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문제 정의
- 본 연구는 포장의 CGMMV 발병 억제를 위하여 이용될 수 있는 효율적인 종자 검정 방법 개발을 위하여 수박 대목용 박 종자로부터 CGMMV를 효율적으로 추출하고, 이를 RTPCR로 진단해서 보다 신속하고 특이적으로 종자 검정하는 방법을 개발하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- 80%이상의 CGMMV에 오염된 박 종자를 이용하여 ethanol 침전에 의한 추출, double filtration에 의한 추출, PEG 침전에 의한 추출 및 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 바이러스를 추출한 후 RT-PCR을 이용해서 검정하였다. 그 결과 ethanol 침전, double filtration, PEG 침전에 의한 추출법은 RT-PCR에 의해 DNA절편이 증폭되지 않았고, phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 주출법만이 420 bp의 CGMMV 바이러스가 분리되어 DNA절편이 증폭되었다(Fig.
- Sensitivity of RT-PCR assay. CGMMV-infested seed added to the following number of healthy seeds; lane 1, 10; lane 2, 50; lane 3, 100; lane 4, 500; lane 5, 1000; lane 6, healthy seed extraction; lane 7, positive control (CGMMV-infested bottle gourd seed).
- GeneBank에 보고된 CGMMV의 염기서열들을 비교하여 외피단백질 염기서열 중에서 strain에 homology가 있는 부위에서 , OLIGO v5.0 program을 이용하여 CGMMV* 공통적으로 증폭시킬 수 있는 Wmf 1 (5'-TTATTGCGTTTAGTGCTTCTTATG- 3')과 Wmrl(5'-AAAACGCGGCTTCAAATG-3')로 primer를 고안하였다.
- GeneBank에 보고된 CGMMV의 외피단백질 관련 염기서열로부터 strain에 관계없이 특이성이 높은 부위에서 증폭이 가능한 Wmfl과 Wmrl의 primer를 제작하여 RT-PCR을 수행하였다.
- 0 ㎕ 전체 RNA)를 준비한 후 -everse transcription을 위하여 42℃에서 15분, 99℃ 에서 5분, 51에서 5분 처리하였다. PCR증폭을 위한 80㎕의 PCR master mixture의 준비를 위해 2.0 mM MgCb, IX PCR buffer Ⅱ, 1.0 U Taq DNA polymerase, 각각 100 pmol의 Wmrl과 Wmfl primer 및 의 RT산물을 흔합하여 94℃에서 2분 처리 후 94℃에서 50초, 6TC에서 50초(각 cycle마다 씩 감소), 72℃에서 50초의 조건으 로 12 cycle과 94<>C에서 50초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 50초의 조건으로 30 cycle의 PCR증폭을 수행하였으겨 최종 RT-PCR 산물은 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- RT-PCRe GeneAmp RNA PCR Kit(Perkin Elmer Cetus)을 이용하였으며, 먼저 20㎕의 RT master mixture (5.0 mM MgCl2, 1 XPCR buffer Ⅱ, 1 U RNase inhibitor, 2.5 U MuLv reverse transcriptase, 100 pmol Wmrl primer, 1.0 mM dNTP, 3.0 ㎕ 전체 RNA)를 준비한 후 -everse transcription을 위하여 42℃에서 15분, 99℃ 에서 5분, 51에서 5분 처리하였다. PCR증폭을 위한 80㎕의 PCR master mixture의 준비를 위해 2.
- 수집에 의해 CGMMV로 의심되는 식물체를 독말풀(Datura stramonium)에서 3번 계대하여 단일 국부 병징을 확인한 후 박에서 증식시켰다. RT-PCR에서 primer와의 특이성 검정을 위하여, 증식된 잎에서 전체 RNA추출은 RNase Plant Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 실시하였다.
-
RT-PCR을 이용한 종자검정의 특이성 및 민감도 조사.
- 2. Specific RT-PCR detection of CGMMV by using total RNA extract from watermelon and bottle gourd leaves and seeds : lane 1, CGMMV-infested bottle gourd leaf; lane 2, CGMMV- infested bottle gourd seed; lane 3, CGMMV-infested watermelon leaf; lane 4, CGMMV-infested watermelon seed; lane 5, CMV- infested cucumber leaf; lane 6, WMV-infested cucumber leaf; lane 7, ZYMV-infested eggplant leaf; lane 8, CGMMV-W; lane 9, Healthy bottle gourd leaf(negative control); and lane M, Hi-Lo marker.
- 신속하고 간편한 종자검정 방법의 개발을 위하여 종자로부터 바이러스를 간편하게 추출할 수 있는 방법이 필요하다. 따라서, RT-PCR을 위한 간편한 추출법을 선발하기 위해 ethanol 침전, double filtration, PEG 침전 및 phenol/chloroform/isoamyl alcohol0!] 의한 주출법을 비교하였다. Ethanol 침전, double filtration 및 PEG 침전에 의한 추출법은 RT-PCR에 반응을 억제하는 불순물이 다량 함유되어 있어 RT-PCR에 의한 진단을 위해서는 부적합하였다.
- 박 종자로부터 phenol /chloroform/isoamyl alcohol 주출 방법으로 바이러스를 주출하여 RT-PCR에 의한 종자 검정의 민감도를 조사하였다. 그 결과 1립의 감염종자에 10, 50, 100, 500, 1,000립의 건전종자를 혼합한 감염수준에서 모두 420 bp크기의 증폭된 밴드를 확인하였다(Fig.
- 진단방법의 민감성을 알아보기 위해 1개의 이병 박 종자에 감염되지 않은 건전 종자를 섞어 비율을 조정하였다. 비율은 1립의 이병 종자에 건전 종자10(10%), 50(2%), 100(1%), 500(0.2%), 1,000(0.1%)립의 스준으로 조절하여 마쇄한 후 각각 1g씩 3반복을 취하여 각각의 바이러스 추출 방법에 의해 바이러스를 추출 한 후 RT-PCR에 이용하였다(Wyile 등, 1993).
- 수집에 의해 CGMMV로 의심되는 식물체를 독말풀(Datura stramonium)에서 3번 계대하여 단일 국부 병징을 확인한 후 박에서 증식시켰다. RT-PCR에서 primer와의 특이성 검정을 위하여, 증식된 잎에서 전체 RNA추출은 RNase Plant Mini Kit(QIAGEN)을 이용하여 실시하였다.
- 종자검정을 위한 간편한 바이러스 추출법을 선발하기 위하여, 1 M NaOAc와 95% ethanol을 이용하여 -7CFC에서 침전시킨 후 원심 분리하는 ethanol 침전에 의한 추출(Hildeman 등, 1997), 0.2|im와 0.8 |im filter를 이용한 double filtration에 의한 추출(Paul 등, 1991), 8% polyethylene glycol(PEG) 8, 000을 이용하여 1시간 동안 섞은 후 원심분리하는 PEG 침전에 의한 추출(Lewis 등, 1998) 및 phenol/chloroform/ isoamyl alcohol에 의한 추출(Wylie 등, 1993; Njeru 등, 1997)(Fig. 1)을 시도하였다. 각 추출법에 사용된 박 종자는 1,000립(약 100 g)을 기준으로 사용하였다.
- RT-PCR을 이용해서 종자 감염 여부를 진단하기 위해 원 예연구소에서 건전 종자와 포장에서 80%이상의 CGMMV , 병율을 보이는 박 종자와 수박 종자를 분양 받아 시료 코 사용하였다. 진단방법의 민감성을 알아보기 위해 1개의 이병 박 종자에 감염되지 않은 건전 종자를 섞어 비율을 조정하였다. 비율은 1립의 이병 종자에 건전 종자10(10%), 50(2%), 100(1%), 500(0.
대상 데이터
- 1999~2003년도에 걸쳐 전북과 충남 지방의 박, 수박 재배 포장에서 녹반모자이크 병징을 보이는 개체를 수집하여 실험에 이용하였고, 원예연구소에서 2개의 Potyvims속인 Watermelon mosaic vznw(WMV), Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV), 1개의 Cucumovirus속인 Cucumber mosaic vims(CMV) 그리고 1개의 Tobamovirus 속인 CGMMV-W를 분양 받아 실험에 대조구로 이용하였다.
- RT-PCR을 이용해서 종자 감염 여부를 진단하기 위해 원 예연구소에서 건전 종자와 포장에서 80%이상의 CGMMV , 병율을 보이는 박 종자와 수박 종자를 분양 받아 시료 코 사용하였다. 진단방법의 민감성을 알아보기 위해 1개의 이병 박 종자에 감염되지 않은 건전 종자를 섞어 비율을 조정하였다.
- 1)을 시도하였다. 각 추출법에 사용된 박 종자는 1,000립(약 100 g)을 기준으로 사용하였다.
성능/효과
- 4). Phenol/chloroform/ isoamyl alcohol에 의한 추출법을 이용하여 RT-PCR과 ELISA를 비교해서 진단해본 결과 ELISA반응은 100립의 건전 종자에 1개의 이병 종자를 혼합한 수준(1%)까지 판 별이 가능하였는데, RT-PCR에 의해서는 1,000립의 건전 종자에 1립의 이병 종자를 혼합한 수준(0.1 %)까지 판별 이 가능하였다. 이는 While 등(1993)의 실험에서 1,000립의 건전 종자에 1립의 이병 종자를 혼합한 수준(0.
- 공시된 CGMMV-W 분리주와 포장에서 채집된 CGMMV에 감염된 박, 수박의 이병 잎에서 추출한 전체 RNA와 CGMMV에 감염된 박, 수박의 종자에서 추출한 바이러스를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 420 bp 크기의 증폭된 밴드를 확인하였다. 그러나 공시된 WMV, CMV, ZYMV에 감염된 잎의 전체 RNA 추출물에서는 증폭 산물이 관찰되지 않았다(Fig.
- 박 종자로부터 phenol /chloroform/isoamyl alcohol 주출 방법으로 바이러스를 주출하여 RT-PCR에 의한 종자 검정의 민감도를 조사하였다. 그 결과 1립의 감염종자에 10, 50, 100, 500, 1,000립의 건전종자를 혼합한 감염수준에서 모두 420 bp크기의 증폭된 밴드를 확인하였다(Fig. 4). Phenol/chloroform/ isoamyl alcohol에 의한 추출법을 이용하여 RT-PCR과 ELISA를 비교해서 진단해본 결과 ELISA반응은 100립의 건전 종자에 1개의 이병 종자를 혼합한 수준(1%)까지 판 별이 가능하였는데, RT-PCR에 의해서는 1,000립의 건전 종자에 1립의 이병 종자를 혼합한 수준(0.
- 80%이상의 CGMMV에 오염된 박 종자를 이용하여 ethanol 침전에 의한 추출, double filtration에 의한 추출, PEG 침전에 의한 추출 및 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 바이러스를 추출한 후 RT-PCR을 이용해서 검정하였다. 그 결과 ethanol 침전, double filtration, PEG 침전에 의한 추출법은 RT-PCR에 의해 DNA절편이 증폭되지 않았고, phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 주출법만이 420 bp의 CGMMV 바이러스가 분리되어 DNA절편이 증폭되었다(Fig. 3). 신속하고 간편한 종자검정 방법의 개발을 위하여 종자로부터 바이러스를 간편하게 추출할 수 있는 방법이 필요하다.
- 1 %)까지 판별이 가능한 것과 같은 결과였다. 또한 1,000립이 마쇄된 약 100g으로부터 1 g만을 취하여 검정을 해본 결과 3반복 모두 420 bp 크기의 증폭된 밴드가 확인되어 적은 양으로도 진단이 가능하였다. 본 연구에 의해 개발된 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 주출된 바이러스를 RT-PCR에 의해서 검정하는 방법은 높은 농도의 RT-PCR 반응의 억제인자를 가지고 있는 박 종자로부터 효율적으로 바이러스 입자를 추출하고, 낮은 수준으로 감염되어 있는 종자도 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 방법으로 확인되었다.
- 또한 1,000립이 마쇄된 약 100g으로부터 1 g만을 취하여 검정을 해본 결과 3반복 모두 420 bp 크기의 증폭된 밴드가 확인되어 적은 양으로도 진단이 가능하였다. 본 연구에 의해 개발된 phenol/chloroform/isoamyl alcohol에 의한 주출된 바이러스를 RT-PCR에 의해서 검정하는 방법은 높은 농도의 RT-PCR 반응의 억제인자를 가지고 있는 박 종자로부터 효율적으로 바이러스 입자를 추출하고, 낮은 수준으로 감염되어 있는 종자도 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 방법으로 확인되었다.
- 2). 이 결과로 제작된 primer 들은 CGMMV에 특이성이 있음을 알 수 있다.
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