된장으로부터 혈전용해능 및 β-Glucosidase 활성을 가진 균주 분리 및 효소생산 배지의 최적화 Isolation of Fibrinolytic Enzyme and β-Glucosidase Producing Strains from Doenjang and Optimum Conditions of Enzyme Production원문보기
Bacterial strains showing the firinolytic and $\beta$-glucosidase activity were screened from Doeniang. The strain of KH-15 revealed a high level of fibrinolytic and $\beta$-gluocosidase activity. The isolated bacterium was identified and desingnated as Bacillus sp. KH-15. The ...
Bacterial strains showing the firinolytic and $\beta$-glucosidase activity were screened from Doeniang. The strain of KH-15 revealed a high level of fibrinolytic and $\beta$-gluocosidase activity. The isolated bacterium was identified and desingnated as Bacillus sp. KH-15. The carbon, nitrogen and salts sgnificantly influenced te fibrinolytic enzyme and $\beta$-glucosidase production. The optimized composition of medium appeared to be 2％ glucose, 0.5% yeast extract and 0.1% calcium chloride. The optimum pH and temperature for fibrinolytic enzyme and $\beta$-glucosidase activities were pH 7∼8, 4$0^{\circ}C$ and pH 6∼8, 30∼4$0^{\circ}C$, respectively.
Bacterial strains showing the firinolytic and $\beta$-glucosidase activity were screened from Doeniang. The strain of KH-15 revealed a high level of fibrinolytic and $\beta$-gluocosidase activity. The isolated bacterium was identified and desingnated as Bacillus sp. KH-15. The carbon, nitrogen and salts sgnificantly influenced te fibrinolytic enzyme and $\beta$-glucosidase production. The optimized composition of medium appeared to be 2％ glucose, 0.5% yeast extract and 0.1% calcium chloride. The optimum pH and temperature for fibrinolytic enzyme and $\beta$-glucosidase activities were pH 7∼8, 4$0^{\circ}C$ and pH 6∼8, 30∼4$0^{\circ}C$, respectively.
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문제 정의
특히 아시아에서 많이 섭취하는 대두 발효식품인 된장이나 miso, tempeh 등에서 는 발효과정에서 isoflavone 이 주로 흡수되기 쉬운 상태인 aglycone 형태로 변환되어 genistein, daidzein의 함량이 높아지는 것으로 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 우리나라 된장에서 혈전 용해 능뿐만만 아니라 대두의 isoflavone을 소화섭 취 하기 쉬운 상태인 aglycone 형태로 전환시킬 수 있는 0-glucosidase의 활성이 우수한 균주를 분리하여, 이를 활용하여 혈전 용해 능과 isofl- avone의 소화섭 취가 용이한 된장 제조에 사용하고자 한다.
Urokinase의 경우 장내에 투입 시 켜 흡수시키면 혈액 내의 혈전 용해 능이 현저히 증가한다고 하여 관심을 끌었다. 즉, 장에서 흡수된 urokinasee]- 간에 도달하여 혈전을 용해시키는 효소의 합성을 증진시킴으로써 혈전 용해 능이 증가하는 것으로 추측된다고 보고(1)함으로서 혈전 용해 효소의 장내투여 응용성이 가능하다는 점을 시사하고 있다.
제안 방법
1 mL를 첨가하여 혼합한 후 페트리디쉬에 붓고 실온에서 5~10분간 방치하여 고화시켜 fibrin plate를 만들었다. Fibrin plate에 pasteur pipette으로 지름 5 mm의 구멍을 만들어 조 효소액 20 UL를 주입하고 37℃에서 12시간 반응시킨 다음 생성된 투명환의 면적을 측정하였으며 대조 구로 서 정제된 혈전용해효소인 plasmind.O unit/mL)을 사용하였다.
금속이온이 효소생산에 미치는 영향을 살펴보기 위해 탄 소원으로 2% glucose, 질소원으로 0.5% yeast extract를 사용하여 각종 금속이온을 0.1% 첨가하여 효소의 생산량을 측정 하였다(Fig. 3). 그 결과 sodium phosphate와 calcium chlo- ride를 첨가한 경우 혈전 용해 활성이 각각 3.
된장에서 단백질 분해능이 있는 균주를 분리하기 위해 시료 10 g에 생리식염수 90 mL를 취하여 진탕하고 1(尸~ 10” CFU/mL으로 희석한 후 미리 준비한 nutrient agar skim milk 배지에 도말한 후37℃에서 48시간 배양한 후 배지에 나타난 colony의 크기와 모양 및 환의 크기에 따라 균주를 분리하였다. 선별된 균주들은 nutrient medium에 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 그 상징액을 조 효소액으로 하여 혈전 용해 효소 활성 및 (3-glucosidase 활성을 측정하였다.
분리 균주에 대한 현미경관찰을 통한 형태학적 특징 및 각종 배지에서의 배양 상의 특징을 검토하였으며, 균주의 생리적 및 생화학적인 특성을 규명하고 이를 토대로 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology(9)에 준하여 분리균주 를 동정하였다.
된장에서 단백질 분해능이 있는 균주를 분리하기 위해 시료 10 g에 생리식염수 90 mL를 취하여 진탕하고 1(尸~ 10” CFU/mL으로 희석한 후 미리 준비한 nutrient agar skim milk 배지에 도말한 후37℃에서 48시간 배양한 후 배지에 나타난 colony의 크기와 모양 및 환의 크기에 따라 균주를 분리하였다. 선별된 균주들은 nutrient medium에 37℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 제거하고 그 상징액을 조 효소액으로 하여 혈전 용해 효소 활성 및 (3-glucosidase 활성을 측정하였다.
O unit/mL)을 사용하였다. 조효소의 혈전 용해 활성은 대조 구의 용해 면적에 대한 상대적인 비율로 환산하여 산출하였다.
질소원이 효소생산에 미치는 영향을 살펴보기 위해 탄소 원으로 2% glucose를 사용하여 각종 질소원을 0.5% 첨가하여 효소의 생산량을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 yeast extract, soytone 및 soybean powder를 첨가한 경우 혈전 용해 활성이 3.
대상 데이터
균주배양에 사용한 nutrient mediume Difco Laborator- ies(USA)의 제품을 사용하였으며, 된장은 임의로 선별된 10가구에서 재래식으로 가정에서 제조한 된장을 수집하여 사용하였다. Fibrin, fibrinogen, thrombin, agarose 및 plasmin 등은 Sigma Chemical Co.
3 unit의 높은 활성을 보였다. 특히 strain KHT5는 높은 혈전용해활성과 阡 glucosidase의 활성을 보임에 따라 우수한 혈전용해능과 iso- flavone의 소화되기 쉬운 형태인 aglycon-j- 다량 생산이 가능한 균주로 선정하였다.
이론/모형
8-Glucosidase 활성은 Peralta 등⑻의 방법을 사용하여 측정하였다. 효소액은 50℃ 항온수조에서 5분간 활성화시 켰다.
성능/효과
Aspergillus nig er 균주(16)에 의한 P-glucosidase 생산 시 탄소 원으로 CMC가 가장 높은 효소의 활성을 보였으나 glucose와 fructose도 다른 탄 소원 에 비해 비교적 높은 효소의 활성을 보였다.
5 unit로 높은 활성을 보였으며, 。-glucosidase의 활성은 각각 2123 와 423 unit의 효소 활성을 보였다. Glucosidase의 활성은 혈전 용해 활성과는 달리 magnesium sulfate 첨 가시 가장 높은 효소 활성인 2345 unit를 보였다. 금속이온 첨가 시 혈전 용해 활성 과 P-glucosidase 활성이 비교적 높은 calcium chloride 첨가 가 가장 바람직하였다.
각지에서 수집한 재래식 된장으로부터 분리한 균주의 혈 전용해 능과 6-glucosidase의 활성을 측정한 결과(Table 1), strain KI「5, 13, 15는 혈전 용해 활성이 2.9, 2.8, 2.8 unit로 비교적 높은 활성을 보인 반면, (3-glucosidase의 활성은 strain KHT3과 15가 각각 1564.6과 1995.3 unit의 높은 활성을 보였다. 특히 strain KHT5는 높은 혈전용해활성과 阡 glucosidase의 활성을 보임에 따라 우수한 혈전용해능과 iso- flavone의 소화되기 쉬운 형태인 aglycon-j- 다량 생산이 가능한 균주로 선정하였다.
2). 그 결과 yeast extract, soytone 및 soybean powder를 첨가한 경우 혈전 용해 활성이 3.2, 2.7, 3.0으로 높은 활성을 보였으며, P-glucos- idase 의 활성은 yeast extract와 peptone 첨 가시 2345과 1923 unit의 활성을 보였으며, 혈전 용해 활성이 비교적 높았던 soy- tone과 soybean powder는 1213과 1532 unit의 활성을 보였다. Jang 등(12)도 새우젓에서 분리한 균주의 질소원으로 yeast extract# 이용하였으나, Choi 등 (14) 이 Bacillus sub- tilis BKT7의 질소원으로 peptone과 beef exract를 이용하였다는 결과와는 다소 차이를 보였다.
Glucosidase의 활성은 혈전 용해 활성과는 달리 magnesium sulfate 첨 가시 가장 높은 효소 활성인 2345 unit를 보였다. 금속이온 첨가 시 혈전 용해 활성 과 P-glucosidase 활성이 비교적 높은 calcium chloride 첨가 가 가장 바람직하였다. 반면 Choi 등(14)이 가장 높은 혈전용 해 활성을 보고한 sodium phosphate 첨 가는 3.
4), 혈전 용해 활성은 pH 7~8에서 가장 높은 활성을 보인 반면, 0-glucosidase 효소 활성은 pH 6~8 사이 에서 가장 높은 효소 활성을 보였다. 또한 배양온도에 따른 효소의 활성을 측정한 결과(Fig. 4), 혈전 용해 활성은 40℃에서 가장 높았으며, 0-glucosidase 활성은 30~40℃에서 높은 활성을 보였다. 지금까지 보고에 의하면 된장 또는 청국장에서 분리한 세균의 혈전 용해 활성은 초기 pH 6~8 사이에서 가장 높은 활성을 보였으며 (12, 14, 15), 배양온도 30~40℃에서 비교적 높은 효소의 활성을 보임에 따라 된장에서 분리한 균주 Bacillus sp.
분리된 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과이다. 분리된 균주는 간균, gram 양성이 었으며, 운동성이 있고 catalase 양성, 그리고 포자를 생성하는 것으로 관찰되었다. 그리고 이 균주는 nitrate 환원 반응과 citrate 이 용반응, Voges- Proskuer test에서 도 양성의 반응을 보였고, propionate 이 용 반응, glucose와 nitrate로부터의 gas 생성 반응은 음성을 보였다.
그리고 이 균주는 nitrate 환원 반응과 citrate 이 용반응, Voges- Proskuer test에서 도 양성의 반응을 보였고, propionate 이 용 반응, glucose와 nitrate로부터의 gas 생성 반응은 음성을 보였다. 이 균주는 생육 시 casein, gelatin, starch에 대해서 활성이 매우 높은 것으로 나타나 단백질과 전분의 분해능력이 우수하였다. 따라서 이 균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (9) 의 기준에 의하여 Bacillus 속으로 판단되었으며, 이 균주를 Bacillus sp.
혈전 용해 효소 활성과 P-이 ucosidase 의 효소 활성을을 가장 높게 생산하는 최적화 배지(2% glucose, 0.5% yeast extract, 0.1% calcium chloride)에서 초기 pH와 온도의 영향을 살펴보기 위해 pH를 5~9 사이로 조절하여 효소의 생산량을 측정한 결과(Fig. 4), 혈전 용해 활성은 pH 7~8에서 가장 높은 활성을 보인 반면, 0-glucosidase 효소 활성은 pH 6~8 사이 에서 가장 높은 효소 활성을 보였다. 또한 배양온도에 따른 효소의 활성을 측정한 결과(Fig.
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