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문제 정의
- 더불어 우리나라에서는 생선회와 어패류의 소비가 증가함에 따라 Vibriopara- haemolyticus에 의한 식중독 발생 억제 방안의 확립이 필요한 실정이다. 따라서 본 연구는 독성이 없는 새로운 천연식품 보존제의 개발을 위하여 식품 및 향신료로서 적용 범위가 광범위한 산초를 대상으로 Vibrio parahaemolyticus°1] 대한 천연 항균제의 적용 가능성을 검토하였다. 산초나무 추출물의 항균 작용을 알아보기 위해서 Vibrioparahaemolyticus에 대한 항균력 분석에서 종자를 제외한 성분으로 제조한 산초의 주정 추출물이 효과가 가장 우수함을 확인하였으며, 이 추출물의 온도 및 pH에 대한 안정성을 검토한 결과 다양한 범위의 온도, pH에 대해서 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 산초는 구중제, 해독 살 중 약, 감기약 등에 이르기까지 그 용도가 다양하다(7). 이에 본 연구는 예로부터 향신료로 사용되고 있는 산초의 Vibrio parahae- m况yticus에 대한 항균 활성의 확인과 물리적인 특징 및 그 유효성분을 파악하고 식품에서의 적용 방안을 모색하고자 하였다.
제안 방법
- 10 mL LB broth에 서 16시간 배양한 Vibrio parahaemo lyticus 균주를 10, 000배까지 0.85% 생리식염수를 이용하여 단계별로 희석한 후 각각 0.1 mL씩을 균일하게 LB agar 배지에 접종하였다. 이 도말된 배지상에 1() mm 0 paper disk를 일정한 간격으로 놓고 시험용액 S1A, SIB, SIC, S1D, S2A, S2B, S2C, S2D 및 주정을 각각 40 虬씩 떨어뜨린 후 37°C에서 배양 시 킨 결과, 시험용액 S1C와 S1D는 2.
- 산초 추출물의 최소저해농도는 Turbidimetric Assay법 (11) 을 이용하여 실험하였다. LB broth에서 16시간 배양한 Vibrioparahaemolyticus 배양액을 100 mL LB broth에 0.1% 접 종한 후, 시험 용액을 0%, 0.5%, 5%의 농도로 각각 첨가한 다음, 37°C에서 배양하면서 시간대별 균체량 변화를 Spec trophotometer ( UV-1601 Shimazu, Kyoto Japan)를 이용하여 620 nm에서 측정한 흡광도를 통해서 조사하였다.
- 시료는 서울 경동시장에서 구입하였으며, 산초의 종자(씨 ) 부분(S1)과 종자를 제외한 부분(S2; 과피, 잎, 가지)으로 분류하여 60°C에서 24시간 열풍건조시킨 후 사용하였다. S1과 S2를 각각 분쇄하여 균질화시킨 후 10 g씩을 취해 증류수 100 mL를 가하고 100°C로 감압 증류하여 증류액 S1A와 S2A를 얻었으며, 별도로 증류 잔류물을 여과지(Whatman No. 2)에 통과 시켜 잔사 추출액 S1B와 S2B를 얻어 시험용액으로 사용하였다. 또한, 위와 동일한 방법으로 S1과 S2를 각각 취하여 주정 (95% ethanol, prethanol A) 100 mL를 가하고 65°C에서 감압 증류하여 증류액 S1C와 S2C를 얻었으며, 별도로 증류 잔류물을 여 과하여 잔사 추출액 S1D와 S2D를 얻어 이를 시험용액으로 사용하였다(Fig.
- 1 mL가 도말된 LB agar 배지에 얹어 생육저해환의 직경을 측정함으로서 온도에 대한 안전성 시험을 실시하였다(10). pH 안전성은 시험용액을 phosphoric acid, ammonium solutiorr을 이용하여 pH 4, 6, 7, 8, 10으로 각각 처리한 후, 37°C에서 1시간 방치한 다음 다시 pH 7로 중화 시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육 저해 환의 직경을 측정하였다.
- 1 mL를 취하여 LB agar 배지 상에 고르게 도말하였다. 각각의 도말된 LB agar 배지에 멸균된 10 mm 0 paper disk를 얹고 시험 용액 S1A, SIB, SIC, SID, S2A, S2B, S2C, S2D 및 주정을 각각 40 UL씩 paper disk에 떨어뜨려 건조 시 킨 후 37°C에서 24시간 배양하여 disk 주위에 형성된 생육저해환의 직경을 측정함으로써 항균력을 시험하였다. 이때 대조 구로는 증류수 및 주정을 paper disk에 동일하게 접종하여 측정하였다.
- 이때 대조 구로는 증류수 및 주정을 paper disk에 동일하게 접종하여 측정하였다. 또한 항균성 시험에서 가장 우수한 Vibrio 생육 저 해능을 보인 시험 용액에 대하여 주정 및 증류수를 이용하여 1 〜1乂10, 배까지 희석하고 이를 disk method를 이용하여 최저 저 해 농도를 확인하였다.
- 2)에 통과 시켜 잔사 추출액 S1B와 S2B를 얻어 시험용액으로 사용하였다. 또한, 위와 동일한 방법으로 S1과 S2를 각각 취하여 주정 (95% ethanol, prethanol A) 100 mL를 가하고 65°C에서 감압 증류하여 증류액 S1C와 S2C를 얻었으며, 별도로 증류 잔류물을 여 과하여 잔사 추출액 S1D와 S2D를 얻어 이를 시험용액으로 사용하였다(Fig. 1)(8).
- 산초 추출물 S2C의 항균 활성 물질은 GOMS를 이용하여 분리, 동정하였다(Fig. 4). GC-MS로부터 분리된 peak의 mass spectrum 및 표준물질의 mass spectrum을 확인한 결과, 산초 추출물의 항균 활성 성분은 estragole(4~allyl ani~ sole)로 동정 되었다.
- 항균성 시험에서 가장 우수한 Vibrio 생육 저 해능을 보인 시험용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 시험용액을 밀폐 된 용기에 담아 40, 60, 80, 10OC에서 각각 30분간 열처리한 후 멸균된 10 mm 0 paper disk에 40 1丄씩 을 떨어뜨린 후 Vibrio parahaemolyticus 배 양액 0.1 mL가 도말된 LB agar 배지에 얹어 생육저해환의 직경을 측정함으로서 온도에 대한 안전성 시험을 실시하였다(10). pH 안전성은 시험용액을 phosphoric acid, ammonium solutiorr을 이용하여 pH 4, 6, 7, 8, 10으로 각각 처리한 후, 37°C에서 1시간 방치한 다음 다시 pH 7로 중화 시켜 열 안정성 시험과 같은 방법으로 생육 저해 환의 직경을 측정하였다.
- 시험용액의 항균 성분은 GC-MS(Agilent 6890/Agilent 5973N, USA)을 이용하여 분석하였다. Column은 HP-1 (Crosslinked Methyl Siloxane; 25 mx0.
- 앞선 실험 결과에서 얻어진 시험용액 S2C의 최소저해 농도를 기준으로 배지에 주입 시 물에의 해 희석 되 어 지는 농도를 고려하여 각각 0, 0.5, 5%의 농도로 성장배지를 제조하였 다. 이렇게 제조된 성징 배지에 Vibrio parahaemolyticus를 접종하여 산초 추출물이 성장에 미치는 영향을 검토한 결고卜, 산초 추출물을 첨가하지 않은 경우 균수가 2시간 이후부터 급속히 증가하여 24시간 후 약 10 log CFU/mL까지 성장하였으며, 반면에 산초 추출물 0.
- 0 UL( Split ration 二 30 : 1)이며, ionization voltage는 70 eV로 하였다. 항균물질의 동정은 GC-MS에 의해서 얻은 total ion chromatogram에서 분리된 peak의 mass spec trum^]- Wiley NBS를 사용한 library search system을 이 용 하여 동정하였으며, 표준물질(Aldrich Chemical Co., USA) 을 구입하여 mass spectrum을 확인하였다. 항균물질에 대한 활성은 LB broth 배지에서 배양 시 킨 Vibrio parahae- molyticits^ LB agar 배지에 도말하고 동정 된 표준품을 농도별로 제조하여 paper disk method로 분석하였다.
대상 데이터
- 시료는 서울 경동시장에서 구입하였으며, 산초의 종자(씨 ) 부분(S1)과 종자를 제외한 부분(S2; 과피, 잎, 가지)으로 분류하여 60°C에서 24시간 열풍건조시킨 후 사용하였다. S1과 S2를 각각 분쇄하여 균질화시킨 후 10 g씩을 취해 증류수 100 mL를 가하고 100°C로 감압 증류하여 증류액 S1A와 S2A를 얻었으며, 별도로 증류 잔류물을 여과지(Whatman No.
- 산초 추출물의 항균력 시험은 disk method(9)를 이용하였다. 항균력 시험을 위한 균주는 아주대학교병원 임상병리실에서 분양받아 본 연구소에 보관 중인 Vibrioparahaemoly ticus를 10 mL LB broth에 접종하고 37°C에서 16시간 배양한 후 10, 000배까지 단계별로 희석하고 0.1 mL를 취하여 LB agar 배지 상에 고르게 도말하였다. 각각의 도말된 LB agar 배지에 멸균된 10 mm 0 paper disk를 얹고 시험 용액 S1A, SIB, SIC, SID, S2A, S2B, S2C, S2D 및 주정을 각각 40 UL씩 paper disk에 떨어뜨려 건조 시 킨 후 37°C에서 24시간 배양하여 disk 주위에 형성된 생육저해환의 직경을 측정함으로써 항균력을 시험하였다.
- 항균성 시험에서 가장 우수한 Vibrio 생육 저 해능을 보인 시험용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 시험용액을 밀폐 된 용기에 담아 40, 60, 80, 10OC에서 각각 30분간 열처리한 후 멸균된 10 mm 0 paper disk에 40 1丄씩 을 떨어뜨린 후 Vibrio parahaemolyticus 배 양액 0.
이론/모형
- 산초 추출물의 최소저해농도는 Turbidimetric Assay법 (11) 을 이용하여 실험하였다. LB broth에서 16시간 배양한 Vibrioparahaemolyticus 배양액을 100 mL LB broth에 0.
- 산초 추출물의 항균력 시험은 disk method(9)를 이용하였다. 항균력 시험을 위한 균주는 아주대학교병원 임상병리실에서 분양받아 본 연구소에 보관 중인 Vibrioparahaemoly ticus를 10 mL LB broth에 접종하고 37°C에서 16시간 배양한 후 10, 000배까지 단계별로 희석하고 0.
- , USA) 을 구입하여 mass spectrum을 확인하였다. 항균물질에 대한 활성은 LB broth 배지에서 배양 시 킨 Vibrio parahae- molyticits^ LB agar 배지에 도말하고 동정 된 표준품을 농도별로 제조하여 paper disk method로 분석하였다.
성능/효과
- 시험용액 S2C의 온도에 대한 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100°C에서 30분 동안 열처리 한 후, disk method 법을 사용하여 생육 저 해 환을 측정한 결과 시험 균주인 Vibrio parahaemolyticus^] 생육 저 해환의 지름은 모든 가열처리 구에서 처리 온도와 관계없이 18 mm 정도로 열을 가하지 않았을 때와 동일하게 항균력이 유지됨을 알 수 있었다. 또한 pH 안전성의 경우 시험용액 S2C를 lx lb 배 희석하여 pH 4, 6, 7, 8, 10으로 조정 하여 37"C에서 1시간 방치한 후 pH 7로 중화 시 켜 생육 저 해 환을 측정한 결과 모든 처 리구에서 18 mm 정도로 pH에 관계없이 동일한 항균력을 유지하였다(Table 3). Vibrio parahaemolyticus의 생육 저 해 환의 지름은 모두 가 18 mm 정도로 처 리조건에 관계없이 동일한 크기의 생육 저 해 환을 형성하였으며 이러한 결과로 볼 때 산초 추출물은 온도 및 pH에 대하여 안정한 것으로 판단된다.
- 1 mL씩을 균일하게 LB agar 배지에 접종하였다. 이 도말된 배지상에 1() mm 0 paper disk를 일정한 간격으로 놓고 시험용액 S1A, SIB, SIC, S1D, S2A, S2B, S2C, S2D 및 주정을 각각 40 虬씩 떨어뜨린 후 37°C에서 배양 시 킨 결과, 시험용액 S1C와 S1D는 2.45 X109 CFU/mL까지 Vibrioparahaemolyticus 증식 억제로 인한 생육 저해 환이 선명하게 관찰되었으며, 특히 시험용액 S2C와 S2D는 2.45X10" CFU/mL의 균수까지도 뚜렷한 생육 저 해. 환을 형 성하여 Vibrio parahaem 이 yticus 에 대해 탁월한 항균효과를 나타내었다(Table 1).
- 4). GC-MS로부터 분리된 peak의 mass spectrum 및 표준물질의 mass spectrum을 확인한 결과, 산초 추출물의 항균 활성 성분은 estragole(4~allyl ani~ sole)로 동정 되었다. 산초에 있어서 estragole 성분은 꽃이 피고 열매가 맺히면서부터 생성되고 열매가 성숙할수록 더 많은 양이 잎으로 전 이 한다고 알려져 있다(12).
- Vibrio parahaemolyticus^W 대한 estragole의 항균효과 9 log CFU/mL 균수의 Vibrio parahaemolyticus에 대한 estragole 농도별 생육 저 해 효과를 검색한 결과, 10 ppm에서 는 약 12 mm 정도의 생육 저 해 환을 형 성하였으며 30 ppm 이 상의 농도에서는 18 mm 정도로 뚜렷한 항균 활성효과를 보임을 알 수가 있었다(Fig. 5). 따라서 estragole은 10 ppm의 낮은 농도에서도 Vibriopara/iaem况ytici/s에 대하여 항균 활성을 나타내며 이를 함유한 산초 주줄 물도 저농도에서 탁월한 생육 저해 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 또한 pH 안전성의 경우 시험용액 S2C를 lx lb 배 희석하여 pH 4, 6, 7, 8, 10으로 조정 하여 37"C에서 1시간 방치한 후 pH 7로 중화 시 켜 생육 저 해 환을 측정한 결과 모든 처 리구에서 18 mm 정도로 pH에 관계없이 동일한 항균력을 유지하였다(Table 3). Vibrio parahaemolyticus의 생육 저 해 환의 지름은 모두 가 18 mm 정도로 처 리조건에 관계없이 동일한 크기의 생육 저 해 환을 형성하였으며 이러한 결과로 볼 때 산초 추출물은 온도 및 pH에 대하여 안정한 것으로 판단된다.
- parahaemolyticus 의 증식을 크게 억제한다고 알려져 있다(13). 따라서 estargole이 산 초 추출물의 Vibrio parahaemolticus 에 대하여 강한 항균효과를 나타내는 주요 항균 활성 성분으로 판단된다.
- 3). 따라서 산초 추출물은 Vibrio parahaemolyticus의 생육을 억제한다는 것을 알 수 있었다. Chung 등(11)은 산초나무의 일종인 초 피의 추출물이 E.
- 2). 따라서 산초에 존재하는 항균 활성 물질은 증류수보다 주정과 같은 알코올계 유기용매에의 해서 잘 추출되거나, 주정에서만 항균 활성을 보이고 증류수에서는 불활성 되는 것으로 사료된다.
- 산초나무 추출물의 항균 작용을 알아보기 위해서 Vibrioparahaemolyticus에 대한 항균력 분석에서 종자를 제외한 성분으로 제조한 산초의 주정 추출물이 효과가 가장 우수함을 확인하였으며, 이 추출물의 온도 및 pH에 대한 안정성을 검토한 결과 다양한 범위의 온도, pH에 대해서 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다. 또한 GC-MS에 의한 산초 추출물의 분리, 동정 결과에서는 estragole이 항균 활성을 나타내는 주성분임을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 우리나라에서 많이 사용되는 산초를 Vibrio parahaemolyticus에 의한 식중독을 줄일 수 있는 항균제로 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 따라서 본 연구는 독성이 없는 새로운 천연식품 보존제의 개발을 위하여 식품 및 향신료로서 적용 범위가 광범위한 산초를 대상으로 Vibrio parahaemolyticus°1] 대한 천연 항균제의 적용 가능성을 검토하였다. 산초나무 추출물의 항균 작용을 알아보기 위해서 Vibrioparahaemolyticus에 대한 항균력 분석에서 종자를 제외한 성분으로 제조한 산초의 주정 추출물이 효과가 가장 우수함을 확인하였으며, 이 추출물의 온도 및 pH에 대한 안정성을 검토한 결과 다양한 범위의 온도, pH에 대해서 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다. 또한 GC-MS에 의한 산초 추출물의 분리, 동정 결과에서는 estragole이 항균 활성을 나타내는 주성분임을 확인하였다.
- 시험용액 S2C의 온도에 대한 안정성을 측정하기 위하여 40, 60, 80, 100°C에서 30분 동안 열처리 한 후, disk method 법을 사용하여 생육 저 해 환을 측정한 결과 시험 균주인 Vibrio parahaemolyticus^] 생육 저 해환의 지름은 모든 가열처리 구에서 처리 온도와 관계없이 18 mm 정도로 열을 가하지 않았을 때와 동일하게 항균력이 유지됨을 알 수 있었다. 또한 pH 안전성의 경우 시험용액 S2C를 lx lb 배 희석하여 pH 4, 6, 7, 8, 10으로 조정 하여 37"C에서 1시간 방치한 후 pH 7로 중화 시 켜 생육 저 해 환을 측정한 결과 모든 처 리구에서 18 mm 정도로 pH에 관계없이 동일한 항균력을 유지하였다(Table 3).
- 환을 형 성하여 Vibrio parahaem 이 yticus 에 대해 탁월한 항균효과를 나타내었다(Table 1). 실험 결과 증류수로 추출한 시험용액 S1A, SIB, S2A, S2B 및 주정에서는 항균효과가 나타나지 않았으며, 주정으로 추출한 시험용액의 경우 S1C, SID, S2C, S2D 모두에서 항균효과가 나타났으며, 종자를 제외한 부분으로 제조한 추출성분(S2C, S2D)이 종자부분으 로 제조한 추출성분보다 항균효과가 높았다(Fig. 2). 따라서 산초에 존재하는 항균 활성 물질은 증류수보다 주정과 같은 알코올계 유기용매에의 해서 잘 추출되거나, 주정에서만 항균 활성을 보이고 증류수에서는 불활성 되는 것으로 사료된다.
- 위에서 얻어진 결과를 토대로 항균 활성이 가장 뛰어난 시험용액 S2C에 대하여 최소저해농도를 측정하기 위해 증류수와 주정으로 희석하여 항균 활성을 측정한 결과, 주정을 사용하여 희석한 경우 1 X lb 배까지 의 희석 배수에서도 항균 활성을 나타내는 반면 증류수를 사용하여 희석한 경우 lx lb 배의 희석배수까지만 항균 활성을 나타내었다(Table 2). 이러한 결과로 산초에 존재하는 항균 활성 물질들은 증류수보다 주정과 같은 알코올계 유기용매의 존재 시 항균 활성의 상승효과가 있는 것으로 사료된다.
- 또한 GC-MS에 의한 산초 추출물의 분리, 동정 결과에서는 estragole이 항균 활성을 나타내는 주성분임을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 우리나라에서 많이 사용되는 산초를 Vibrio parahaemolyticus에 의한 식중독을 줄일 수 있는 항균제로 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 식품첨가제 및 포장재, 식품포장 외부 충진 물질, 살균소독제 등의 다양한 형태로의 응용이 가능하리라 생각된다.
- 위에서 얻어진 결과를 토대로 항균 활성이 가장 뛰어난 시험용액 S2C에 대하여 최소저해농도를 측정하기 위해 증류수와 주정으로 희석하여 항균 활성을 측정한 결과, 주정을 사용하여 희석한 경우 1 X lb 배까지 의 희석 배수에서도 항균 활성을 나타내는 반면 증류수를 사용하여 희석한 경우 lx lb 배의 희석배수까지만 항균 활성을 나타내었다(Table 2). 이러한 결과로 산초에 존재하는 항균 활성 물질들은 증류수보다 주정과 같은 알코올계 유기용매의 존재 시 항균 활성의 상승효과가 있는 것으로 사료된다.
- 5, 5%의 농도로 성장배지를 제조하였 다. 이렇게 제조된 성징 배지에 Vibrio parahaemolyticus를 접종하여 산초 추출물이 성장에 미치는 영향을 검토한 결고卜, 산초 추출물을 첨가하지 않은 경우 균수가 2시간 이후부터 급속히 증가하여 24시간 후 약 10 log CFU/mL까지 성장하였으며, 반면에 산초 추출물 0.5%, 5% 농도에 서는 24시간 동안 생육이 완전히 억제되는 현상을 볼 수 있다(Fig. 3). 따라서 산초 추출물은 Vibrio parahaemolyticus의 생육을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 45X10" CFU/mL의 균수까지도 뚜렷한 생육 저 해. 환을 형 성하여 Vibrio parahaem 이 yticus 에 대해 탁월한 항균효과를 나타내었다(Table 1). 실험 결과 증류수로 추출한 시험용액 S1A, SIB, S2A, S2B 및 주정에서는 항균효과가 나타나지 않았으며, 주정으로 추출한 시험용액의 경우 S1C, SID, S2C, S2D 모두에서 항균효과가 나타났으며, 종자를 제외한 부분으로 제조한 추출성분(S2C, S2D)이 종자부분으 로 제조한 추출성분보다 항균효과가 높았다(Fig.
후속연구
- 이 결과를 바탕으로 우리나라에서 많이 사용되는 산초를 Vibrio parahaemolyticus에 의한 식중독을 줄일 수 있는 항균제로 적용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 식품첨가제 및 포장재, 식품포장 외부 충진 물질, 살균소독제 등의 다양한 형태로의 응용이 가능하리라 생각된다.
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