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문제 정의
- 본 연구는 장기간 발효된 김치인 묵은지로부터 분리된 Lactobacillus sakei JK-17의 다양한 기능성을 조사하기 위하여 실시되었다. 먼저, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 L.
- 본 연구에서는 가정에서 담근 김치를 2년 이상 숙성시킨 김치인, 묵은지로부터 Lactobacillus sakei JK-17을 분리하여, 이 세균의 여러 가지 생화학적 특성조사를 실시하였고, 아질산염 소거, 항산화능, β-galactosidase 활성, 식중독 원인세균 들에 대한 항균활성 등의 여러가지 기능성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- β-Galactosidase 활성은 접종 직후의 pH 7.0을 기준으로, 본 실험에서 얻은 생장곡선과 pH결과를 바탕으로 하여 생장이 가장 활발한 지수생장기의 pH 4.1에서 동일한 방법으로 비교 측정하였다.
- 420 nm에서 흡광도를 측정하여 β-galactosidase의 활성을 각각 계산하였다 [15].
- JK-17 균주의 계통수를 작성하기 위하여 16S rRNA PCR을 수행하였다. JK-17 균주로부터 genomic DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자를 PCR을 사용하여 증폭하였다. 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 8F와 1492R primer를 사용하였다.
- JK-17 균주의 계통수를 작성하기 위하여 16S rRNA PCR을 수행하였다. JK-17 균주로부터 genomic DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자를 PCR을 사용하여 증폭하였다.
- L. monocytogenes는 세균배양액을 멸균된 면봉을 사용하여 BHI 평판배지에 배양하였으며, 나머지 5가지 세균들은 동일한 방법으로 각각 LB 평판배지에 도말 배양하여, paper disc를 올려놓은 후, 농축 배양상등액 20 µL를 흡수시켜 37°C에서 24시간 배양시켜, disc 주변에 생성된 투명대의 크기를 측정하였다.
- L. sakei JK-17를 MRS 액체 배지 (pH 7.0)에 접종하고 진탕배양기 (30o C, 160 rpm)에서 배양시키면서 세균의 생장과 HPLC를 통한 유기산 분석을 12시간 간격으로 측정하였다 (Fig. 3). 분리균주는 배양 이후부터 60시간까지 생장하였으며, 유기산 생산도 증가하는 것으로 조사되었다.
- L. sakei JK-17에 대한 여러 생화학적 특성조사를 실시하 였다. Indole production 시험에서는 음성반응을 나타내는 초록색의 고리가 형성되었으며, glucose를 발효하여 배지의 색이 노란색으로 변하였다.
- L. sakei JK-17의 β-galactosidase 활성을 측정을 하기 위해서 효소액의 pH에 따른 기질의 분해도를 조사하였다 (Fig. 6).
- L. sakei JK-17의 아질산염 소거능을 측정하기 위해, 배양액의 아질산염 농도를 12시간 간격으로 조사하였다 (Fig. 4). L.
- L. sakei JK-17의 항산화능을 측정하기 위해서 DPPH를 이용한 라디칼 소거능을 조사하였다 (Fig. 5). 분리세균은 배양시간이 증가함에 따라 항산화능이 증가하는 것으로 확인되었다.
- MRS 고체 평판배지에서 도말 평판법을 통한 순수배양기법으로 JK-17을 분리하였으며, MRS 액체 배지에 접종하고, 진탕배양기 (30°C, 160 rpm)에 배양 유지시키면서 본 연구에 이용하였다.
- MRS 액체배지에 분리세균인 JK-17을 접종하고, 30에서 분당 160회로 회전하는 진탕배양기에 배양시키면서 세균의 생장과 배양기간 중에 생산되는 유기산의 양을 12시간 간격으로 측정하였다. 세균의 생장은 직접계수법을 통하여, 12시간 간격으로 MRS 고체배지에 도말하고 배양 결과를 계수하였다.
- PCR의 수행조건은 이전에 발표된 방법에 따랐다 [10]. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 다음, agarose gel extract kit (Intron, Korea)를 이용하여 gel 상에서 회수하고, 부분적인 염기서열을 결정하였으며, 이 결과를 GenBank database에 등록하였다.
- sakei JK-17의 항균활성 시험은 disc diffusion assay 방법을 이용하여 측정하였다. 농축된 L. sakei JK-17의 농축배양상 등액을 그람양성 세균인 B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus, MRSA, 그람음성 세균인 E. coli, S. enteritidis 등의 6가지 식중독 원인세균에 대하여 각각 노출시키고 24시간 동안 배양하여, disc 주변에 형성되는 투명대 형성여부를 통하여 항균활성을 확인하였다 (Fig. 7). 본 항균활성 조사에서 묵은지에 분리된 L.
- 묵은지에서 L. sakei JK-17을 MRS 액체배지 (pH 7.0)에 접종하고 진탕배양기 (30°C, 160 rpm)에서 배양시키면서 12시간 간격으로 측정하였다 (Fig. 2).
- 배양기간 동안 12시간 간격으로 배양액 1 mL 를 취하여, 13,000 rpm 에서 5분간 원심분리한 후, 상등액 100 µL를 취하여 여과한 0.02% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphtylethylene diamine dihydrochloride, 44.5% HCl을 각각 1 mL씩 첨가하여 암실에서 5분간 방치 후 538 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리세균의 생장과 잔존 유기산의 변화를 조사하였으며, 84시간의 배양 기간동안 생산된 두가지 유기산인 젖산과 아세트산의 생성은 HPLC를 통하여 정량적으로 측정하였다. 배양기간 동안 JK-17의 다양한 기능성을 조사하였다. 아질산염은 약 94.
- 배양상등액의 항균력을 조사하기 위하여 분리세균 JK-17을 MRS 액체 배지에 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양한 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다.
-
2. 16S rRNA 염기서열의 계통수 분석
분리균주인 JK-17의 phylogenetic tree를 작성하기 위하여, PCR을 통해 증폭하여, 부분적인 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 GenBank에 [JX841311]로 등록하였으며, 분리세균을 L. sakei JK-17로 명명하였다
. 이 균주와 Lactobacillus 속 (genus)에 속하는 다른 균주들과의 유사성을 Fig. -
5. HPLC에 의한 유기산 분석
분리세균 JK-17에 의해 생성되는 유기산을 분석하기 위하여 HPLC를 사용하였다
. 분석에 사용된 HPLC system은 SPD10A UV/Vis detector가 부착된 Shimazu 사의 LC-10AT 제품을 사용하였으며, Supelcogel C-610H 컬럼 (300 mm × 7. - sakei JK-17으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [JX841311]로 등재되었다. 분리세균의 생장과 잔존 유기산의 변화를 조사하였으며, 84시간의 배양 기간동안 생산된 두가지 유기산인 젖산과 아세트산의 생성은 HPLC를 통하여 정량적으로 측정하였다. 배양기간 동안 JK-17의 다양한 기능성을 조사하였다.
- 분리세균인 JK-17을 MRS 고체평판배지에 도말하여 생장한 단일집락의 형태를 확인하고, 그람염색을 통한 형태학적 특성을 관찰하였으며, glucose, citrate, 녹말, gelatin 사용여부, methyl red 시험, voges proskauer 시험, indole 생성여부, catalase와 oxidase의 활성여부, klingler iron agar (KIA) 배지에서 H2S 생성 여부, litmus milk 이용여부 등의 여러 가지 생화학적 특성을 조사하였다 [11]. 본 시험에 사용된 MR-VP, Simmon’s citrate, KIA, litmus milk 배지는 Difco사 (Detroit, MI, USA)의 제품을 사용하였다.
- MRS 액체배지에 분리세균인 JK-17을 접종하고, 30에서 분당 160회로 회전하는 진탕배양기에 배양시키면서 세균의 생장과 배양기간 중에 생산되는 유기산의 양을 12시간 간격으로 측정하였다. 세균의 생장은 직접계수법을 통하여, 12시간 간격으로 MRS 고체배지에 도말하고 배양 결과를 계수하였다.
- 아질산염 소거능 측정에 사용된 배지는 1,000µg/mL의 멸균된 sodium nitrite 용액과 Lactobacilli MRS 액체배지를 1:9의 비율로 조성하였다.
- 이 분리 세균 JK-17을 MRS 액체배지에 접종하고 진탕배양기 (30°C,160 rpm)에 배양 유지시키면서 본 연구에 이용하였다.
대상 데이터
- JK-17 균주로부터 genomic DNA를 추출하여 16S rRNA 유전자를 PCR을 사용하여 증폭하였다. 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 8F와 1492R primer를 사용하였다. PCR의 수행조건은 이전에 발표된 방법에 따랐다 [10].
- 본 시험에 사용된 MR-VP, Simmon’s citrate, KIA, litmus milk 배지는 Difco사 (Detroit, MI, USA)의 제품을 사용하였다.
- 분리균주는 배양 이후부터 60시간까지 생장하였으며, 유기산 생산도 증가하는 것으로 조사되었다. 분리세균 L. sakei JK-17이 대사물질로서 생성하는 유기산을 배양액을 채취하여 분석하였는데 배양초기에는 거의 존재하지 않았던 유기산이 배양시간이 지남에 따라 L. sakei JK-17 균주의 생장과 비례하여 생성되었다. Lactic acid와 acetic acid가 혼합된 authentic standard와 비교하였을 때 15.
- 분석에 사용된 HPLC system은 SPD10A UV/Vis detector가 부착된 Shimazu 사의 LC-10AT 제품을 사용하였으며, Supelcogel C-610H 컬럼 (300 mm × 7.8 mm, 입자크기 9 µm)을 이용하였다.
- 5 mL/min이었으며, UV detector의 파장은 210 nm로 맞추어 사용하였다. 유기산은 분석용 표준품과 배양액으로부터 채취한 시료를 대상으로 정량분석하였다 [12].
- 농축된 배양상등액의 항균력은 disc diffusion assay 방법 [10]을 이용하여 확인하였다. 항균력을 조사하기 위해 식중독의 원인이 되는 세균들로 잘 알려진 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 세균을 본 실험에 사용하였다. 대상세균들은 각각 LB 액체배지에 접종한 후 24시간 배양하여 사용하였다.
이론/모형
- L. sakei JK-17의 항균활성 시험은 disc diffusion assay 방법을 이용하여 측정하였다. 농축된 L.
- 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 8F와 1492R primer를 사용하였다. PCR의 수행조건은 이전에 발표된 방법에 따랐다 [10]. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 다음, agarose gel extract kit (Intron, Korea)를 이용하여 gel 상에서 회수하고, 부분적인 염기서열을 결정하였으며, 이 결과를 GenBank database에 등록하였다.
- 농축된 배양상등액의 항균력은 disc diffusion assay 방법 [10]을 이용하여 확인하였다. 항균력을 조사하기 위해 식중독의 원인이 되는 세균들로 잘 알려진 Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) 세균을 본 실험에 사용하였다.
- 아질산염의 소거능은 Ito 등의 방법 [13]에 따라 다음과 같이 실시하였다. 아질산염 소거능 측정에 사용된 배지는 1,000µg/mL의 멸균된 sodium nitrite 용액과 Lactobacilli MRS 액체배지를 1:9의 비율로 조성하였다.
- 0, 37°C)에 배양하며 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 채취하여 실험에 사용하였다. 항산화능 측정은 Blois의 방법 [14]을 참고하여 수소공여 효과로 측정하였다. 항산화능은 다음과 같이 계산하였다.
성능/효과
- 분리세균은 배양시간이 증가함에 따라 항산화능이 증가하는 것으로 확인되었다. 12시간 이후 측정부터 항산화능이 나타나기 시작하였으며, 72시간 후 최종 53.8%로 측정되었다. Song 등 [20] 시판 되는 김치로부터 분리한 Bacillus licheniformis KS-17와 KS20에서 모두 40% 미만의 항산화능을 확인하였으며, Park 등[21]의 경남지역 가정에서 담근 김치를 이용한 실험에서 Pediococcus pentosaceus K-1의 항산화능이 47.
- Starch와 gelatin 가수분해 시험에서 모두 투명대가 형성되지 않았으므로 모두 음성임을 확인할 수 있었다. Catalase와 oxidase 시험, 그리고 색변화와 기포 생성도 모두 음성이었으며, citrate 이용여부도 음성으로 나타났다. KIA 배지로 시험한 disulfhydrase에 의한 H2S의 형성은 양성으로 확인되었으며, litmus milk 시험에서는 펩톤화가 일어나지 않았다 (Table 1).
- sakei JK-17 균주의 생장과 비례하여 생성되었다. Lactic acid와 acetic acid가 혼합된 authentic standard와 비교하였을 때 15.23 min과 17.79 min에서 각각 동일한 peak임이 확인되었다 (Fig. 3). 따라서 이들 두 peaks는 각각 lactic acid와 acetic acid로 확인되었으며, 배양 후 84시간이 경과했을 때, 이들 유기산은 각각 474.
- Methyl red 시험과 Voges-Proskauer 시험 모두에서 음성을 나타내었다. Starch와 gelatin 가수분해 시험에서 모두 투명대가 형성되지 않았으므로 모두 음성임을 확인할 수 있었다. Catalase와 oxidase 시험, 그리고 색변화와 기포 생성도 모두 음성이었으며, citrate 이용여부도 음성으로 나타났다.
- plantarum. YK-9가 배양기간 중에 588.7 mM lactic acid와 255.5 mM acetic acid를 생성하는 것으로 보고하였는데, 본 연구에서 얻어진 유기산과 비교하였을 때, 2년 이상 숙성시킨 묵은지에서 분리한 L. sakei JK-17은 1주일 동안 발효된 김치에서 분리한 세균 YK-9보다는 유기산 생성에서 다소 적은 것으로 측정되었다.
- 본 연구는 장기간 발효된 김치인 묵은지로부터 분리된 Lactobacillus sakei JK-17의 다양한 기능성을 조사하기 위하여 실시되었다. 먼저, 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 균주를 동정하였고, 그 결과 L. sakei JK-17으로 명명하였으며, 이 균주는 GenBank에 [JX841311]로 등재되었다. 분리세균의 생장과 잔존 유기산의 변화를 조사하였으며, 84시간의 배양 기간동안 생산된 두가지 유기산인 젖산과 아세트산의 생성은 HPLC를 통하여 정량적으로 측정하였다.
- 그러나 깊은 맛을 가지는 묵은지의 다양한 기능성에 관한 연구는 상대적으로 미흡한 것이 사실이다. 본 연구를 통해서 우리의 전통 발효식품중의 한가지인 묵은지에서 분리된 L. sakei JK-17은 장기간의 숙성기간에도 불구하고 우리 건강에 유익한 여러 가지 기능성이 유지 보존 된다는 것이 입증되었다.
- 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 발생과 항산화 작용사이의 불균형이 발생하였을 때, 활성산소에 의한 DNA, 단백질, 지질, 그리고 작은 세포분자들의 산화적인 변형이 발생하여 일반적인 질병들과 노화와 관련된 퇴화 질환에 넓은 범위에서 영향을 준다 [22-24]. 본 연구에서 사용된 묵은지에서 분리한 JK-17은 노화뿐 만 아니라, 각종 질병을 유발시키는 활성산소를 효과 적으로 소거하는 것으로 사료된다.
- 7). 본 항균활성 조사에서 묵은지에 분리된 L. sakei JK-17 농축배양상등액은 시험대상 세균 모두에서 투명대가 관찰되어 항균활성이 있는 것으로 확인되었으며, 이 결과는 일주일 동안 발효된 김치에서 분리한 L. plantarum YK-9에서 S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes, E. coli, E. faecalis, S. enteridis 등의 세균들에 대하여 보여준 항균활성과 유사한 것으로 밝혀졌다 [10]. 이 결과는 2년 이상 발효된 묵은지에서 유래하는 젖산세균의 농축배양상등 액이 1주일간 발효된 김치에서 분리된 젖산세균의 농축배양상등액과 비교하여 볼 때, 항균활성에 있어서 유사한 차이를 보여주었다.
- 2). 분리균주 L. sakei JK-17은 배양시작 후 42시간까지 지속적으로 pH가 낮아졌으며, 48시간부터 유지되는 것을 확인하였다. 배양초기의 MRS 액체 배지의 pH는 7.
- 3). 분리균주는 배양 이후부터 60시간까지 생장하였으며, 유기산 생산도 증가하는 것으로 조사되었다. 분리세균 L.
- 5). 분리세균은 배양시간이 증가함에 따라 항산화능이 증가하는 것으로 확인되었다. 12시간 이후 측정부터 항산화능이 나타나기 시작하였으며, 72시간 후 최종 53.
- 387 units/mL를 보여주었다. 식중독 원인세균에 대한 항균활성은 L. sakei JK-17로부터 20배 농축된 배양상등액에서 조사하였으며, 항균활성은 본 실험에 사용된 식중독 원인세균 모두에 대하여 활성이 있는 것이 관찰되었다.
- 배양기간 동안 JK-17의 다양한 기능성을 조사하였다. 아질산염은 약 94.75%가 소거되었으며, 항산화능은 약 53.8%를 나타내었다. β-galactosidase 활성을 측정한 실험에서 pH 7.
- enteridis 등의 세균들에 대하여 보여준 항균활성과 유사한 것으로 밝혀졌다 [10]. 이 결과는 2년 이상 발효된 묵은지에서 유래하는 젖산세균의 농축배양상등 액이 1주일간 발효된 김치에서 분리된 젖산세균의 농축배양상등액과 비교하여 볼 때, 항균활성에 있어서 유사한 차이를 보여주었다. 항균활성에관여하는요인으로는 유기산 (organic acids), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 디아세틸 (diacetyl), 박테리오신 (bacteriocin) 등이 알려져 있으며, 특히 많은 Lactobacillus 종에서 생산되는 박테리오신은 그람양성과 그람음성세균에 대하여 넓은 항균스펙트럼을 가지는 것으로 보고되고 있다.
- 9%로 나타난 것을 확인하였다. 이들 결과와 비교하였을 때, JK-17의 항산화능은 비교적 우수함을 알 수 있었다. 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 발생과 항산화 작용사이의 불균형이 발생하였을 때, 활성산소에 의한 DNA, 단백질, 지질, 그리고 작은 세포분자들의 산화적인 변형이 발생하여 일반적인 질병들과 노화와 관련된 퇴화 질환에 넓은 범위에서 영향을 준다 [22-24].
- 6). 접종 후 12시간 경과 후 pH 7.0에서 0.243 units/mL의 효소 활성으로 가장 높게 나타났으며, 그 이후 균주의 pH 값이 낮아 짐에 따라 활성이 급격하게 낮아졌다. 한편 pH 4.
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