325-332
Miyataka H, Nishiki M, Matsumoto H, Fujimoto T, Matsuka M, Satoh T. 1997. Evaluation of Brazilian and Chinese propolis by enzymatic and physico-chemical methods. Biol Pharm Bull 20: 496-501
Munstedt K. 2001. Proplis, current and future medical uses. American Bee J 141: 506-507
Sud'ina GF, Mirzoeva OK. 1993. Caffeic acid phenethyl ester as a lipoxygenase inhibitor with antioxidant properties. FEBS 329: 2-24
Krol W, Scheller S, Czuba Z, Matsuno T, Zydowicz G. 1996. Inhibition of neutrophils' chemiluminescene by ethanol extracts of propolis and its phenolic components. J Ethnopharmacol 55: 19-25
Nardini M, Natella F, Gentili V, Maurizio C, Felice D. 1977. Effect of caffeic acid dietary supplementation on the antioxidant defense system in rat. Arch Biochem Biophys 342: 157-160
Cizmarik J, Matel I. 1978. Study of the chemical structure of propolis. Isolation and identificatio of 4-oxy-3-methoxycinnamic acid from propolis. In Propolis. Apimondia Publishing House, Bucharest, Romania. p 30
Vachalkova A, Novotny L, Solivajsova A, Suchy V. 1995. Polarographic behavior of flavonoids from propolis and their potential carcinogenity. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 36: 137-143
Chung HY, Kim HB. 2000. In vitro studies in the superoxide scavenging activities, the cytotoxic and the immunomodulating effects of thirteen kinds of herbal extracts. Korean J Food Sci Technol 32: 699-705
Singh NP, Stephens RE, Schneider EL. 1995. Induction of DNA single-strand breaks in human lymphocytes by low doses of ${\gamma}-ray$ . J Radiat Biol 66: 563-569
Fossen T, Pedersen A, Andersen OM. 1997. Flavonoids from red onion (Allium cepa). Phytochemistry 47: 281-285
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.