벼 바이러스(RSV, RBSDV)와 애멸구의 간편한 VC/RT-PCR 유전자 진단기술 Convenient Genetic Diagnosis of Virion Captured (VC)/RT-PCR for Rice Viruses (RSV, RBSDV) and Small Brown Plant Hopper원문보기
우리나라 벼에 발생하는 주요 바이러스 중 애멸구에 의하여 전염하는 벼줄무의잎마름병(RSV)과 벼검은줄오갈병(RBSDV)에 대한 간편한 유전자 진단법인 VCHT-PCR 방법을 개발하였다. 벼 잎의 경우 즙액 추출 완충액은 0.5% sodium sulfite를 첨가한 0.01 M 인산완충액(pH 7.0)을 기본 완충액으로 이용하고 애멸구를 진단할 경우에는 기본 완충액에 2% PVP을 첨가하였을 때 VC/RT-PCR 진단이 잘 되었다. VC/RT-PCR을 이용한 진단에 적합한 RSV와 RBSDV 프라이머를 선발하였고 이것을 이용하여 동시진단으로 경기도 김포, 평택, 시흥지역에서 채집한 애멸구의 RSV와 RBSDV의 보독충을 쉽고 경제적으로 진단 할 수 있었다. ELISA에 의한 진단결과와 비교할 때 세 지역을 합하여 RSV에 대한 평균 보독충률은 9.2%로 동일하였으나 보독충 중 일부가 ELISA와 VC/RT-PCR 두 방법에 의한 진단결과가 다르게 나온 것은 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성을 제시하고 있다. 포장에서 채집한 애멸구의 VC/RT-PCR 진단효율은 RSV와 RBSDV를 동시에 진단하므로 써 RSV만 진단이 가능한 ELISA 결과 보다 3.2% 높았다.
우리나라 벼에 발생하는 주요 바이러스 중 애멸구에 의하여 전염하는 벼줄무의잎마름병(RSV)과 벼검은줄오갈병(RBSDV)에 대한 간편한 유전자 진단법인 VCHT-PCR 방법을 개발하였다. 벼 잎의 경우 즙액 추출 완충액은 0.5% sodium sulfite를 첨가한 0.01 M 인산완충액(pH 7.0)을 기본 완충액으로 이용하고 애멸구를 진단할 경우에는 기본 완충액에 2% PVP을 첨가하였을 때 VC/RT-PCR 진단이 잘 되었다. VC/RT-PCR을 이용한 진단에 적합한 RSV와 RBSDV 프라이머를 선발하였고 이것을 이용하여 동시진단으로 경기도 김포, 평택, 시흥지역에서 채집한 애멸구의 RSV와 RBSDV의 보독충을 쉽고 경제적으로 진단 할 수 있었다. ELISA에 의한 진단결과와 비교할 때 세 지역을 합하여 RSV에 대한 평균 보독충률은 9.2%로 동일하였으나 보독충 중 일부가 ELISA와 VC/RT-PCR 두 방법에 의한 진단결과가 다르게 나온 것은 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성을 제시하고 있다. 포장에서 채집한 애멸구의 VC/RT-PCR 진단효율은 RSV와 RBSDV를 동시에 진단하므로 써 RSV만 진단이 가능한 ELISA 결과 보다 3.2% 높았다.
Genetic diagnosis method of Virion Captured (VC)/RT-PCR for Rice stripe virus (RSV) and Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), Korean major rice viruses transmitted by small brown plant hopper, Laodelphax striatellus, was developed. Virion extraction buffer for rice plant was 0.01M potassium phosp...
Genetic diagnosis method of Virion Captured (VC)/RT-PCR for Rice stripe virus (RSV) and Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), Korean major rice viruses transmitted by small brown plant hopper, Laodelphax striatellus, was developed. Virion extraction buffer for rice plant was 0.01M potassium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.5% sodium sulfite. However, the extraction buffer for L. striatellus was 0.01M potassium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.5% sodium sulfite and 2% polyvinylpyrrolidone wt 40,000 (PVP-40). Specific primers for detection of RSV and RBSDV were selected for VC/RT-PCR method. The specific primers were used as a duplex primer to detect viruliferous small brown plant hopper collected from Gimpo, Pyeongtaek and Siheung areas in Gyeonggi province. The genetic diagnosis methods of single and duplex VC/RT-PCR for RSV and RBSDV could be used easily and economically, especially on the diagnosis of L. striatellus. The rate of viruliferous insect (RVI) for RSV was compared with ELISA and VC/RT-PCR for L. striatellus collected from fields. RVI by ELISA was same as 9.2% with RVI by VC/RT-PCR. However, there were some different detection results between the methods. It could be suggested that there is a possibility of serological and/or genomic differences among RSV isolates. The portion of RVI detected simultaneously by ELISA and VC/RT-PCR was 71.0%, and the detection rate from VC/RT-PCR was higher as 3.2% than that from ELISA, which had a reason of simultaneous detection ability both RSV and RBSDV of VC/RT-PCR.
Genetic diagnosis method of Virion Captured (VC)/RT-PCR for Rice stripe virus (RSV) and Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), Korean major rice viruses transmitted by small brown plant hopper, Laodelphax striatellus, was developed. Virion extraction buffer for rice plant was 0.01M potassium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.5% sodium sulfite. However, the extraction buffer for L. striatellus was 0.01M potassium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.5% sodium sulfite and 2% polyvinylpyrrolidone wt 40,000 (PVP-40). Specific primers for detection of RSV and RBSDV were selected for VC/RT-PCR method. The specific primers were used as a duplex primer to detect viruliferous small brown plant hopper collected from Gimpo, Pyeongtaek and Siheung areas in Gyeonggi province. The genetic diagnosis methods of single and duplex VC/RT-PCR for RSV and RBSDV could be used easily and economically, especially on the diagnosis of L. striatellus. The rate of viruliferous insect (RVI) for RSV was compared with ELISA and VC/RT-PCR for L. striatellus collected from fields. RVI by ELISA was same as 9.2% with RVI by VC/RT-PCR. However, there were some different detection results between the methods. It could be suggested that there is a possibility of serological and/or genomic differences among RSV isolates. The portion of RVI detected simultaneously by ELISA and VC/RT-PCR was 71.0%, and the detection rate from VC/RT-PCR was higher as 3.2% than that from ELISA, which had a reason of simultaneous detection ability both RSV and RBSDV of VC/RT-PCR.
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문제 정의
한편으로 여러 종류의 바이러스 진단 프라이머를 조합하여 한번에 여러 바이러스를 동시에 진단하는 방법이 많이 개발되었으며(Sharman 등, 2000) 또한 우리나라 박과작물에 가장 피해를 일으키는 종자전염 바이러스 3종을 동시에 진단할 수 있는 VC/RT-PCR 유전자 진단기술을 개발하여 이용하고 있다(조 등, 2007). 본 연구는 2008년 벼 바이러스 매개충인 애멸구의보독충률 조사를 전국적으로 실시하면서 간편한 진단법의 개발이 시급함에 따라 개발되어 실용화 하였으며 벼 바이러스 식물체 및 매개충인 애멸구 감염 바이러스에 대한 다중 진단법 인 VC/RT-PCR 유전자 진단법을 보고하고자 한다.
제안 방법
PCR 튜브에 핵산 포착을 위하여 식물체 즙액 또는 애멸구 추출액을 PCR 튜브에 30 μl씩 넣고 37C에서 10분간 처리하였다. 0.05%의 Tween-20를 넣은 인산완충액(lx phosphate buffered saline; PBS)을 세척완충액 (PBST)으로 이용하여 50 M씩 두 번 세척하고 튜브 내부를 깨끗이 비운 후 얼음위로 튜브를 옮겨 nucleasefree water 50 로 한번 더 세척하고 비워진 튜브안에 프라이머와 master mix(Promega, AccessQuick™ RT-PCR System)를 넣어 RT-PCR을 하였다.
ELISA와 VC/RT-PCR 진단 비교. RBSDV 에 대한 ELISA진단키트는 확보할 수 없었으므로 ELISA진단법은 RSV만 수행되었다.
그러나 RDV에감염된 시료는 실험에 이용하지 않았다. VC/RT-PCR 진단법 개발 후 경기도 김포, 시흥, 평택의 벼 노지 포장에서 채취한 애멸구에 대해 유전자 진단하고 결과를 각 지역별 94마리씩 이용하여 일반적인 ELISA진단으로 나타난 결과와 비교 분석하였다.
VC/RT-PCR 진단법은 애멸구를 매개체로 전염되는 RSV 와 RBSDV를 대상으로 감염된 식물체와 애멸구로부터 두 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 개발하였다. 기본완충액 (PPBS+SS)을 이용하여 마쇄한 보독충과 기본완충액에 2% PVP를 첨가하여 마쇄한 보독충을 각각 10배, 100배, 1, 000배로 희석하여 진단하고 바이러스에 감염된 벼 잎은 기본 완충액만을 이용하여 마쇄한 후 진단하였다(Fig.
VC/RT-PCR을 이용한 RSV와 RBSDV 동시검정. 제공받은 벼 바이러스 Triplex primer는 Plasmid DNA와 감염 식물체의 핵산을 이용하여 동시 진단하였을 때 RBSDV 가 235 bp의 증폭산물을 만드는 프라이 머 (RBSDV S-10-C40과 N40, 이하 RBSDV-235로 명함)와 380 bp의 증폭 산물을 만드는 프라이머 (RBSDV S-10-C40과 N30, 이하 RBSDV-380으로 명함)에서 다 진단이 잘 되고 특히, 380 bp 를 이용하고 프라이머 농도를 8pmol로 진단하였을 때 뚜렷하게 3종이 구별되어 진단된다(Fig.
RBSDV 에 대한 ELISA진단키트는 확보할 수 없었으므로 ELISA진단법은 RSV만 수행되었다. 경기도 김포, 평택 및 시흥 지역 노지 포장에서 채집한 월동 애멸구에 대해 RSV를 ELISA 진단하였으며, VC/RT-PCR 진단방법으로는 RSV와 RBSDV 를 동시에 진단하여 그 결과를 비교하였다(Table 1). VC/ RT-PCR에 사용한 진단 프라이머는 RSV-5기과 RBSDV-235를 사용하였다.
동시에 진단할 수 있는 개발하였다. 기본완충액 (PPBS+SS)을 이용하여 마쇄한 보독충과 기본완충액에 2% PVP를 첨가하여 마쇄한 보독충을 각각 10배, 100배, 1, 000배로 희석하여 진단하고 바이러스에 감염된 벼 잎은 기본 완충액만을 이용하여 마쇄한 후 진단하였다(Fig. 3). 571 bp의 산물을 생산하는 RSV 프라이머(RSR4-C10&-N30, 이하 RSV-5기로 명함)를 단독으로 검정했을 때 애멸구는 PVP를 첨가하지 않은 경우 100배 이상 희석할 경우 진단이 잘 되었다.
김 등이 보고한 벼 바이러스 진단용 프라이머를 이용하였다(2007). 벼에 발생하는 RSY RBSDV와 함께 Rice dwarf virus(RDV)를 동시 에 진단할 수 있는 triplex primer를 이용하였으나 본 실험에서는 끝동매미충이 매개하는 RDV감염 식물체에 대한 positive control을 확보하지 못하여 이를 제외하고 두 종의 바이러스 프라이머만 이용하였다. Triplex primer를 구성하는 3종의 프라이머는 식물로부터 분리한 핵산이나 Plasmid DNA를 이용하여 세가지 바이러스를 동시 진단할 수 있도록 개발된 것이다.
Positive control로서 벼 바이러스 RSV와 RBSDV에 복합감염된 벼 식물체는 국립식량과학원에서 분양받아 사용하였으며, 애멸구는 RSV 감염 식물체에 흡즙시켜 보독충을 만들어 사용하였다. 보독애멸구는 한 마리씩 사용하거나, 애멸구를 병든 식물체에서 사육하여 보독충률이 40% 이상되었을 때 애멸구 10 마리를 한 개의 시료로 하여 보독 애멸구 감염 positive control 시료로 사용하였다. 벼 바이러스 감염 식물체 시료는 이전에 RSV 감염이 확인된 포장 시료의 조 즙액을 이용하여 positive control로 사용하였다.
VC/RT-PCR 진단과정 및 즙액추출 완충액. 식물체 즙액 추출 완충액과 애멸구 마쇄용 기본 완충액(PPBS+SS) 은 산화방지제인 sodium sulfite(0.5%)가 들어간 0.01 M 인산완충액 (PPBS; potassium phosphate buffer, pH 7.0)으로 첨가제로서 BSA(0.5%)나 Triton X-100(l%)을 적용한 실험을 하였으며, 애멸구 마쇄의 경우 PVP-40Q%)를 추가하여 실험하였다. PCR 튜브에 핵산 포착을 위하여 식물체 즙액 또는 애멸구 추출액을 PCR 튜브에 30 μl씩 넣고 37C에서 10분간 처리하였다.
RSV 단독 검정. 식물체와 애멸구의 RSV 유전자 진단의 안전성 확인을 위하여 RSV 단독으로 VC/RT-PCR 진단을 하였다. 식물체 진단의 경우에는 PPBS+SS와 0.
우리나라 벼에 발생하는 주요 바이러스 중 애멸구에 의하여 전염하는 벼줄무늬잎마름병(RSV)과 벼검은줄오갈병 (RBSDV)에 대한 간편한 유전자 진단법인 VC/RT-PCR 방법을 개발하였다. 벼 잎의 경우 즙액 추출 완충액은 0.
증폭조건 및 전기영동. 유전자 증폭을 위한 조건은 42℃, 30분-»94℃, 10분—[95℃, 30초—50℃ or 52℃ or 55℃, 1 분—72℃—1 분30초]35회t72℃, 5분처리로 하였다. 증폭된 생산물은 1.
대상 데이터
벼 바이러스 감염 시료. Positive control로서 벼 바이러스 RSV와 RBSDV에 복합감염된 벼 식물체는 국립식량과학원에서 분양받아 사용하였으며, 애멸구는 RSV 감염 식물체에 흡즙시켜 보독충을 만들어 사용하였다. 보독애멸구는 한 마리씩 사용하거나, 애멸구를 병든 식물체에서 사육하여 보독충률이 40% 이상되었을 때 애멸구 10 마리를 한 개의 시료로 하여 보독 애멸구 감염 positive control 시료로 사용하였다.
RSV 프라이머는 RSV의 4개 RNA중 가장 작은 RNA4의 일부분인 571 base pair(bp) 를 증폭하는 RSR4-C10와 RSR4-N30이 었다. RBSDV는 segmentlO 의 235 bp 를 증폭하는 RBSDV-S10-C40 와 RBSDV-S10-N40, 그리고 380bp를 증폭하는 RBSD-S10-C40 와 RBSD-S10-N30을 이용하였다.
경기도 김포, 평택 및 시흥 지역 노지 포장에서 채집한 월동 애멸구에 대해 RSV를 ELISA 진단하였으며, VC/RT-PCR 진단방법으로는 RSV와 RBSDV 를 동시에 진단하여 그 결과를 비교하였다(Table 1). VC/ RT-PCR에 사용한 진단 프라이머는 RSV-5기과 RBSDV-235를 사용하였다. 평택 지역의 애멸구에 대한 RSV 보독충률은 ELISA와 VC/RT-PCR 결과가 동일하였으나 김포 지 역은 ELISA 결과가 높았고 시흥 지 역은 VC/RT-PCR 결과가 높아 일반적으로 유전자 진단 결과가 높은 것과는 일치하지 않았다(Fig.
2% agarose gel에서 100 V 전압으로 40분 전기영동 하였다. 한천이 녹으면 한천액 100 ml 에 Goldview 5 μl를 넣고 전기 영동 틀에서 젤을 굳혀서 사용하였다. 증폭산물은 시료당 3~5 μl를 loading buffer와 같이 섞어서 전기영동하였다.
이론/모형
Triplex primer를 구성하는 3종의 프라이머는 식물로부터 분리한 핵산이나 Plasmid DNA를 이용하여 세가지 바이러스를 동시 진단할 수 있도록 개발된 것이다. 이러한 세 종류의 프라이머중 RSV 진단용 프라이 머와 RBSDV 프라이 머를 VC/RT-PCR진단법 개발에 이용하였다. RSV 프라이머는 RSV의 4개 RNA중 가장 작은 RNA4의 일부분인 571 base pair(bp) 를 증폭하는 RSR4-C10와 RSR4-N30이 었다.
성능/효과
3). 571 bp의 산물을 생산하는 RSV 프라이머(RSR4-C10&-N30, 이하 RSV-5기로 명함)를 단독으로 검정했을 때 애멸구는 PVP를 첨가하지 않은 경우 100배 이상 희석할 경우 진단이 잘 되었다. 그러나 PVP를 넣었을 때는 10배 희석 시료의 경우를 제외하면 원액부터 모든 희석액에서 VC/RT-PCR이 잘 되었다.
VC/RT-PCR을 이용한 진단에 적합한 RSV와 RBSDV 프라이머를 선발하였고 이것을 이용하여 동시진단으로 경기도 김포, 평택, 시흥지역에서 채집한 애멸구의 RSV와 RBSDV의 보독충을 쉽고 경제적으로 진단 할 수 있었다. ELISA에 의한 진단결과와 비교할 때 세 지역을 합하여 RSV에 대한 평균 보독충률은 9.2%로 동일하였으나 보독충 중 일부가 ELISA와 VC/RT-PCR 두 방법에 의한 진단결과가 다르게 나온 것은 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성을 제시하고 있다. 포장에서 채집한 애멸구의 VC/RT-PCR 진단효율은 RSV와 RBSDV 를 동시에 진단하므로 써 RSV만 진단이 가능한 ELISA 결과 보다 3.
2%로 동일하여(가는 흰 화살표) 시료수가 많아질 경우 두 진단 방법 간에 신뢰성은 동일한 것으로 생각된다. RBSDV의 애멸구 보독충률은 평택과 시흥지 분포하고 있었으며, 두 바이러스에 복합 감염된 보독 애멸구는 없었다.
0)을 기본 완충액으로 이용하고 애멸구를 진단할 경우에는 기본완충액에 2% PVP을 첨가하였을 때 VC/RT-PCR 진단 이잘 되었다. VC/RT-PCR을 이용한 진단에 적합한 RSV와 RBSDV 프라이머를 선발하였고 이것을 이용하여 동시진단으로 경기도 김포, 평택, 시흥지역에서 채집한 애멸구의 RSV와 RBSDV의 보독충을 쉽고 경제적으로 진단 할 수 있었다. ELISA에 의한 진단결과와 비교할 때 세 지역을 합하여 RSV에 대한 평균 보독충률은 9.
또한 바이러스 감염된 벼 잎의 경우 RBSDV-235 단독 프라이머 진단에서 RBSDV 단독감염된 벼 잎은 밴드가 잘 나타났고 RSV와 RBSDV가 각각 감염된 벼 잎을 갈아 동량 섞은 즙액에서는 RBSDV밴드가 다소 약하게 나타났다. 두 바이러스 프라이머를 동시에 넣어 진단했을 경우 RBSDV 단독 감염 벼 잎은 약하게 밴드가 나타났으나 RSV와 RBSDV 감염주를 섞은 즙액에서 RSV는 잘 진단되었으나 RBSDV 밴드가 나타나지 않았다. 이것은 RSV-571 프라이머가 매우 안정적임을 보여주는 결과이며 RBSDV-235의 경우는 RSV-571 프라이머와 섞여 쓸 경우 다소 불안정하나 진단은 가능한 것으로 판단된다.
RSV-571 프라이 머와 RBSDV-235 프라이머를 섞어 동시에 VC/RT-PCR 진단한 결과도 PVP를 첨가하였을 때 RSV 감염 애멸구의 바이러스가 진단이 잘 되었다. 또한 바이러스 감염된 벼 잎의 경우 RBSDV-235 단독 프라이머 진단에서 RBSDV 단독감염된 벼 잎은 밴드가 잘 나타났고 RSV와 RBSDV가 각각 감염된 벼 잎을 갈아 동량 섞은 즙액에서는 RBSDV밴드가 다소 약하게 나타났다. 두 바이러스 프라이머를 동시에 넣어 진단했을 경우 RBSDV 단독 감염 벼 잎은 약하게 밴드가 나타났으나 RSV와 RBSDV 감염주를 섞은 즙액에서 RSV는 잘 진단되었으나 RBSDV 밴드가 나타나지 않았다.
Table 2와 같다. 채집한 모든 애멸구에 대해 ELISA 와 VC/RT-PCR 두 방법에서 모두 보독충으로 진단된 애멸구의 비율은 71%이었다. 그러나 ELISA 방법에 의하여서만 보독충으로 진단된 비율은 12.
VC/ RT-PCR에 사용한 진단 프라이머는 RSV-5기과 RBSDV-235를 사용하였다. 평택 지역의 애멸구에 대한 RSV 보독충률은 ELISA와 VC/RT-PCR 결과가 동일하였으나 김포 지 역은 ELISA 결과가 높았고 시흥 지 역은 VC/RT-PCR 결과가 높아 일반적으로 유전자 진단 결과가 높은 것과는 일치하지 않았다(Fig. 5). 그러나 RSV의 평균 보독충률은 9.
2%로 동일하였으나 보독충 중 일부가 ELISA와 VC/RT-PCR 두 방법에 의한 진단결과가 다르게 나온 것은 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성을 제시하고 있다. 포장에서 채집한 애멸구의 VC/RT-PCR 진단효율은 RSV와 RBSDV 를 동시에 진단하므로 써 RSV만 진단이 가능한 ELISA 결과 보다 3.2% 높았다.
후속연구
2% 높았다. 그러나 RSV 보 독충의 13~16%는 두 방법에서 다르게 진단이 되었으므로 단백질 특성으로 진단하는 ELISA와 유전자 차이로 진단하는 VC/RT-PCR진단법의 특성을 고려해 볼 때 우리나라에 발생하는 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성이 앞으로 검토하여야 할 것으로 생각된다.
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