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문제 정의
- 본 연구는 회귀 . 멸종위기 동물의 보존 및 인간의 질병치료기술 응용 등에 이용하기 위하여 이종간 핵이식란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로서 수핵난자 및 공여세포의 조건이 융합율, 분할율 및 체외발달에 미치는 영향을 밝히고자 각종 요인들을 조사하였다. 공여세포의 준비는 산양의 귀세포를 채취하여 0.
- 그러나 핵이식에 의한 복제동물생산은 낮은 수태율, 거대 산자, 조기노화 내지 사망, 기형산자 생산 등의 문제가 해결 되지 않고 있으며, 뿐만 아니라, 미세조작기술, 공여핵과 수 핵란의 세포주기조절, 공여핵의 종류, 공여핵의 분화정도 핵이식란의 융합, 활성화, 배양조건, 핵이식란의 reprogramming 기전 등을 해결하기 위해서는 많은 연구가 진행되어야 할 것이다. 본 연구는 인간의 질병치료 및 멸종위기동물 의 종 보존 등에 활용할 수 있는 기초자료를 얻고자 재래산 양(Capra hircus)을 공여세포로 이용하고 소와 돼지 난자를 수핵란으로 하여 이종간 핵이식을 실시하여 융합, 분할 및 체외발달율 등을 조사하여 최적의 수핵난자 및 공여세포의 조건을 검토하였다.
제안 방법
- A) 및 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 동결 보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 39℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거한 다음 10% FBS가 첨가된 신선한 TCM-199 배양액을 첨가 하여 4-well dish에 분주하여 배양기 내에서 배양을 실시하였다. 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 배양한 세포가 dish 바닥에 monolayer 형성이 충분히 되었을 때, 0.5% FBS 가 첨가된 TCM-199 배양액으로 기아배양를 실시하였다. 기아배양은 3일 이상 실시하여 세포주기를 G0기 및 G1기로 유도한 다음 공여세포로 사용하였으며, confluence 방법은 세포를 장기 배양하여 높은 세포밀도를 만들어 주어 G0기 및 이기로 유도한 후 핵이식에 사용하였다.
- 전기적 활성화를 유도한 이종간 핵이식란의 체외배양은 수핵란이 소 난자를 이용한 경우 소 난관상피세포의 mono- layer?}- 형성된 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣어 5% CCh, 98~99% 습도 39℃ 배양기 내에서 48시간마다 10% FBS가 첨가된 신선한 TCM-199 배양액으로 교환하면 서 7~9일 동안 체외배양을 실시하였으며, 수핵란이 돼지 난 자를 이용한 경우는 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액에 넣어 5% CCh, 98~99% 습도 39℃ 배양기 내에서 48시간마다 10% FBS가 첨가된 신선한 NCSU-23 배양액으로 교환하면서 6~8일까지 체외배양을 실시하여 후기배로의 발달을 유도하였다. 염색체 분석은 본 학과 세포유전학실험실에서 실시하여 하였다.
- 이때 drillinge 핵이식조작시 불필요한 배양액의 침투 등을 막기 위하여 zona 두께의 약 60-80% 정도의 부분적 drilling 하였다. 공여세포가 주입된 수핵난자는 cytochalasin B의 충격으로부터 수핵난자를 예방하기 위하여 곧바로 조작용 배양액에서 10% FBS가 첨가된 D-PBS로 옮긴 다음 전기융합 전까지 10% FBS가 첨가된 TCM-199 및 NCSU-23 배양액에서 30분~1시간 동안 배양을 실시하였다.
- 공여세포의 동결은 10% DMSCXSigma, U.S.A) 및 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 동결 보존해 두고, 핵이식에 사용할 때는 39℃ 온수에 융해하여 동결보호제를 제거한 다음 10% FBS가 첨가된 신선한 TCM-199 배양액을 첨가 하여 4-well dish에 분주하여 배양기 내에서 배양을 실시하였다. 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 배양한 세포가 dish 바닥에 monolayer 형성이 충분히 되었을 때, 0.
- 5% FBS 가 첨가된 TCM-199 배양액으로 기아배양를 실시하였다. 기아배양은 3일 이상 실시하여 세포주기를 G0기 및 G1기로 유도한 다음 공여세포로 사용하였으며, confluence 방법은 세포를 장기 배양하여 높은 세포밀도를 만들어 주어 G0기 및 이기로 유도한 후 핵이식에 사용하였다.
- 난포란의 체외성숙은 소 난포란의 경우 25mM의 Hepes가 첨가된 TCM-199 체외성숙용 기본배양액에 10% FBS, 10μg/ml LH(luteinzing hormone), lμg/ml estradiol 17-p 및 35μg/ml FSH(follicular stimulating hormone)을 첨가하였으며, 돼지 난 포란은 NCSU-23에 10% FBS, 10% pFF(porcine follicular fluid), 10/zg/me LH(Sigma, U.S.A), 1/zg/me estradiol 17-p(Sigma, U.S.A), 2.5μg/ml FSH(Sigma, U.S.A) 및 2IU/ml hCG(human chorionic hormone)을 첨가하여 5% CO2 98-99% 습도, 39℃ 배양기 내에서 3시간 이상 전 배양을 시킨 다음 4 well- dish(NUNC, Denmark)에 well 당 30~40개의 미성숙 난포란을 적하하여 소 난포란은 24시간, 돼지 난포란은 46~48시간 동안 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다.
- 본 실험에 사용된 귀 유래 공여세포는 성숙한 재래산양 (Capra hireus)으로부터 귀를 5 x 5mm 정도 크기로 절제 하여 채취하였으며, D-PBS(Sigma, U.S.A)로 세정한 후 미세하게 세절하여 0.25% trypsin(Gibco, U.S.A)과 EDTA(Sigma, U.S.A) 가 첨가된 D>PBS로 분리한 다음 10% FBS(Gibco, U.S.A)가 첨가된 TCM-199(Sigma, U.S.A) 배양액으로 중화 및 원심분리를 실시하여 세정하였다. 세정한 세포는 10% FBS가 첨가 된 TCM-199로 25面 flask(Falcon, U.
- A) 배양액으로 중화 및 원심분리를 실시하여 세정하였다. 세정한 세포는 10% FBS가 첨가 된 TCM-199로 25面 flask(Falcon, U.S.A)에 분주하여 5% CC)2 98-99% 습도 39℃ 배양기 내에서 배양을 실시하였으며, 배양 후 바닥에 세포가 붙는 것을 확인 후 신선한 배양액으로 매 3일 간격으로 교체하면서 배양을 실시하였다. 계대배양 은 공여세포가 flask에서 90% 이상 confluence 되었을 때 0.
- 소 난포란의 체외수정은 체외수정용 기본배양액인 세척용 BO( -) 용액과 수정용 BO(+) 용액을 dish에 소적을 만들어 파라핀 오일로 피복하여 CO2 배양기내에서 24시간 전 배양을 실시하였다. 체외수정용 정액은 도축장에서 도살되는 숫소의 정소상체 미부에서 채취한 정액을 사용하였으며, 채 취한 정자는 정장내의 수정능억제물질을 제거하기 위하여 BO( -)로 2~4배 희석한 다음 2, 500 rpm에서 5분간 2회 원심 분리하여 1시간동안 5% CO2 98~99% 습도 39 ℃ 배양기 내에서 swim-up법으로 유도한 후 다시 상층액을 취하여 B0 (-) 2회, B0(+) 1회 원심분리 후 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다.
- 전기적 활성화를 유도한 이종간 핵이식란의 체외배양은 수핵란이 소 난자를 이용한 경우 소 난관상피세포의 mono- layer?}- 형성된 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액에 넣어 5% CCh, 98~99% 습도 39℃ 배양기 내에서 48시간마다 10% FBS가 첨가된 신선한 TCM-199 배양액으로 교환하면 서 7~9일 동안 체외배양을 실시하였으며, 수핵란이 돼지 난 자를 이용한 경우는 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액에 넣어 5% CCh, 98~99% 습도 39℃ 배양기 내에서 48시간마다 10% FBS가 첨가된 신선한 NCSU-23 배양액으로 교환하면서 6~8일까지 체외배양을 실시하여 후기배로의 발달을 유도하였다. 염색체 분석은 본 학과 세포유전학실험실에서 실시하여 하였다.
- 융합이 이루어진 핵이식 수정란의 활성화는 전기세포융 합장치로 교류전류(AC) 5 v/mm, 5 sec, 1회와 직류전류(DC) 1.56 kv/cm, 30 msec, 1회 전기적 자극으로 융합란의 활성화를 유도하였다.
- 즉, laser system 이 부착된 도립현미경하에서 laser전용 렌즈( X400)로 drilling 할 수핵난자의 투명대를 맞춘 다음 20~ 40jisec의 강도로 laser를 1~2회 투과시킴으로써 zona drilling을 실시하였다. 이때 drillinge 핵이식조작시 불필요한 배양액의 침투 등을 막기 위하여 zona 두께의 약 60-80% 정도의 부분적 drilling 하였다. 공여세포가 주입된 수핵난자는 cytochalasin B의 충격으로부터 수핵난자를 예방하기 위하여 곧바로 조작용 배양액에서 10% FBS가 첨가된 D-PBS로 옮긴 다음 전기융합 전까지 10% FBS가 첨가된 TCM-199 및 NCSU-23 배양액에서 30분~1시간 동안 배양을 실시하였다.
- 체외수정용 정액은 도축장에서 도살되는 숫소의 정소상체 미부에서 채취한 정액을 사용하였으며, 채 취한 정자는 정장내의 수정능억제물질을 제거하기 위하여 BO( -)로 2~4배 희석한 다음 2, 500 rpm에서 5분간 2회 원심 분리하여 1시간동안 5% CO2 98~99% 습도 39 ℃ 배양기 내에서 swim-up법으로 유도한 후 다시 상층액을 취하여 B0 (-) 2회, B0(+) 1회 원심분리 후 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다. 이때 정자의 농도는 1 ~2X106/ml이 되게 조정하였고 수정용 소적에 난자를 주입하여 체외수정을 유도하였으며, 수정이 완료된 수정란은 TCM-199 배 양액 으로 3 ~4회 세척 하여 난구세포와 정자를 제거한 다음 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액과 난관상피세포의 monolayer가 형성된 24 well-dish (Coming, U.S.A)에 넣어 5% CQ 98~99% 습도, 39℃ 배양기 내에서 48시간마다 10% FBS가 첨가된 신선한 TCM-199 배 양액으로 교환하면서 7~9일까지 체외배양을 실시하여 후 기배로의 발달을 유도하였다.
- 채취한 정자는 기본배양액으로 2~4 배 희석한 다음 500 rpm에서 10분간 2회 원심분리하여 5% CO2 98-99% 습도 39℃ 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다. 이때 정자의 농도는 1 ~2xl06/i也이 되게 조정하였고 수정용 소적에 난자를 주입하여 체외수정을 유도하였으며, 수정이 완료된 난자는 NCSU-23배양액으로 3~4회 세척하여 난구세포와 정자를 제거한 다음 24 well-dish(Coming, U.S.A)에 넣어 5% CO: 98-99% 습도 39℃ 배양기 내에서 3일 동안은 NCSU- 23 배양액으로 3일 이후부터는 10% FBS가 첨가된 신선한 NCSU-23 배양액으로 교환하면서 6~8일까지 체외배양을 실시하여 후기배로의 발달을 유도하였다.
- Laser system(MTM, Switzerland)을 이용한 zona drillinge Park 등(2001)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉, laser system 이 부착된 도립현미경하에서 laser전용 렌즈( X400)로 drilling 할 수핵난자의 투명대를 맞춘 다음 20~ 40jisec의 강도로 laser를 1~2회 투과시킴으로써 zona drilling을 실시하였다. 이때 drillinge 핵이식조작시 불필요한 배양액의 침투 등을 막기 위하여 zona 두께의 약 60-80% 정도의 부분적 drilling 하였다.
- 체외성숙이 이루어진 수핵난자는 0.3% hyluronidase (Sigma, U.S.A)가 첨가된 D-PBS로 3~5분간 처리하여 난구세포를 제거하고, 0.05 M sucrose(Sigma, U.S.A) 및 10% FBS가 첨가된 D-PBS에서 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 사용하였다. 핵이식은 먼저 2개의 각 기 다른 배양액 (60~80 μl) 소적을 만들었으며, 첫 번째 소적에는 10% FBS가 첨가된 D-PBS 배양액에 7.
- 배양기내에서 24시간 전 배양을 실시하였다. 체외수정용 정액은 도축장에서 도살되는 숫소의 정소상체 미부에서 채취한 정액을 사용하였으며, 채 취한 정자는 정장내의 수정능억제물질을 제거하기 위하여 BO( -)로 2~4배 희석한 다음 2, 500 rpm에서 5분간 2회 원심 분리하여 1시간동안 5% CO2 98~99% 습도 39 ℃ 배양기 내에서 swim-up법으로 유도한 후 다시 상층액을 취하여 B0 (-) 2회, B0(+) 1회 원심분리 후 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다. 이때 정자의 농도는 1 ~2X106/ml이 되게 조정하였고 수정용 소적에 난자를 주입하여 체외수정을 유도하였으며, 수정이 완료된 수정란은 TCM-199 배 양액 으로 3 ~4회 세척 하여 난구세포와 정자를 제거한 다음 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액과 난관상피세포의 monolayer가 형성된 24 well-dish (Coming, U.
- 1 kv/cm, 30 jisec, 1회 통전하여 세포융합을 유도하였다. 통전 후 핵이식란은 수핵란이 소난자의 경우 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로, 돼지 난자는 10% FBS 가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 배양을 실시하였다. 융합여부는 배양 후 1시간 정도 경과 후에 판단하였다.
- 핵이식에 사용된 피펫은 직경이 1mm인 capillary tube (Narishige, Japan)를 세척한 다음 Sigmacoat(Sigma U.S.A)로 실리콘 처리를 한 후 멸균시켜 보정용 피펫(holding pipette), 탈핵 용 피펫(enucleation pipette) 및 주입용 피펫(injection pipette)을 각각 달리 제작하였으며, 피펫의 세공은 먼저 micropipette puller(Narishige, Japan)를 이용하여 피펫을 날카롭게 뽑은 다음 micropipette grinder(Narishige, Japan)로 끝부분을 경사지고 날카롭게 제작하였다. 보정용 피펫은 끝부분 을 일직선이 되게 절단한 후 microforge(Narishige, Japan)로 무디게 하였으며, 이때 피펫의 외경은 160~180㎛의 크기로 제작하였다.
- A) 및 10% FBS가 첨가된 D-PBS에서 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 사용하였다. 핵이식은 먼저 2개의 각 기 다른 배양액 (60~80 μl) 소적을 만들었으며, 첫 번째 소적에는 10% FBS가 첨가된 D-PBS 배양액에 7.5 μg/ml의 cytochalasin B(Sigma, U.S.A)와 0.05M의 sucrose를 첨가하여 수핵 난자를 넣었다. 두 번째 소적에는 기아배양을 실시한 공여세포를 필요한 양만큼 넣고 먼저 주입용 피펫에 다수의 공여세포를 흡입하여 loading한 후 수핵난자는 탈핵 및 주입용 피펫의 삽입을 용이하게 하기 위하여 zona drilling한 다음 탈핵용 피펫을 위란강내로 진입시켜 극체와 세포질을 흡입하여 제거하였다.
- 25% Tiypsin-EDTA의 처리로 세포를 분리, 배양하여 사용하였다. 핵이식은 성숙된 난자의 극체 및 전핵을 laser system으로 투명대를 drilling하여 제거 하고 준비된 공여세포를 핵이 제거된 난자에 주입하여 전기적 자극으로 융합을 실시하여 융합된 난자는 전기적 자극으 로 활성화를 유도하였다. 활성화가 이루어진 복제수정란은 수핵란이 소난자의 경우 monolayer가 형성된 10% FBS가 첨가된 TCM199 배양액에서 7~9일 동안 체외배양 하였으며, 수핵란이 돼지의 경우 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 유도하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 난포란은 도축장에서 도축되는 암소 및 모돈 난소의 난포로부터 채취하였으며, 난포란은 난구세포 층이 치밀하고 세포질이 양호한 난포란만을 선별하여 체외 성숙을 유도하였다.
- 체외수정용 정액은 도축장에서 도살되는 성숙 웅돈의 정소상체 미부로부터 채취한 정액을 사용하였다. 채취한 정자는 기본배양액으로 2~4 배 희석한 다음 500 rpm에서 10분간 2회 원심분리하여 5% CO2 98-99% 습도 39℃ 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다. 이때 정자의 농도는 1 ~2xl06/i也이 되게 조정하였고 수정용 소적에 난자를 주입하여 체외수정을 유도하였으며, 수정이 완료된 난자는 NCSU-23배양액으로 3~4회 세척하여 난구세포와 정자를 제거한 다음 24 well-dish(Coming, U.
- A)을 첨가하여 dish에 소적을 만들어 파라핀 오일로 피복하여 CO2 배양기 내에서 24시간 전 배양을 실시하였다. 체외수정용 정액은 도축장에서 도살되는 성숙 웅돈의 정소상체 미부로부터 채취한 정액을 사용하였다. 채취한 정자는 기본배양액으로 2~4 배 희석한 다음 500 rpm에서 10분간 2회 원심분리하여 5% CO2 98-99% 습도 39℃ 배양기에서 10~15분간 정치하여 활력이 양호한 상층정자만을 채집하여 사용하였다.
- 핵이식이 완료된 난자의 공여세포와 수핵난자의 세포질 융합은 전기세포융합장치(BTX, U.S.A)로 실시하였다. 이때 융합배지는 O.
데이터처리
- 실험결과의 통계학적 분석은 SAS package를 이용하여 요인 간의 유의차를 검정하였다.
이론/모형
- Laser system(MTM, Switzerland)을 이용한 zona drillinge Park 등(2001)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉, laser system 이 부착된 도립현미경하에서 laser전용 렌즈( X400)로 drilling 할 수핵난자의 투명대를 맞춘 다음 20~ 40jisec의 강도로 laser를 1~2회 투과시킴으로써 zona drilling을 실시하였다.
성능/효과
- 5% serum을 첨가하여 혈청기아배양(serum starvation)을 실시하였을 때 이 종간 핵이식란의 체외발달율은 Table 1에서 보는 바와 같다. 공여세포를 과배양과 혈청기아배양 방법으로 세포주기 동기화를 유도하여 핵이식을 실시하였을 때 수핵란이 소의 난자인 경우 과배양 방법은 53.1%가 2-세포기로 분할하였으며, 상실배와 배반포기로의 발달은 9.8%였다. 반면에 혈청기 아 배양방법은 52.
- 이상의 결과로 볼 때 이종간 핵이식란은 체외수정란에 비하여 상실배 및 배반포기로의 발달율이 낮게 나타났으며, 산양의 이종간 핵이식시 수핵란은 돼지보다는 소를 사용하는 게 좋을 것으로 생각된다. 이종간 핵이식에 있어서 수핵란, 공여세포, 융합, 활성화 및 배양조건 등 아직 초보 수준에 있으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 이러한 문제들이 해결되면 멸종위기 상태에 있는 동물들의 종 보존에도 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 3% 였으나, 10-14 passage는 전혀 발달이 되지 않았다. 이종간 핵이식란의 체외발달에 있어서 수핵란이 소 난 자의 경우 상실배와 배반포기로의 발달율이 22.6%로써 체외 수정란(33.9%) 및 단위발생란(28.1%)과 차이가 없었으며, 돼 지 난자의 경우는 이종간 핵이식란이 5.1%로써 체외수정란 및 단위발생란의 26.9 및 37.4% 보다 유의적 (F< 0.05)으로 낮게 나타났다.
- 이종간 핵이식란의 체외발달에 있어서 수핵란이 소 난자 의 경우 상실배와 배반포기로의 발달율이 22.6%로써 체외수 정란(33.9%)과 차이가 없었으며, 돼지 난자의 경우는 이종간 핵이식란이 5.1%로써 체외수정란 26.9%보다 유의적(F< 0.05)으로 낮게 나타났다.
후속연구
- 그러나 핵이식에 의한 복제동물생산은 낮은 수태율, 거대 산자, 조기노화 내지 사망, 기형산자 생산 등의 문제가 해결 되지 않고 있으며, 뿐만 아니라, 미세조작기술, 공여핵과 수 핵란의 세포주기조절, 공여핵의 종류, 공여핵의 분화정도 핵이식란의 융합, 활성화, 배양조건, 핵이식란의 reprogramming 기전 등을 해결하기 위해서는 많은 연구가 진행되어야 할 것이다. 본 연구는 인간의 질병치료 및 멸종위기동물 의 종 보존 등에 활용할 수 있는 기초자료를 얻고자 재래산 양(Capra hircus)을 공여세포로 이용하고 소와 돼지 난자를 수핵란으로 하여 이종간 핵이식을 실시하여 융합, 분할 및 체외발달율 등을 조사하여 최적의 수핵난자 및 공여세포의 조건을 검토하였다.
- 이러한 멸종위기 야생동물의 종 보존을 위한 개체증식은 개체수가 너무 적어 동종간의 교배법에 의한 번식은 불가능한 실정이다. 이 종간 핵이식은 개체수가 많은 가축의 난자를 수핵란으로 활용함으로써 난자확보 문제의 해결과 수란우를 가축을 이용 하면 멸종위기 야생동물의 증식 문제를 해결할 수 있는 대안이 될 수 있을 것이다.
- 본 연구결과와 상이한 성적은 동물종의 차이, 공여세포의 종류, 융합과 활성화 방법 등의 차이에 기인하는 것으로 생각된다. 이상의 결과를 볼 때 이종간 핵이식에서 공여세포의 계대배양에 관한 연구가 없어서 직접적으로 비교하기는 어려우나, 공여세포를 장기간 계대배양을 실시하면 배양조건에 따라서 세포의 노화, 염색체 이상 등의 유발로 인하여 융합, 분할 및 배반포기로의 발달율에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 결과에서 보면 세포주기 동기화는 혈청기아배양 방법이 널리 이용되는 방법이나, 아직까지 적정 배양기간, 생존성 등이 보완되어야 하며, confluence 방법은 보다 앞으로 세밀한 연구 검토가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 실험결과로 보아 산양의 체세포를 이용한 이종간 핵이식 복제수정란의 생산을 위하여 수핵란으로 소와 돼지를 사용하여 복제수정란의 발달을 확인할 수 있었으며, 이종 간 핵이식에 있어서 수핵란, 공여세포, 융합, 활성화 및 배양 조건 등 아직 초보 수준에 있으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 이러한 문제들이 해결되면 멸종위기 상태에 있는 동물들의 종 보존에도 활용이 가능할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로 볼 때 이종간 핵이식란은 체외수정란에 비하여 상실배 및 배반포기로의 발달율이 낮게 나타났으며, 산양의 이종간 핵이식시 수핵란은 돼지보다는 소를 사용하는 게 좋을 것으로 생각된다. 이종간 핵이식에 있어서 수핵란, 공여세포, 융합, 활성화 및 배양조건 등 아직 초보 수준에 있으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 이러한 문제들이 해결되면 멸종위기 상태에 있는 동물들의 종 보존에도 활용이 가능할 것으로 생각된다.
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