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문제 정의
- 이때 사용되는 유전자 표지는 소의 품종 세 따라 매우 다양하게 발현되어 개체 확인 정확도를 높이기 위해 한우 집단에서 대상 유전자 표지의 유전자형 발현 양상 을 분석하여 최적의 표지 유전자 표지를 설정하는 것이 필요 화다. 따라서 본 연구는 한우의 원산지 추적 및 개체식별 검 증 시스템에서 절절히 사용할 수 있도록 생체 유전자 감식 기법에 소요되는 유전자 표지(genetic marker)를 개발하기 위해 수행되었다. 공시재료로는 후보 유전자 표지의 광범위한 한우집단 발현특성의 분석을 위해 국가 후대검정 집단 740두 를 활용하였으며 도축되기 전 단계의 생축에서 분석된 유전 자형과 도축 후 유통과정에서 분석된 유전자형을 이용한 개 체 확인 여부의 검증을 위해 국내 브랜드한우 농가로부터 출 하된 4두를 분석에 공시하였다.
- 또한 현재 개발된 일부의 유전 자 표지를 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있어 좀더 유용한 유전자 표지에 의해 한우 개체 식별과 원산지 검증을 위한 유효성이 입증될 수 있도록 다양한 개체 확인 정확도를 확보할 수 있도록 한우의 개체식별을 위한 충분한 수의 유전자 표지 가 개발될 필요가 있다. 따라서 본 연구는 한우집단에서 특이적으로 발현되는 초위성체 DNA의 유전 자형 발현 양상을 분석하고 이들의 유용성을 확인하여 개체 확인 및 원산지 추적 검증을 위한 유전자 표지를 설정하고 이에 따른 분석 절차에 관련된 모델을 제시하고자 실시하였다.
- 본 연구는 농촌진흥청 바이오 그린 21사업의 2003년도 과제인 “한우 경제형질 QTL 탐색 및 응용기술개발”의 일환으 로 수행되었다. 농촌진흥청 바이오 그린21사업단 관계자들과 시료를 제공한 축산연구소 및 한우개량사업부 관계자들에게 깊은 감사를 드리는 바입니다.
제안 방법
- 공시재료로는 후보 유전자 표지의 광범위한 한우집단 발현특성의 분석을 위해 국가 후대검정 집단 740두 를 활용하였으며 도축되기 전 단계의 생축에서 분석된 유전 자형과 도축 후 유통과정에서 분석된 유전자형을 이용한 개 체 확인 여부의 검증을 위해 국내 브랜드한우 농가로부터 출 하된 4두를 분석에 공시하였다. 후보 유전자 표지는 염색체 1번과 14번에서 확인되어 보고된 16종의 초위성체 DNA의 염기서열 정보를 이용하였다. 한우집단에서 나타난 각각의 대상 유전자 표지의 유전자형 분석결과를 보면 대립유전자 는 최소 3개에서 최대 12였으며 이형접합체 발현율은 0.
- 공시재료로는 후보 유전자 표지의 광범위한 한우집단 발 현특성의 분석을 위해 국가 후대검정 집단 740두(한우 개량 을 위해 축산연구소에서 검정에 공시된 후대검정용 송아지) 를 활용하였으며 도축되기 전 단계의 생축에서 분석된 유전 자형과 도축 후 유통과정에서 분석된 유전자형을 이용한 개 체 확인 여부의 검증을 위해 국내 브랜드한우 농가로부터 출 하된 4두(축산진흥공사내 도축 한우)를 분석에 공시하였다. 이들 집단에서 특이적으로 발현되는 유전자 표지의 유전자 형 분석을 위해 초위성체 DNA를 활용하였으며 이들의 유전 자형을 얻기 위해 16종류의 대상 MS를 설정하고 이들의 유 전자 표지 분석을 가능하도록 하는 유전자형 진단용 Primer 를 국내 전문회사에서 주문 제작하였다(Table 1).
- , 1988). PCR증폭 반응은 형광 염색된 microsatellites의 색상과 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 multiplex PCR을 수행하였고, 일부의 microsatellites는 단일 marker로서 PCR을 수행하였다. GeneAmp 9700(Applied Biosystems)에서 각 반응 액의 총량을 10 11L PCR reaction으로 하고 약 50 ng template DNA, 20 ng each primer, 1.
- 25% nonidet P40 and 20 mM MgCb) 을 이용하여 95 ℃ 에서 5 분간 첫 반응을 시작하여, 94 ℃ 에서 30초, microsatellites marker에 따라 53~55℃에서 1분간, 72℃에서 1분으로 35회 반복반응을 실시하고 마지막으로 신장 반응은 72℃에서 10분간 실시하여 종료하였다. PCR 수행 후 증폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard 와 잘 혼합하여, 5% polyacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer(Applied Biosystems)를 사용하였다. Genescan analysis software(version 3.
- , 2002) 한우집단에서 원산지 추적에 따른 유전자 감식 기법의 적용을 위해 가장 적합한 유전자 표지를 설정하는 것이 중요하다. 이를 위해 본 연구에서는 발현 빈도가 5% 및 10% 이상의 대립유전자를 보이는 유전자 표지를 유효한 것으로 제시하였으며 각각의 표지 유전자를 적용하였을 때 서로 다른 개체가 우연히 동일한 유전자형 을 나타낼 수 있는 확률을 추정 하였다. Table 4에서 보면 발현되는 대 립 유전자들이 3개부터 약 6개까지 보이는 유전자 표지가 매우 유효하게 활용될 수 있는 것으로 판단된다.
- 원산 지 여부와 관련된 보다 정밀한 검증을 위해서는 개체 확인 정확도를 더욱 높여 오류 확률을 원천적으로 0% 가까이 할 경우 본 연구에서 제시된 6~7종의 유전자 표지와 더불어 3~4개 내외의 유전자 표지가 추가로 분석될 경우 가능할 것으로 보여진다. 개체 확인 분석을 위해 동원 전 시료 740두를 검증한 결과 개체 인식 정확도를 제시하였다(Table 4).
- 또한 실제의 원산지 소 유전자 정보와 도축 후 과정을 거 친 도축 산물간의 동일성 검증을 위한 실험을 실시하였다 (Table 5). 4마리의 한우(ID-1, 2, 3, 4)는 생축상태에서 분석된 정보를 나타내었으며 분석한 이들로부터 도축된 후 각각 개 체로부터 부분육 상태로 해체된 한우 고기시료를 동일 개체 당 2개의 시료로 채취였으며 이 개체와 무관한 다른 개체의 시료를 임의로 선정하여 분석한 결과를 비교하였으며 각각 개체마다 시료들 분석에 동일 여부를 검사하였다.
- 또한 실제의 원산지 소 유전자 정보와 도축 후 과정을 거 친 도축 산물간의 동일성 검증을 위한 실험을 실시하였다 (Table 5). 4마리의 한우(ID-1, 2, 3, 4)는 생축상태에서 분석된 정보를 나타내었으며 분석한 이들로부터 도축된 후 각각 개 체로부터 부분육 상태로 해체된 한우 고기시료를 동일 개체 당 2개의 시료로 채취였으며 이 개체와 무관한 다른 개체의 시료를 임의로 선정하여 분석한 결과를 비교하였으며 각각 개체마다 시료들 분석에 동일 여부를 검사하였다.
대상 데이터
- 따라서 본 연구는 한우의 원산지 추적 및 개체식별 검 증 시스템에서 절절히 사용할 수 있도록 생체 유전자 감식 기법에 소요되는 유전자 표지(genetic marker)를 개발하기 위해 수행되었다. 공시재료로는 후보 유전자 표지의 광범위한 한우집단 발현특성의 분석을 위해 국가 후대검정 집단 740두 를 활용하였으며 도축되기 전 단계의 생축에서 분석된 유전 자형과 도축 후 유통과정에서 분석된 유전자형을 이용한 개 체 확인 여부의 검증을 위해 국내 브랜드한우 농가로부터 출 하된 4두를 분석에 공시하였다. 후보 유전자 표지는 염색체 1번과 14번에서 확인되어 보고된 16종의 초위성체 DNA의 염기서열 정보를 이용하였다.
- 공시재료로는 후보 유전자 표지의 광범위한 한우집단 발 현특성의 분석을 위해 국가 후대검정 집단 740두(한우 개량 을 위해 축산연구소에서 검정에 공시된 후대검정용 송아지) 를 활용하였으며 도축되기 전 단계의 생축에서 분석된 유전 자형과 도축 후 유통과정에서 분석된 유전자형을 이용한 개 체 확인 여부의 검증을 위해 국내 브랜드한우 농가로부터 출 하된 4두(축산진흥공사내 도축 한우)를 분석에 공시하였다. 이들 집단에서 특이적으로 발현되는 유전자 표지의 유전자 형 분석을 위해 초위성체 DNA를 활용하였으며 이들의 유전 자형을 얻기 위해 16종류의 대상 MS를 설정하고 이들의 유 전자 표지 분석을 가능하도록 하는 유전자형 진단용 Primer 를 국내 전문회사에서 주문 제작하였다(Table 1).
데이터처리
- 0)를 이용하여 microsatellites loci별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다. 대립 유전자형에 따라 관측된 이형질성 (Observed heterozygosity) 및 대립 유전자 빈도는 MS toolkit s/w(Park et al., 2000)를 이용하였으며 분석된 MS 좌위별 집단에 대한 전체 이형질성(HT)은 Nei(1972, 1978)의 방법을 통해 SAS Package을 사용하였다.
이론/모형
- 소 혈액 및 조직시료에서의 genomic DNA의 분리와 정제는 Miller의 방법을 준용하여 수행하였다(Miller et al., 1988). PCR증폭 반응은 형광 염색된 microsatellites의 색상과 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 multiplex PCR을 수행하였고, 일부의 microsatellites는 단일 marker로서 PCR을 수행하였다.
- PCR 수행 후 증폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard 와 잘 혼합하여, 5% polyacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer(Applied Biosystems)를 사용하였다. Genescan analysis software(version 3.1)을 이용하여 각 PCR 단편들의 크기를 3차원 최소자승법(TDird order least squares method)으로 분석 하였고, Genotyper analysis soft- ware(version 2.0)를 이용하여 microsatellites loci별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다. 대립 유전자형에 따라 관측된 이형질성 (Observed heterozygosity) 및 대립 유전자 빈도는 MS toolkit s/w(Park et al.
성능/효과
- 824였다. 유효대립유전자수는 각각의 대상 유전자마다 3~7의 범위를 보였으며 이들 중 6개의 유전자 표지를 설정 하여 개체 확인을 실시할 경우 100%에 가까운 정확도가 나타난 것으로 추정되었다.
- Table 2에 따르면 각각의 염색체별 초위성체 DNA(유전자 표지)에 대한 한우 집단에 개체별 유전자형 출현 특성을 볼 수 있다. 증폭된 각 유전자 표지 유전자형 분석에서 대 립 유전 자는 평균 7~8개가 나타냈으며 각 표지유전자들로부터 발현 되는 대립 유전자의 이형 접합체 율(heterozygosity)은 0.20 ~ 0.85를 보였으며 이는 한우 집단에서는 이들 표지유전자의 발현 양, 이 매우 다양하다는 것을 보여주고 있다. 유전자 감 식용 대상 유전자 표지로서는 0.
- 또한 개체 확인 정 확도를 높이 기 위해 한우 집 단에서 분석된 결과를 기준으로 전체 출현되는 대립유전자중에서 유효 대립유 전자가 상대적으로 많은 경우에 한우의 유전자 분석에 적합한 유전자 표지로 설정될 수 있을 것으로 생각된다. 제시된 결과(Table 2)에서 보면 약 7종(MCM130(M3), BM1508(M8), BMS1747(M9), BL1009(M12), RM18O(M11), BM4305(M14),BM6425(M16))의 primer에 의해 한우 집단에서 유전자 감식 을 위한 유전자 표지로 설정될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이는 실제 유전자감식방법을 적용하기 위해 유용한 대립유전자의 선별을 통해 multiplex PCR 수 행 등 분석 효율을 높이기 위해 다양한 크기의 대립유전자가 발현되는 유전자 표지가 선정되는 것이 바람직하다. 본 연구에서 분석된 한우 집단의 경우 발현되는 대립유전자수가 최 소 2종 내에서 13종까지 다양하게 발현되었다. 유전자 감식 을 통해 한우 개체를 확인하기 위해서 6~7개의 대립유전자 발현될 경우 분석의 효율성 면에서 가장 바람직한 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 분석된 한우 집단의 경우 발현되는 대립유전자수가 최 소 2종 내에서 13종까지 다양하게 발현되었다. 유전자 감식 을 통해 한우 개체를 확인하기 위해서 6~7개의 대립유전자 발현될 경우 분석의 효율성 면에서 가장 바람직한 것으로 판단된다.
- 또한 유전자 감식을 위해 몇 종류의 유전자 표지를 사용할 것인가 하는 여부는 분석 비용과 분석에 소요되는 시간에 좌우됨으로 적정 개체 확인 정확도 설정을 통한 활용 유전자 표지 결정은 매우 중요하다. 본 분석에서 보면 3종 (M3, M8, M9)의 유전자 표지를 설정하여 유전자 감식을 할 경우 서로 다른 개체에서 분석한 유전자형 분석 결과가 동일 하게 나타날 확률은 0.05%(p=0.0005)정도로 추정된다. 원산 지 여부와 관련된 보다 정밀한 검증을 위해서는 개체 확인 정확도를 더욱 높여 오류 확률을 원천적으로 0% 가까이 할 경우 본 연구에서 제시된 6~7종의 유전자 표지와 더불어 3~4개 내외의 유전자 표지가 추가로 분석될 경우 가능할 것으로 보여진다.
- 분석 결과에서 보면 개체별 2개의 시료는 유전자분석 결과가 서로 완벽하게 일치하고 있다는 것(0)을 보여주고 있으며 다른 하나에 대한 분석한 결과는 전혀 다른 개체임을 보 , 였는데 생체 상태에서 분석한 결과와 다르게 나타난 것(X)을 갈 수가 있다. 따라서 생체 상태의 유전자검사 결과와 DNA .
- 따라서 생체 상태의 유전자검사 결과와 DNA .기 채취가 가능한 도축 후 어느 단계에서조차 분석한 유전자 형 정보가 비교됨으로써 개체의 진위 여부를 확인할 수 있는 것으로 판단된다.
- 본 연구결과를 통해 보면 한우 집단에서 특이적으로 발현 도]는 유전자 표지(일명:초위성체 DNA(microsatellite))를 통한 유전자분석 기법을 활용함으로써 개체의 생체 상에 나타나는 유전자형 관련 프로파일을 디지털정보로 전환하여 D/B로 저장할 수 있다. 또한 이러한 시스템은 국내의 브랜드 한우 등 특정 경로를 통해 유통되는 축산 물류시스템에 적용하여 원산지의 정보에 대한 검증 수단을 제공함으로서 일본 등의 축산물 안심 시스템과 유사한 기능이 수행될 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 그러나 이들 유전자표지는 부분적으로 한 우에서 유전자 감식방법으로 활용할 경우 유용성 및 개체 확 인 정확도가 낮아질 수 있다. 또한 현재 개발된 일부의 유전 자 표지를 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있어 좀더 유용한 유전자 표지에 의해 한우 개체 식별과 원산지 검증을 위한 유효성이 입증될 수 있도록 다양한 개체 확인 정확도를 확보할 수 있도록 한우의 개체식별을 위한 충분한 수의 유전자 표지 가 개발될 필요가 있다. 따라서 본 연구는 한우집단에서 특이적으로 발현되는 초위성체 DNA의 유전 자형 발현 양상을 분석하고 이들의 유용성을 확인하여 개체 확인 및 원산지 추적 검증을 위한 유전자 표지를 설정하고 이에 따른 분석 절차에 관련된 모델을 제시하고자 실시하였다.
- 6이상의 이형 접합율을 보이는 유전자 표지(M, 를 선발 대상으로 제안될 수 있다. 또한 개체 확인 정 확도를 높이 기 위해 한우 집 단에서 분석된 결과를 기준으로 전체 출현되는 대립유전자중에서 유효 대립유 전자가 상대적으로 많은 경우에 한우의 유전자 분석에 적합한 유전자 표지로 설정될 수 있을 것으로 생각된다. 제시된 결과(Table 2)에서 보면 약 7종(MCM130(M3), BM1508(M8), BMS1747(M9), BL1009(M12), RM18O(M11), BM4305(M14),BM6425(M16))의 primer에 의해 한우 집단에서 유전자 감식 을 위한 유전자 표지로 설정될 수 있을 것으로 판단된다.
- 0005)정도로 추정된다. 원산 지 여부와 관련된 보다 정밀한 검증을 위해서는 개체 확인 정확도를 더욱 높여 오류 확률을 원천적으로 0% 가까이 할 경우 본 연구에서 제시된 6~7종의 유전자 표지와 더불어 3~4개 내외의 유전자 표지가 추가로 분석될 경우 가능할 것으로 보여진다. 개체 확인 분석을 위해 동원 전 시료 740두를 검증한 결과 개체 인식 정확도를 제시하였다(Table 4).
- 본 연구결과를 통해 보면 한우 집단에서 특이적으로 발현 도]는 유전자 표지(일명:초위성체 DNA(microsatellite))를 통한 유전자분석 기법을 활용함으로써 개체의 생체 상에 나타나는 유전자형 관련 프로파일을 디지털정보로 전환하여 D/B로 저장할 수 있다. 또한 이러한 시스템은 국내의 브랜드 한우 등 특정 경로를 통해 유통되는 축산 물류시스템에 적용하여 원산지의 정보에 대한 검증 수단을 제공함으로서 일본 등의 축산물 안심 시스템과 유사한 기능이 수행될 수 있을 것으로 생각된다. 따라서 이러한 분석 과정은 살아 있는 소에서 혈액 , >]나 모근(털뿌리 부분이 포함된 세포)으로부터 분석된 유전 자 감식정보와 도축 후 고기 시료로부터 분석된 유전자감식 정보를 비교할 경우 동일한 개체로부터 유래된 경우에는 00% 동일한 결과를 얻게 된다.
- 그러나 본 연구 결과를 통해서 보면 시료를 이동하고 분석하는 과정상 .기 오류 개연성과 분석 기자재마다 유전자형 분석 결과의 변 , >]성 등의 한계를 가질 수 있어 검증 기관의 국가 차원의 표 준화 및 공인 분석 가능 기관의 선정 조건이 이루어져야 공 신력 있는 활용이 이루어질 수 있을 것으로 생각된다.
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