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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전통발효식품인 김치로부터 충치 유발균 중 대표적인 St. mutans에 대한 항균활성이 우수한 유산균을 분리 및 동정하고, 분리 유산균이 생성하는 박테리오신의 이화학적 특성을 조사하여 생균제 개발의 가능성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 충치균인 St. mutans에 대한 항균활성이 우수한 유산균을 전통발효식품인 김치로부터 분리 및 동정하였고, 본 유산균이 생성하는 박테리오신의 이화학적 특성을 조사하여 생균제 개발의 가능성을 검토하였다. 분리된 활성유산균 중에서 가장 높은 항충치능을 갖는 유산균주 K-7을 최종 적으로 선발하였다.
제안 방법
- 37℃에서 24시간 배양하여 자란 colony에 5 mL BHI 액체 (calf brain 7.7 g, beef heart 9.8 g, proteose peptone 10 g, dextrose 2 g, sodium chloride 5 g, disodium chloride 2.5 g/L, pH 7.4, BD Co.), soft agar (0.7%, w/v)에 충치 유발 균주 (St. mutans KCTC3298, 1 × 106 CFU/mL)를 같이 혼합하여 고체배지 상에서 저해환 형성을 조사하였으며, 환을 생성한 유산균을 항충치 활성을 지닌 균주로 1차 선발하였다.
- pH에 대한 안정성: pH에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하기 위하여 부분 정제된 박테리오신을 10N NaOH와 10N HCl로 pH 2.0에서 11.0까지 조정한 후 상온에서 1시간 방치 후 항균활성을 측정하였다.
- 얻어진 결과를 바탕으로 분리 유산균을 Lb. sakei K-7으로 명명 하였으며, 16S rRNA database를 토대로 Phylogenetic tree를 작성하였고 (Fig 1), 본 균주의 유전정보는 Gene Bank database에 등록하였다[AB650590].
- 각종 김치시료 (10 g)을 파쇄 후 단계적으로 희석하여 MRS 고체배지에 도말 하였다. 37℃에서 24시간 배양하여 자란 colony에 5 mL BHI 액체 (calf brain 7.
- mutans와 중충배양 하였고 각 colony의 저해환의 크기를 측정하였다. 그 결과 저해 활성이 가장 우수한 유산균을 최종적으로 선발하였고 K-7으로 명명하고 본 실험에 사용하였다.
- mutans KCTC 3298에 대한 저해환의 생성 유무로 확인하였다. 또한 동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 대조구로 사용하였다.
- 그리고, proteinase K는 45℃에서 12시간 반응 시켰다. 박테리오신 활성은 St. mutans KCTC 3298에 대한 저해환의 생성 유무로 확인하였다. 또한 동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 대조구로 사용하였다.
- 배양액을 원심 분리 (3,000 × g, 10 min, VISION) 하여 상등액을 회수하고, membrane filter (0.45 μm pore size)로 제균 하였고 제균한 상등액을 진공에서 원심분리기를 이용하여 농축하였다.
- 분리 균주의 항충치 활성을 측정하기 위해 MRS 고체 배지 위에 paper disc (8 mm)를 올려 놓은 후 조제한 조박테리오신 용액을 50 μL를 흡수시키고 감수성 균주인 St. mutans soft agar를 중층하였다.
- 선발된 박테리오신 생산균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 40시간 동안 배양하면서 일정 시간별로 배양액을 채취하여 OD 값을 측정 및 항균물질의 활성변화를 측정하였다. 항균 물질의 활성변화를 측정하기 위하여 배양액을 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 상등 액을 membrane filter (0.
- 열에 대한 안정성: 열에 대한 안정성의 조사는 제조된 박테리오신 용액을 40, 60, 80, 100 및 121℃에서 각각 30분또는 60분간 열처리 한 후 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다.
- 유기용매에 대한 안정성: 유기용매에 대한 안정성 실험은 chloroform, isopropanol, hexane, ethanol 및 acetonitrile 등을 제조된 박테리오신 용액과 같은 부피 비율로 혼합 (1：1)하여 상온 (25℃)에서 1시간 방치한 후, 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정함으로써 여러 유기용매에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하였다.
- mutans soft agar를 중층하였다. 이후37℃ 배양기에서 24시간 배양시킨 후 disc 주변 저해환의 크기로 항충치 활성을 측정하였다.
- 항충치 활성 유산균의 동정은 Bergey’s M anual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 형태학 및 생화학적 특성을 조사하였다 [14]. 최적 생육 온도, 그람 염색, 운동성, catalase test, CO2 생성 유무 및 API 50CHL kit (Biomerieux, Lyan, France)를 사용한 탄수화물 발효 양상 등을 조사 하였으며, 최종적으로 16S rRNA gene을 증폭하여 분리 유산균을 동정하였다. Genomic DNA는 Walter 등의 방법 [15]에 따라 분리하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 primers는 27F primer (AGAGTTTGATCM TGGCTCAG)와 1492R primer (TACGGYTACCTTGTTA CGACTT)를 사용하였고, PCR조건은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension의 cycle을 35회 실시하였다.
- 항균 물질의 활성변화를 측정하기 위하여 배양액을 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고, 얻어진 상등 액을 membrane filter (0.45 μm pore size)로 여과하여 cellfree supernatant를 조제한 다음 항충치 활성을 측정하였다.
- 항충치 활성을 가진 유산균을 분리하기 위해서 김치 추출액에 함유된 유산균을 충치 유발균주인 St. mutans와 중충배양 하였고 각 colony의 저해환의 크기를 측정하였다. 그 결과 저해 활성이 가장 우수한 유산균을 최종적으로 선발하였고 K-7으로 명명하고 본 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- sakei로 확인되었고, Lb. sakei K-7으로 명명 하였으며, 이균주의 유전정보는 Gene Bank에 등재하였다 [AB650590]. 배양시간에 따른 Lb.
- 본 연구에 사용된 항충치 활성 균주는 가정용 및 시판용 김치로부터 분리하였다.
- mutans에 대한 항균활성이 우수한 유산균을 전통발효식품인 김치로부터 분리 및 동정하였고, 본 유산균이 생성하는 박테리오신의 이화학적 특성을 조사하여 생균제 개발의 가능성을 검토하였다. 분리된 활성유산균 중에서 가장 높은 항충치능을 갖는 유산균주 K-7을 최종 적으로 선발하였다. API kit를 이용한 생화학적 분석 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 분리 균주를 동정한 결과 Lb.
- 항충치 활성의 측정에 사용된 감수성 균주는 한국미생물 자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양 받은 St. mutans KCTC3298표준 균주를 사용하였다.
이론/모형
- Genomic DNA는 Walter 등의 방법 [15]에 따라 분리하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 primers는 27F primer (AGAGTTTGATCM TGGCTCAG)와 1492R primer (TACGGYTACCTTGTTA CGACTT)를 사용하였고, PCR조건은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension의 cycle을 35회 실시하였다. 16S rRNA 염기서열 확인은 (주)Solgent사에 의뢰하여 확인하였다.
- 최적 생육 온도, 그람 염색, 운동성, catalase test, CO2 생성 유무 및 API 50CHL kit (Biomerieux, Lyan, France)를 사용한 탄수화물 발효 양상 등을 조사 하였으며, 최종적으로 16S rRNA gene을 증폭하여 분리 유산균을 동정하였다. Genomic DNA는 Walter 등의 방법 [15]에 따라 분리하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위한 primers는 27F primer (AGAGTTTGATCM TGGCTCAG)와 1492R primer (TACGGYTACCTTGTTA CGACTT)를 사용하였고, PCR조건은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension의 cycle을 35회 실시하였다. 16S rRNA 염기서열 확인은 (주)Solgent사에 의뢰하여 확인하였다.
- 분리 유산균들의 항충치 활성 박테리오신 생성 유무는 Paper disc diffusion assay 방법을 이용하여 판단하였다 [12,13]. 분리 균주의 항충치 활성을 측정하기 위해 MRS 고체 배지 위에 paper disc (8 mm)를 올려 놓은 후 조제한 조박테리오신 용액을 50 μL를 흡수시키고 감수성 균주인 St.
- 항충치 활성 유산균의 동정은 Bergey’s M anual of Determinative Bacteriology의 방법에 따라 형태학 및 생화학적 특성을 조사하였다 [14].
성능/효과
- 분리된 활성유산균 중에서 가장 높은 항충치능을 갖는 유산균주 K-7을 최종 적으로 선발하였다. API kit를 이용한 생화학적 분석 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 분리 균주를 동정한 결과 Lb.sakei로 확인되었고, Lb. sakei K-7으로 명명 하였으며, 이균주의 유전정보는 Gene Bank에 등재하였다 [AB650590].
- sakei K-7이 생산하는 박테리오신은 60-100℃에서 열 처리시에도 매우 안정하였다 (Table 3). pH에 대한 안정성 여부를 조사하기 위하여 배양 상층액을 부분 정제 후 용액에 완충용액을 가하여 pH를 조절한 뒤 잔존활성을 측정한 결과, 분리 균주가 생산하는 박테리오신은 pH 3.0-7.0에서 어떠한 활성의 소실없이 안정하였고 그 밖의 범위에서는 점차 활성이 감소하는 경향을 나타내었으나 그 활성이 완전하게 소실되지는 않았다.
- 배양시간에 따른 Lb. sakei K-7의 OD값 및 항충치 활성을 측정한 결과, 18시간 이후 최대 OD 1.5 값을 보였으며, 항충치 활성은 유도기에 나타나기 시작하여 정체기에 80 AU/mL로 최고값을 보이다가 이후 급격하게 활성을 상실하였다. 박테리오신으로 예측되는 항충치 물질은 60-100℃까지 활성을 유지 하였으며, pH와 유기 용매에 대해서도 비교적 안정하였다.
- sakei K-7이 생산하는 항충치 활성물질을 포함하는 용액에 각종 단백질 분해 효소를 2 mg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 반응시킨 후 잔존활성을 측정한 결과, proteinase K, trypsin 및 chymotrypsin에 의해서 항균활성이 소실된 반면 α-amylase와 lipase의해서는 항균활성이 소실되지 않아 항충치 물질이 단백질인 박테리오신임을 알 수 있었다 (Table 2).
- API kit (50CHL)를 이용하여 생화학적 특성을 비교한 결과, 공시균주인 Lb. sakei KCTC 3603과 가장 높은 동질성을 보였고 galactose, maltose, L-arabinose 대사능력에서 차이점를 보여 공시균주와 동일 속 또는 종에 속하는 신규균주로 판단되었다 (Table 1).
- 또한, 유기용매에 대한 안정성의 경우 hexane, chloroform, acetone, acetonitrile, isopropanol, ethanol을 최종 농도 50% (v/v)로 처리할 경우 항균활성에 변화가 없는 것으로 보아 유기 용매에 매우 안정함을 확인 할 수 있었다 (Table 3).
- 5 값을 보였으며, 항충치 활성은 유도기에 나타나기 시작하여 정체기에 80 AU/mL로 최고값을 보이다가 이후 급격하게 활성을 상실하였다. 박테리오신으로 예측되는 항충치 물질은 60-100℃까지 활성을 유지 하였으며, pH와 유기 용매에 대해서도 비교적 안정하였다.
- 분리 유산균을 현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰한 결과 K-7은 그람 양성의 간균이었다. API kit (50CHL)를 이용하여 생화학적 특성을 비교한 결과, 공시균주인 Lb.
- 2). 항충치 물질의 활성을 측정한 결과, 유도 기부터 감수성균인 St. mutans에 대한 억제활성을 보이기 시작하였으며, 정체기에 80 AU/mL의 최대 항균활성을 나타내었다. 그리고 18시간 이후부터 급격하게 항균활성이 떨어 졌다.
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