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문제 정의
- 그러나 이러한 여러 종류의 지지체들은 적심성이 일련적으로 다르다고 할지라도 표면의 화학적 구조나 표면에 그라프트된 정도가 모두 일정하지 않기 때문에 동일한 조건에서 실험을 수행하였다고 할 수 없다. 따라서 본 연구에서는 LDPE 필름을 사용하여 재료의 화학구조는 일정하며 단지 필름표면의 접촉각 만을 변화시켜 세포와의 상호작용에 대하여 연구하였다.
- 본 연구에서는 BMSCs가 생체재료를 어떻게 인식하는 지에 대해 알아보기 위하여 플라즈마로 재료표면을 개질하고 플라즈마 처리 시간에 따른 접촉각을 측정하였다. 또한 조직공학의 중요한 요소 중의 하나인 BMSCs 세포의 성장 및 부착에 있어서 재료표면의 접촉각에 따른 세포 수 관찰과 세포의 증식률을 확인하고 RT-PCR을 통해 암형성 유전자인 c-myc, c-fos 및 암억제 유전자인 p53의 발현을 확인하였다.
- 본 연구에서는 재료의 적심성 표면성질에 따른 세포의 부착과 성장을 플라즈마 처리시간에 따른 필름표면의 변화, 초기 세포 부착도와 성장률 및 성장에 관련된 유전자 발현여부를 통해서 알아보고자 하였다.
제안 방법
- PCR에 사용한 프라이머는 진텍(Korea)으 로부터 구입하였으며 프라이머 서열은 Table 2에 나타내었다.28, 3941 또한 ldpe 필름에 세포실험을 하기 전에 물 접촉각이 80°인 폴리스티렌 배양용기에 단층 배양한 골수유래 줄기세포에서 mJWA를 분리한 후 RT-PCR을 수행하여 위의 유전자 발현을 전기영동을 통해 관찰하였다.
- 역전사 중합효소 연쇄반응이란 분리한 RNA를 cDNA로 역전사시킨 후 열처리를 통해 두 가닥의 DNA 를 한 가닥의 DNA로 해리시키고 해리된 DNA에 프라이머를 반응시켜 온도를 낮추면 프라이머가 상보적인한 가닥의 DNA/게 결합하게 되며 이때 4 종류의 기질이 공존하는 상태에서 DNA 중합효소를 작용시켜 프라이머를 신장시키면 원하는 DNA의 특정영역을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RT-PCR 반응시킨 생성물을 1.2% (w/v) 아가로 스 젤에 전기 영동 (Spectroline, UV Transilluminator, USA) 한 후, 측정한 사진으로 젤의 형광을 측정하여 c-fbs, c- myc 및 p53 유전자를 housekeeping gene 인 β-actin으로 표준화하였다. PCR에 사용한 프라이머는 진텍(Korea)으 로부터 구입하였으며 프라이머 서열은 Table 2에 나타내었다.
- 본 연구에서는 BMSCs가 생체재료를 어떻게 인식하는 지에 대해 알아보기 위하여 플라즈마로 재료표면을 개질하고 플라즈마 처리 시간에 따른 접촉각을 측정하였다. 또한 조직공학의 중요한 요소 중의 하나인 BMSCs 세포의 성장 및 부착에 있어서 재료표면의 접촉각에 따른 세포 수 관찰과 세포의 증식률을 확인하고 RT-PCR을 통해 암형성 유전자인 c-myc, c-fos 및 암억제 유전자인 p53의 발현을 확인하였다.
- 본 연구에서는 LDPE 필름에 플라즈마 처리를 수행한 후9,10 LDPE 필름의 접촉각을 측정하고 그에 따른 세포 증식 및 세포 분열 시 나타나는 암형성 유전자 (c-fbs, c- myc)와 암억제 유전자 (p53)의 발현정도를 비교하여 세포와 LDPE 필름의 접촉각 사이의 상호관계를 관찰하였다
- 세포 수 계수가 끝난 세포현탁액을 배양액으로 2번 세척해주고 원심분리기를 사용하여 펠렛으로 만든 다음 TRIzol을 처리하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA는 UV 분광기를 사용하여 O. D. 260/280 값을 측정하여 정량하였고, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응이란 분리한 RNA를 cDNA로 역전사시킨 후 열처리를 통해 두 가닥의 DNA 를 한 가닥의 DNA로 해리시키고 해리된 DNA에 프라이머를 반응시켜 온도를 낮추면 프라이머가 상보적인한 가닥의 DNA/게 결합하게 되며 이때 4 종류의 기질이 공존하는 상태에서 DNA 중합효소를 작용시켜 프라이머를 신장시키면 원하는 DNA의 특정영역을 증폭시킬 수 있는 기술이다.
- 상층액을 제거하고 세포를 lx IO, cells/cm2 의 농도로 37 ℃, 5%의 CO2 세포배양기에서 배양하였다. 세포 배양액은 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM : Gibco BRL, Grand Island, NY USA) 에 10% 우태혈청 (FBS : Gibco)과 10% 말혈청 (HS : Gibco)과 2% 항생제 (100 units/ mL 페니실린과 100 gg/rnL 스트렙토마이신, Gibco)를 첨 가하였다. 배양된 세포는 2일에 한번씩 배양액을 교체해 주었으며, 15일에 한번씩 계대배양해 주었다.
- 이°또한 플라즈마를 처리 한 다음 시간이 경과함에 따라 플라즈마 처리시간이 길 수록 접촉각이 50~60°까지 다시 증가하는 것을 볼 수 있는데 이는 일시적으로 플라즈마를 처리하여 필름표면의 접촉각을 감소시켰을지라도 생성된 작용기의 소멸에 의 히-여 본래의 성질대로 회귀하려 하기 때문에 감소된 접 촉각이 원래의 접촉각으로 회복하려는 현상을 보이는 것 이라 사료된다. 이런 결과는 플라즈마 처리 후에 바로 세 포를 파종하지 않으면 정확한 실험이 될 수 없음을 의미 하고 있으며 따라서 본 실험은 플라즈마 처리 후 바로 세 포를 파종하여 실험을 진행하였다.
- 8, 1, 5, 10 및 20초 동안 플라즈마를 처리하고 진공을 제거하여 즉시 필름의 접촉각을 측정한 후 세포를 파종하였다 (Table 1). 적 심성의한 척도인 접촉각은 접촉각 측정기 (Model 1000, Rame-Hart, Inc. USA)를 사용하여 측정하였으며, 각 샘플의 양 끝부분과 가운데 부분에 증류수 4 μL를 떨어뜨린 후 접촉각을 측정하였다.
- 세포 수의 관찰. 적심성이 서로 다른 각각의 LDPE 필름에 골수유래 줄기세포를 파종하여 1일 및 2일 동안 배양한 후 트립신-EDTA 용액 (Gibco)을 사용하여 LDPE 필름으로부터 세포를 떼어내어 헤마사이토메터 (Levy hemacytometer, Hausser scientific, USA)로 세포의 수를 계수하 였다
- 골수유래 줄기세포의 분리와 배양 사람의 골수유래 줄기세포는 14 게이지의 바늘과 3000 U 헤파린을 포함하는 수용액이 든 주사기를 사용하여 골수에서 채취하였다. 채취한 골수는 50% 퍼콜 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA) 점진 구배 용액에 천천히 떨어뜨려 퍼콜층과 섞이지 않게 하고, 원심분리기로 500 g에서 25분간 원 심분리하여 적혈구층, 퍼콜층, 세포층 및 혈장층으로 분 리하였다. 마이크로 피펫을 사용하여 세포층만을 분리하여 배양액으로 희석시킨 후 1000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다.
- 개질된 LDPE 필름표면에서 세포의 배양. 플라즈마 처리로 개질된 LDPE 필름의 접촉각에 따른 세포의 부착 및 증식 거동을 확인하기 위하여 사람의 골수유래 줄기세포를 사용하였다 골수로부터 분리하여 37 ℃, 5% CO2 세포배 양기에서 배양한 세포를 트립신-EDTA (Gibco)로 배양 플 라스크로부터 떼어내어 적심성이 서로 다른 각각의 LDPE 필름에 1X10* 5 cells/film으로 파종하여 다시 동일한 조건의 세포배양기에서 1일 및 2일 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 2% (w/v) 아가로 스 젤에 전기 영동 (Spectroline, UV Transilluminator, USA) 한 후, 측정한 사진으로 젤의 형광을 측정하여 c-fbs, c- myc 및 p53 유전자를 housekeeping gene 인 β-actin으로 표준화하였다. PCR에 사용한 프라이머는 진텍(Korea)으 로부터 구입하였으며 프라이머 서열은 Table 2에 나타내었다.28, 3941 또한 ldpe 필름에 세포실험을 하기 전에 물 접촉각이 80°인 폴리스티렌 배양용기에 단층 배양한 골수유래 줄기세포에서 mJWA를 분리한 후 RT-PCR을 수행하여 위의 유전자 발현을 전기영동을 통해 관찰하였다.
- 골수유래 줄기세포의 분리와 배양 사람의 골수유래 줄기세포는 14 게이지의 바늘과 3000 U 헤파린을 포함하는 수용액이 든 주사기를 사용하여 골수에서 채취하였다. 채취한 골수는 50% 퍼콜 (Sigma Chem.
- LDPE 필름시료의 준비. 아무런 첨가제도 첨가되지 않은 LDPE 필름은 한양화학 (Korea)으로부터 구입하였다 두께가 0.22 mm인 투명한 LDPE 필름을 5X5 cm?의 크기로 잘라 에탄올과 초음파 세척기를 이용하여 3회 세척하여 진공오븐기로 7일 이상 건조한 후 진공건조기에 보 관하였다
성능/효과
- 암억제 유전자인 p53은 접촉 각이 70, 60, 40 및 30°인 표면에서 띠가 밝게 보이는 것으로 보아 이들 샘플에서 세포의 주기진행과 DNA의 보전이 잘 이루어지고 있다고 사료된다. 2일 배양한 RT- PCR 결과를 보면 β-actin, c-myc, c-fos 및 p53 유전자는 전 체적으로 모든 표면에서 잘 발현된 것으로 보이며 1일 배양한 것에 비해 전체적으로 띠가 밝고 크게 보였다. 또한 1일 배양에서는 p53 유전자가 접촉각이 90° 및 50°인 표면에서 띠가 매우 희미했던 반면에 2일 배양에서 뚜 렷하게 보이고 있는 것으로 보아 세포성장이 우수하며 세 포의 성장과 관련된 유전자 발현 또한 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
- Figure 2에 나타내었듯이 플라즈마를 짧 은 시간 처리해도 필름의 접촉각이 급격히 감소하였으 며 플라즈마를 처리하지 않은 필름은 약 90°정도의 접 촉각을 나타내었다. LDPE 필름에 플라즈마를 0.8초 처 리하면 70°로, 1초 처리하면 60°로 접촉각이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 플라즈마를 5초 처리하면 50°, 10초 처리하면 40°, 20초 처리하면 30°로 접촉각이 감소함 을 확인할 수 있는데 이는 플라즈마 처리 시 표면에서 공 기 중에 포함되어 있는 산소의 산화작용에 의하여 산소를 포함한 작용기의 작용 및 식각 반응이 일어나 필름표면 에 요철들이 생성되어 친수성이 증가하게 되는 것이며38 약 20초 이후에는 접촉각이 20~30°정도로 거의 일정 하게 유지되는 것을 볼 수 있는데 이는 표면에 생성될 수 있는 작용기의 농도가 한계에 도달하여 한계의 접촉각 을 가지기 때문에 20초 이상 처리해도 접촉각이 일정하 게 유지되는 것으로 판단된다.
- 암형성 유전자와 암억제 유전자의 발현. RT-PCR 반응을 수행한 후 전기영동을 통해 얻은 젤에서 각 유전자의 상대적인 발현율을 확인하기 위하여 형광을 측정하였다 1 및 2일 배양 결과를 비교해보면 1일 배양시 표면의 접촉각이 70°일 때 c-myc 유전자의 발현이 0.92, c-fbs가 1.08, p53 이 1.07 이고 접촉각이 60°일 때 c-myc 유전자 의 발현이 0.60, c-fbs가 1.55, p53이 0.85로 표면의 접촉각에 따른 유전자의 발현이 어떠한 경향성도 보이지 않았으나 시간이 지나 2일 배양했을 때의 결과를 보면 표면의 접촉각이 70°일 때 c-myc 유전자의 발현이 1.17, c-fbs가 1.47, p53이 1.59이었고 접촉각이 60°일 때는 c- myc 유전자의 발현이 0.95, c-fbs가 1.38, p53 이 1.02로 90, 50, 40 및 30°의 접촉각을 갖는 표면보다 암형성 유전자와 암억제 유전자 발현율이 높음을 볼 수 있었다. 따라서 접촉각이 60-70° 사이인 표면이 다른 적심성을 갖는 표면에 비하여 BMSCs의 유전자가 우월하게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (Figures 5 and 6).
- 02로 90, 50, 40 및 30°의 접촉각을 갖는 표면보다 암형성 유전자와 암억제 유전자 발현율이 높음을 볼 수 있었다. 따라서 접촉각이 60-70° 사이인 표면이 다른 적심성을 갖는 표면에 비하여 BMSCs의 유전자가 우월하게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (Figures 5 and 6).
- 2일 배양한 RT- PCR 결과를 보면 β-actin, c-myc, c-fos 및 p53 유전자는 전 체적으로 모든 표면에서 잘 발현된 것으로 보이며 1일 배양한 것에 비해 전체적으로 띠가 밝고 크게 보였다. 또한 1일 배양에서는 p53 유전자가 접촉각이 90° 및 50°인 표면에서 띠가 매우 희미했던 반면에 2일 배양에서 뚜 렷하게 보이고 있는 것으로 보아 세포성장이 우수하며 세 포의 성장과 관련된 유전자 발현 또한 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 8초 처 리하면 70°로, 1초 처리하면 60°로 접촉각이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 플라즈마를 5초 처리하면 50°, 10초 처리하면 40°, 20초 처리하면 30°로 접촉각이 감소함 을 확인할 수 있는데 이는 플라즈마 처리 시 표면에서 공 기 중에 포함되어 있는 산소의 산화작용에 의하여 산소를 포함한 작용기의 작용 및 식각 반응이 일어나 필름표면 에 요철들이 생성되어 친수성이 증가하게 되는 것이며38 약 20초 이후에는 접촉각이 20~30°정도로 거의 일정 하게 유지되는 것을 볼 수 있는데 이는 표면에 생성될 수 있는 작용기의 농도가 한계에 도달하여 한계의 접촉각 을 가지기 때문에 20초 이상 처리해도 접촉각이 일정하 게 유지되는 것으로 판단된다.이°또한 플라즈마를 처리 한 다음 시간이 경과함에 따라 플라즈마 처리시간이 길 수록 접촉각이 50~60°까지 다시 증가하는 것을 볼 수 있는데 이는 일시적으로 플라즈마를 처리하여 필름표면의 접촉각을 감소시켰을지라도 생성된 작용기의 소멸에 의 히-여 본래의 성질대로 회귀하려 하기 때문에 감소된 접 촉각이 원래의 접촉각으로 회복하려는 현상을 보이는 것 이라 사료된다.
- 본 연구팀에서는 일련의 연구로서 코로나 방전처리를 이용하여 저밀도 폴리에틸렌 (LDPE)에 적심성 구배표면 을 만들고 이들의 표면 성질 변화에 따른 세포접착 및 성장을 측정하여 표면의 접촉각이 55-60° 일 때 세포접착 및 성장이 최적임을 확인하였다.8,11-13,15,18,19,23,26,27 한편 KMTO 등은 여러가지 고분자 표면을 이용하여 생체재료와 세포와의 상호작용을 연구하였는데, 28 접촉각을 다양하게 히기 위하여 세포 배양용 폴리스티렌 플라스크, 고밀도 폴리에틸렌, 나일론 테트라플루오로에틸렌-헥사플루오 로 프로필렌 공중합체 및 에틸렌 비닐 알코올 공중합체 등과 같은 여러가지 지 지 체를 사용하여 표면적 심 성 에 따튼' mRNA 중에 암형성 유전자인 c-myc, c-fos 및 암억제 유전자인 p53을 정량하였다.
- 이를 통해 재료표면이 세포의 부착과 성장에 영향을 준다는 것을 알 수 있었고, c-myc, c-fos 및 p53의 발현이 세포가 생체재료를 어떻게 인식하는지에 대한 중요한 정보라는 것을 즉, 조직공학적 바이오장기의 연구에 있어서 생체재료의 역할이 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 물 접촉각 측정을 통해 플라즈마를 처리함에 따라 필름표면의 접촉각이 점차적으로 감소하였다. 즉, 친수성이 증가함을 확인할 수 있었고 20초 이후에는 접촉각이 일정하게 유지되는 것을 볼 수 있었다 접촉각이 작은 표면에서 초기 세포 부착이 우수한 건 사실이지만 세포 성장률은 특정 접촉각 즉 60~50°의 접촉각을 갖는 표면에서 우수하다는 것을 확인할 수 있었다 또한 60~70°의 접촉각을 갖는 표면에서 일시적인 성장촉진자극의 발현을 유도하는 c-myc과 c-fos 유전자 발현 및 암형성을 억제함으 로써 세포 생존을 조절하는 p53 유전자 발현이 우수함을 볼 수 있었다.
- 세포 수의 관찰. 플라즈마 처리로 표면이 개질된 필름 에 세포를 파종한 후 1일 배양했을 때는 필름표면의 접 촉각이 50, 40 및 30°인 표면에서 세포 수가 초기 1 X 105 으로부터 4.8X105으로증가하여 접촉각이 30~40°일 때 세포 수가 가장 많이 증가했음을 확인할 수 있었다. 2일 배양의 경우는 1일 배양과 달리 필름표면의 접촉각이 50~60°일 때 세포 수가 초기 IX 105으로부터 4×105, 정도로 증가하여 접촉각이 50-60° 사이 일 때 세포 수의 증 가가 돋보였다.
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