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문제 정의
- 본 연구에서는 우리의 전통 식품인 김치로부터 L. mono- qytagenes의 성장을 효과적으로 저해하는 유산균을 분리 및 동정하였으며, 분리 균주인 Lactobacillus sakei P3T이 생산하는 박테리오신을 부분 정제하여 저해범위와 안정성 그리고 분자량을 조사하였다.
가설 설정
- 3 : Culture supernatant of L. sakei P3-1 treated with proteinase K (2 pL, 20 mg/mL) at one side.
제안 방법
- Gel 상에서 Sakacin P3-1 역가 부위 확인은 Bhunia 등(17)의 방법에 준했다. Gel을 3차 증류수로 4시간 동안 교반하여 SDS를 제거한 다음 MRS 고체배지 위에 놓고 그 위를 top agar(0.7%, w/v)와 L. monocytogenes ATCC 19111(1 xlO8 CFU/mL)을 함께 섞은 것을 중층하였다. 그 후 37°C에서 16시간 배양한 후 저해부위를 확인하였다.
- Gram 양성균과 음성균 총 25 균주를 대상으로 박테리오신에 의한 저해 여부를 조사하였다. 그 결과 s狄亙 P3-1이 생산하는 브테리오신은 단지 Listeria monocytogenes ATCC 19111만을 강력히 저 해하는 것으로 나타났다(Table 2).
- L sakei P3T의 생육온도가 25, 30 및 37°C인 경우 乙 sakei 생육과 배양액의 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사하였다.
- L sakei P3T이 생산하는 박테리오신의 부분정제를 위해 양이온교환수지인 SP-Sepharose를 사용하여 이온교환 ch romatography 를 실시하였다(Fig. 2). 배양상등액을 칼럼에 통과시킨 후 칼럼의 15배의 volume에 해당하는 phosphate buffer (pH 8.
- L. sakei P 3T의 생육온도가 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 3). 박테리오신 역가를 배양 시작 후 2시간 간격으로 배양 온도별로 측정하였다.
- 여러 Gram 양성균과 음성균들의 박테리오신에 의한 저해 여부를 조사하였다. L. sakei P3-1 을 MRS 배지에 접종하여 하룻밤 배양한 다음 배양액 2 uL를 MRS 고체배지에 spot 하여 12시간 배양 후 균주들을 top agar(0.7%) 5 mL와 섞어 중층한 다음 각 균들의 생육 최적 온도에서 12시간 이상 배양하여 저해 여부를 관찰하였다. 박테리오신의 열, 유기 용매 및 가수분해 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다(15).
- L. sakei P3TL를 MRS 배지에 하룻밤 배양한 후 11, 000x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 배양 상등액을 이온교환 column(SP^Sepharose Fast Flow; Phar macia Biotech, France)을 통과시켜 정제를 실시하였다(14).
- 보다 확실한 동정을 위해서 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 증폭한 16S rDNA 단편의 염기서열을 결정하고 이를 GenBank에 등록된 여러 유산균들과 비교를 통한 동정을 시도하였다(13). LAB16s-F(5, -TGC CAG CAK CCG CGG TAA TAC-3, )와 LAB16s-R(5'-AAC TCG RCA CGA GCT GAC GAC-3')를 primer로 그리고 분리균에서 얻은 chromosomal DNA 1 Ug을 주형으로 사용하여 증폭한 결과 예상대로 약 600 bp 크기의 절편을 얻었고(결과미제시), 이를 gel에서 추출한 다음 pEZ-T vector(RNA Inc., Korea)에 cloning한 후 증폭물의 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 NCBKNational Center for Biotechnology Information, http://www.
- monocytogenes ATCC 19111, Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923 그리고 Lactobacillus plantarum ATCC 14917을 감수성 균주로 사용하여 저해환 형성을 조사하였다. 저해환을 형성하는 단일 균락들을 선별하여 박테리오신 실험에 사용하였다.
- 박 테리오신을 100°C에서 60분, 80°C에서 60분, 121°C에서 15분 간 처리한 후 잔존활성을 spot-on-theTawn method(9, 10) 로 측정하였다.pH 3〜10에서의 안정성 조사를 위해서 다른 pH buffer들에 박테리오신을 현탁한 후 잔존 활성을 측정하였다. 유기 용매에 대한 안정성은 유기용매와 박테리오신을 같은 량씩 섞어서 25°C에서 1시간 방치한 후 잔존활성을 측 정하였다.
- 3). 박테리오신 역가를 배양 시작 후 2시간 간격으로 배양 온도별로 측정하였다. 30°C에서 배양하였을 때 박테리오신의 역가가 가장 높았으며, 배양 후 18시간부터 44시간 사이에 가장 높은 1, 000 AU/mL의 역가를 관찰할 수 있었다.
- 분획은 7 mL 씩 받았으며, 분획 별로 흡광도 측정 (ODso)과 함께 감수성 균 주(Listeria monocytogenes)를 사용하여 박테리오신 역가를 측정하였다. 박테리오신 역가를 보이는 분획들을 모아서 동결 건조하여 얻은 것을 박테리오신 특성실험에 사용하였다.
- sakei P3TL를 MRS 배지에 하룻밤 배양한 후 11, 000x g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 배양 상등액을 이온교환 column(SP^Sepharose Fast Flow; Phar macia Biotech, France)을 통과시켜 정제를 실시하였다(14). 박테리오신은 이온교환수지에 결합하였으며 사용 buffer로 는 50 mM phosphate buffer(pH 8.
- API 50 CHL kit(bioMeriux; France)를 사용하여 분리 균의 당 이용성 조사(Table 1)를 통한 균 동정을 시도한 결과, Lactobacillus plantarum과 유사한 것으로 판정되었다. 보다 확실한 동정을 위해서 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 증폭한 16S rDNA 단편의 염기서열을 결정하고 이를 GenBank에 등록된 여러 유산균들과 비교를 통한 동정을 시도하였다(13). LAB16s-F(5, -TGC CAG CAK CCG CGG TAA TAC-3, )와 LAB16s-R(5'-AAC TCG RCA CGA GCT GAC GAC-3')를 primer로 그리고 분리균에서 얻은 chromosomal DNA 1 Ug을 주형으로 사용하여 증폭한 결과 예상대로 약 600 bp 크기의 절편을 얻었고(결과미제시), 이를 gel에서 추출한 다음 pEZ-T vector(RNA Inc.
- 0)를 그리고 용출을 위해 NaCl gradient를 0에서 1 M까지 걸어주었다. 분획은 7 mL 씩 받았으며, 분획 별로 흡광도 측정 (ODso)과 함께 감수성 균 주(Listeria monocytogenes)를 사용하여 박테리오신 역가를 측정하였다. 박테리오신 역가를 보이는 분획들을 모아서 동결 건조하여 얻은 것을 박테리오신 특성실험에 사용하였다.
- 여러 Gram 양성균과 음성균들의 박테리오신에 의한 저해 여부를 조사하였다. L.
- , Korea)에 cloning한 후 증폭물의 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 NCBKNational Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nkn.nih.gov/)의 blast program을 사용해서 GenBank에 등록된 16S rDNA 유전자들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 P3T의 16S rDNA는 Lactobacillus sakei (Accession NO; AF401673) 유전자와 100% 상동성을 보였다.
- pH 3〜10에서의 안정성 조사를 위해서 다른 pH buffer들에 박테리오신을 현탁한 후 잔존 활성을 측정하였다. 유기 용매에 대한 안정성은 유기용매와 박테리오신을 같은 량씩 섞어서 25°C에서 1시간 방치한 후 잔존활성을 측 정하였다. 여러 가수분해 효소들에 대한 안정성은 1 mg enzyme/mL 농도로 37°C 에서 1시간 처리 후 잔존 역가를 측정하였다.
- 박테리오신 생산균 동정을 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였다(12). 최적 생육온도, 그람염색, 운동성, cat alase test, C02 생성 유무 및 당을 발효하여 여러 가지 유기산들을 생성하는 것은 API 50 CHL kit(BioMerieux, France) 를 사용 조사하였고, 최종적인 동정을 위해서는 분리균의 16S rDNA 서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다(13).
대상 데이터
- SDS-PAGE는 Laemmli(16)의 방법에 준하여 실시하였다. 15% acrylamide gel 을 사용하였고 장치로는 Mini-Pro tein II (Bio-Rad) electrophoresis system을 사용하였다. 전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 단백질을 염색하였다.
- PCR 용 primer들은 Bionics(Seoul, Korea)에서 제작한 것으로 LAB16s-F(5'-TGC CAG CAK CCG CGG TAA TAC3)와 LAB16s-R(5'-AAC TCG RCA CGA GCT GAC GAC-3, )을 사용하였다.
- 김치로부터 박테리오신 생산균 분리를 시도한 결과 L. monocytogenes ATCC 19111을 저 해하는 한 균주(P3-1)를 선별하였다(Fig. 1). Bergey's Manual of Determinative bacteriology(12)에 따라 분리균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 분리 균은 Gram 양성 , catalase 음성 그리고 포자를 형성하지 않는 비운동성의 bacilli 형태로 관찰되었다.
- 네 개 분획에서만 역가가 나타나는 점으로 보아 이온교환 chromatography에 의해 분리가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다. 박테리오신 역가를 보이는 분획들만 모아서 동결건조하여 이후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 김치들은 서부 경남 일대의 슈퍼, 대형 마트 및 재래시장에서 서로 다른 배추김치를 구입하여 사용하였다. 먼저 김치시료를 단계별로 희석하여 MRS 고체 배지에 도말하여 30°C에서 배양하였다.
- aureus ATCC 25923 그리고 Lactobacillus plantarum ATCC 14917을 감수성 균주로 사용하여 저해환 형성을 조사하였다. 저해환을 형성하는 단일 균락들을 선별하여 박테리오신 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 단백질을 염색하였다. Gel 상에서 Sakacin P3-1 역가 부위 확인은 Bhunia 등(17)의 방법에 준했다. Gel을 3차 증류수로 4시간 동안 교반하여 SDS를 제거한 다음 MRS 고체배지 위에 놓고 그 위를 top agar(0.
- SDS-PAGE는 Laemmli(16)의 방법에 준하여 실시하였다. 15% acrylamide gel 을 사용하였고 장치로는 Mini-Pro tein II (Bio-Rad) electrophoresis system을 사용하였다.
- 박테리오신의 열, 유기 용매 및 가수분해 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다(15). 박 테리오신을 100°C에서 60분, 80°C에서 60분, 121°C에서 15분 간 처리한 후 잔존활성을 spot-on-theTawn method(9, 10) 로 측정하였다.pH 3〜10에서의 안정성 조사를 위해서 다른 pH buffer들에 박테리오신을 현탁한 후 잔존 활성을 측정하였다.
- 박테리오신 생산균 동정을 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative bacteriology에 따라 조사하였다(12). 최적 생육온도, 그람염색, 운동성, cat alase test, C02 생성 유무 및 당을 발효하여 여러 가지 유기산들을 생성하는 것은 API 50 CHL kit(BioMerieux, France) 를 사용 조사하였고, 최종적인 동정을 위해서는 분리균의 16S rDNA 서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다(13).
- 분리균주들의 박테리오신 생산 여부는 spot-on-theTawn method(9, 10)를 사용하여 판별하였다. 선별된 유산균을 8시간 이상 MRS 배지에서 배양한 다음 원심분리하여 상등액을 얻었다.
성능/효과
- 여러 효소 처리, 열처리 및 유기용매 처리에 대한 박테리 오신의 안정성을 조사한 결과를 Table3에 표시하였다. 121°C, 15분 열처리와 100°C 에서 10분 열처리 후 각각 12.5%와 50%의 잔존 역가를 관찰할 수 있어서 L. && P3-1 이 생산하는 박테리오신의 열 저항성이 상당한 것을 알 수 있었다. 따라서 L.
- 박테리오신 역가를 배양 시작 후 2시간 간격으로 배양 온도별로 측정하였다. 30°C에서 배양하였을 때 박테리오신의 역가가 가장 높았으며, 배양 후 18시간부터 44시간 사이에 가장 높은 1, 000 AU/mL의 역가를 관찰할 수 있었다. 25°C에서 배양하였을 때는 배양 후 28시간부터 48시간 사이에 1, 000 AU/mL의 역 가를 확인할 수 있었다.
- Bergey's Manual of Determinative bacteriology(12)에 따라 분리균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 분리 균은 Gram 양성 , catalase 음성 그리고 포자를 형성하지 않는 비운동성의 bacilli 형태로 관찰되었다. API 50 CHL kit(bioMeriux; France)를 사용하여 분리 균의 당 이용성 조사(Table 1)를 통한 균 동정을 시도한 결과, Lactobacillus plantarum과 유사한 것으로 판정되었다. 보다 확실한 동정을 위해서 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 증폭한 16S rDNA 단편의 염기서열을 결정하고 이를 GenBank에 등록된 여러 유산균들과 비교를 통한 동정을 시도하였다(13).
- s아cei로 동정 되었다. L. sakei P3T이 분비하는 박테리오신은 여러 그람 양성 및 음성균들 중에서 단지 L. monocytogenes만을 저해하는 그래서 저해범위가 매우 좁은 박테리오신으로 확인되었다. 이온교환 크로마토그래피에 의해서 박테리오신은 부분 정제되었으며 박테리오신의 열처리 안정성을 조사한 결과 121°C에서 15분간 그리고 100 °C에서 10분간 열처리 후에도 각각 12.
- Gram 음성균은 저해하지 못하였는데 이는 유산균 박테리오신들의 공통된 특징이다. Lactobacillus 속 균들을 포함하여 다른 유산균들도 저해하지 못했고 이 결과에서 L. sakei P3-1이 생산하는 박테리오신은 nisin과 같이 저해 범위가 넓은 박테리오신이 아니라 반대로 저해범위가 매우 좁은 종류임을 알 수 있었다. 그리고 Listeria를 강력히 저해하는 것으로 보아서는 박테리 오신들 중에서 도 분류상으로 Class口-a에 속하는 것으로 추정된다(17).
- 5%와 50%의 역가가 잔존하여 상당한 열안정성을 지니고 있음을 알 수 있었다. MRS 배지에서 배양중 배양온도가 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사한 결과 30°C에서 배양할 때 그리고 18시간 이 상 배 양에서 가장 높은 1, 000 AU/mL 역가를 보였다. 한편 SDS-PAGE 및 activity staining에 의해 측정된 박테리오신 의 분자량은 4, 000이었다.
- SDS-PAGE와 SDS-PAGE 후 박테리오신 역가 확인실 험들의 결과 匕 sakei P3-1 이 생산하는 박테리오신의 분자량은 약 4 kDa임을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 일반적인 Class n-a 박테리오신의 분자량이 12 kDa 이하이고 특히 대부분은 3-5 kDa 범위에 속하며 또 Listeria를 강하게 저해한다는 사실과 연관시켜 볼 때 Z.
- gov/)의 blast program을 사용해서 GenBank에 등록된 16S rDNA 유전자들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 P3T의 16S rDNA는 Lactobacillus sakei (Accession NO; AF401673) 유전자와 100% 상동성을 보였다. 이는 API 50 CHL kit 결과와 차이가 있는 것으로 당 이용성을 이용한 동정과 16S rDNA 유전자 서열을 이용한 분자유전학적 동정 결과가 꼭 일치하지는 않는 것을 볼 수 있다.
- Gram 양성균과 음성균 총 25 균주를 대상으로 박테리오신에 의한 저해 여부를 조사하였다. 그 결과 s狄亙 P3-1이 생산하는 브테리오신은 단지 Listeria monocytogenes ATCC 19111만을 강력히 저 해하는 것으로 나타났다(Table 2). Gram 음성균은 저해하지 못하였는데 이는 유산균 박테리오신들의 공통된 특징이다.
- monocytogenes에 대한 저해 여부를 조사한 결과 박테리오신의 역가는 23〜26번 분획에서만 관찰되었다. 네 개 분획에서만 역가가 나타나는 점으로 보아 이온교환 chromatography에 의해 분리가 잘 이루어졌음을 알 수 있었다. 박테리오신 역가를 보이는 분획들만 모아서 동결건조하여 이후 실험에 사용하였다.
- 반면 비교적 고온인 37°C에서 배양하였을 경우에는 균 증식속도는 빠르지만 박테리오신 역가는 감소하였고 배양 후 18시간부터 24시간까지 단지 300 AU/mL의 역가만 확인되었다. 이상에서 박테리오신 최적 생산온도는 30°C 그리고 배양시간은 18시간 이상임을 알 수 있었다.
- monocytogenes만을 저해하는 그래서 저해범위가 매우 좁은 박테리오신으로 확인되었다. 이온교환 크로마토그래피에 의해서 박테리오신은 부분 정제되었으며 박테리오신의 열처리 안정성을 조사한 결과 121°C에서 15분간 그리고 100 °C에서 10분간 열처리 후에도 각각 12.5%와 50%의 역가가 잔존하여 상당한 열안정성을 지니고 있음을 알 수 있었다. MRS 배지에서 배양중 배양온도가 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사한 결과 30°C에서 배양할 때 그리고 18시간 이 상 배 양에서 가장 높은 1, 000 AU/mL 역가를 보였다.
- sakei P3-1 이 생산하는 박테리오신은 식품보존제로 사용하기에 충분한 열 안정성을 가지고 있다고 볼 수 있다. 한편 효소 처리 결과를 보면 P-amylase, lysozyme, RNase, cat alase 등의 처리에는 아무런 영향을 받지 않았으나, pro teinase K, pepsin, trypsin, protease 처리에는 불활성화 되어 역가를 상실하였다. 이는 L sakei P3T이 생산하는 박테리오신이 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 박테리오신임을 확인시켜주는 결과이다.
- 배추김치로부터 식품유해균인 Listeria monocytogenes 를 저해하는 박테리오신을 생산하는 유산균, Lactobacillus so/血 P3-1 이 분리되었다. 형태학적, 생화학적 특성조사와 최종적으로 PCR로 증폭하여 얻은 16S rDNA 염기서열 결정을 통해서 L. s아cei로 동정 되었다. L.
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