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문제 정의
- 본 연구에서는 다중 역전사 중합효소 연쇄 반응을 위한 적절한 프라이머 세트를 구성하고, 이를 통한 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포의 미분화 상태와 그들의 분화 상태의 발현유전자 패턴을 포괄적으로 분석함으로써 줄기세포연구에 있어서 유용한 실험 방법을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- Aggregation된 배상체는 10%(v/v) serum replacement (Invitrogen), 1 mM L-glutamine(Invitrogen), 1% nonessential amino acids(Invitrogen), 1% penicillin streptomy- dn(Invitrogen), 0.1% 0-mercaptoethanol(Invitrogen)로 조성된 배양액으로 옮겨 부유 배양하였으며, 배양액은 이틀에 한 번씩 교체하였고, 6일 동안 유지배양하였다.
- 3). GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였다. 미분화 인간 배아줄기세포는 단일 콜로니를이용하였으며, 육안으로 확인하였을 때 미분화 상태로 동일해 보였으나, 각자가 가지는 미분화 유전자의 발현 정도의 차이가 있었다.
- 배 상체가 형성될 때 서로 다른 모양과 색을 가지는 배상체를 관찰할 수 있었으며, 관찰된 서로 다른 모양의 배상체 하나를 사용하여 cDNA를 얻어냈다. GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였으며, POU5F1 을 통해 미분화 인간 배아줄기세포로부터 만들어진 배상체의 미분화 유전자 발현 정도를 확인하였다. 내배엽 세포의 대표적인 유전자인 AFP와 중배엽세포의 대표적인 유전자인 ACTC1 이 일부 배상체(Fig.
- 용액을 준비한 세포와 15분 동안 반응시킨다. 그 후 dPB$로 서]척을 해준 뒤 위상차 현미경으로 관찰하였다. Alkaline Phosphatase(86R-lkt, SIGMA, USA) 킷을 이용하여 실험에 이용된 세포가 미분화 세포임을 확인하였다.
- 다중 역전사 중합연쇄 반응을 우「해, RNeasy Micro Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 단일 콜로니로부터 RNA 를 추출하였으며, 추출된 RNA는 Accu Power™ Cyde- Script RT PreMix(dT20) (Bioneer, Daejeon South Korea) 와 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 미분화 프라이머 (Table 1)와 미분화 및 삼배엽 프라이머 (Table 2)를 이용하여 35cycle을 증폭시켰으며, 증폭된 산물은 1.
- 대표적인 미분화 마커들(Table 1)로 짜여진 다중 프라이머를 이용하여 미분화상태의 인간 배아줄기세포와 자발적 분화가 진행된 인간 배아줄기세포, 인간 배아줄기세포로부터 형성시킨 배상체, 유도만능 줄기세포의 cDNA 를 다중 역전사 중합연쇄 반응을 통하여 확인하였다(Fig. 3). GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였다.
- 미분화 상태의 인간 배아줄기세포(H9' CHAll-hESC) 와 유도만능 줄기세포(hiPSC, System Bioscience, Mountain View, CA)를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 배양접시 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서, 세포 성장 억제 물질인 mito- mydn C(Sigma, St. Louis, MOZ USA)를 10 pg/ml 농도로 90분 동안 처리하여 준비된 지지서j 포(Mouse embryonic fibroblast: MEF)와 공배양하였다. 이 때' 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포는 DMEM/F12(50:50, Invi- trogen, Carlsbad, CA, USA), 20%(v/v) serum replace- ment(Invitrogen)z 1% nonessential amino acidsQnvitro- gen), 1% penicillin streptomycin(Invitrogen)z 0.
- 2). 미분화 인간 배아줄기세포(H9, CHA11)와 17주 태아의 조직(심장, 간, 피부)들로부터 얻어낸 cDNA를 이용하여 제작된 다중 프라이머를 통해 발현 정도를 확인하였다(Fig. 2).
- 미분화마커 5종(Table 1)과 미분화 및 삼배엽 마커 4종 (Table 2)의 단일 프라이머를 확인하기 위해 다중 역전사 중합 연쇄 반응에 사용된 각 유전자의 크기를 확인하여 유전자들 간의 크기의 중복이 발생하지 않고 작동되는 것을 확인하였다(Fig. 2). 미분화 인간 배아줄기세포(H9, CHA11)와 17주 태아의 조직(심장, 간, 피부)들로부터 얻어낸 cDNA를 이용하여 제작된 다중 프라이머를 통해 발현 정도를 확인하였다(Fig.
- 4). 배 상체가 형성될 때 서로 다른 모양과 색을 가지는 배상체를 관찰할 수 있었으며, 관찰된 서로 다른 모양의 배상체 하나를 사용하여 cDNA를 얻어냈다. GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였으며, POU5F1 을 통해 미분화 인간 배아줄기세포로부터 만들어진 배상체의 미분화 유전자 발현 정도를 확인하였다.
- 1% 0- mercaptoethanol(Invitrogen)z 4ng/ml bFGF (invitrogen) 역분화 줄기세포의 경우 8ng/ml bFGF(invitrogen)로 조성된 배양액을 사용하였다. 배양액은 매일 교체해 주고, 5 일에서 7일 간격으로 새로운 지지세포에 계대 배양하였으며 세포 배양은 37℃, 5% COz, 95% 습도를 유지하면서 진행하였다.
- 분화 유도를 위한 배상체 형성은 인간 배아줄기세포를 dispase(Invitrogen) 효소로 지지세포와 분리시킨 뒤, 새로운 배양접시 (Falcon/BD Biosdences, San Jose, CA) 로옮겨, 1 번 세척을 하고, DMEM/F12(50:50, Invitrogen)에 2%(v/v) serum replacement(Invitrogen) 가 첨가된 배양액에서 45분 동안 부유배양하면서 aggregation을 유도하였다. Aggregation된 배상체는 10%(v/v) serum replacement (Invitrogen), 1 mM L-glutamine(Invitrogen), 1% nonessential amino acids(Invitrogen), 1% penicillin streptomy- dn(Invitrogen), 0.
- 위상차 현미경을 이용하여 인간 배아줄기세포' 유도 만능 줄기세포, 배상체, 일차배양세포 등을 관찰하였으며, EVOS 현미경(AMG, BotheU, WA, USA)을 이용하여 세포를 관찰하고, 사진촬영을 하였다.
- 3B). 유도만능 줄기세포에서의 미분화 마커에 따른 발현양상을 확인하기 위해 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포를 비교하여 미분화 유전자의 발현 정도를 확인하였다(Fig. 3C). 유도 만능 줄기세포에서 특이적으로 ZFP42, POU5F1과 NA- NOG가 높게 발현되고 있었으며, DPPA5와 UTF1의 발현은 확인할 수 없었다.
- 등, 1999)를 수행하였다. 이를 위해 관련된 9가지 유전자의 프라이머 (Brimble 등, 2004; Bhattacharya 등, 2004; Clark 등, 2004; Ginis 등, 2004)를 다중 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 수행할 수 있도록 두 가지 세트 (multiplex set 1: 미분화 마커 5종, multiplex s안 2: 미분화 및 삼배엽 마커 4종)로 구성을 하였다(Table 1~3Z Fig. 2). 또한, 이 프라이머 세트는 그 사용 목적에 따라 구성 프라이머를 다양하게 조합할 수 있다.
- 4A, #4). 인간 배아줄기세포로부터 그리고 배상 체로부터 분화되어 확립된 두 종류의 세포주와 태아의 심장, 간 그리고 피부의 cDNA를 사용하여 삼배엽 마커를 확인하였다(Fig. 4B). 인간 배아줄기세포로부터 분화되어 확립된 세포주(Fig.
- 인간 배아줄기세포로부터 만들어진 배상체를 이용하여 단일 세포로 만든 뒤 세포외기질에 특이적으로 붙는 세포만을 분리하여 분화를 유도하였다(Fig. 4B)(Furue 등, 2008). 17주 태아의 조직으로부터 심장, 간 그리고 피부세포를 얻어내고 일차배양을 통해 유지배양을 하고, 이로부터 cDNA를 얻어 다중 역전사 중합연쇄 반응에 사용하였다.
-
다중 역전사 중합연쇄 반응을 통해 인간배아 줄기세포로부터 분화된 세포로부터 삼배엽 분화 유전자의 발현량 확인
인간 배아줄기세포의 발달이 형성될 때 삼배엽의 대표적인 마커 (AFP, ACTC1 그리고 SOX1)들을 이용하여 미분화상태의 인간 배아줄기세포를 이용하여 형성시킨 배 상체, 배상체로부터 분화되어 확립된 세포주 그蔔고 17주 태아의 조직(심장, 간 그리고 피부)의 cDNA를 다중 역전사 중합연쇄 반응을 통하여 확인하였다(Fig. 4). 배 상체가 형성될 때 서로 다른 모양과 색을 가지는 배상체를 관찰할 수 있었으며, 관찰된 서로 다른 모양의 배상체 하나를 사용하여 cDNA를 얻어냈다.
- 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 미분화 프라이머 (Table 1)와 미분화 및 삼배엽 프라이머 (Table 2)를 이용하여 35cycle을 증폭시켰으며, 증폭된 산물은 1.5% 아가로스겔을 사용하여 전기영동으로 확인하였다.
대상 데이터
- 4B)(Furue 등, 2008). 17주 태아의 조직으로부터 심장, 간 그리고 피부세포를 얻어내고 일차배양을 통해 유지배양을 하고, 이로부터 cDNA를 얻어 다중 역전사 중합연쇄 반응에 사용하였다.
- Louis, MOZ USA)를 10 pg/ml 농도로 90분 동안 처리하여 준비된 지지서j 포(Mouse embryonic fibroblast: MEF)와 공배양하였다. 이 때' 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포는 DMEM/F12(50:50, Invi- trogen, Carlsbad, CA, USA), 20%(v/v) serum replace- ment(Invitrogen)z 1% nonessential amino acidsQnvitro- gen), 1% penicillin streptomycin(Invitrogen)z 0.1% 0- mercaptoethanol(Invitrogen)z 4ng/ml bFGF (invitrogen) 역분화 줄기세포의 경우 8ng/ml bFGF(invitrogen)로 조성된 배양액을 사용하였다. 배양액은 매일 교체해 주고, 5 일에서 7일 간격으로 새로운 지지세포에 계대 배양하였으며 세포 배양은 37℃, 5% COz, 95% 습도를 유지하면서 진행하였다.
이론/모형
- 이를 위한 하나의 해결책으로 본 연구에서는 다양한 줄기세포 관련 미분화 및 분화 마커 유전자간 발현 정도가 비교 가능한 다중 역전사 중합효소 연쇄 반응(semi- quantitative multiplex RT-PCR)(Edwards와 Gibbs, 1994; Tettelin 등, 1999)를 수행하였다. 이를 위해 관련된 9가지 유전자의 프라이머 (Brimble 등, 2004; Bhattacharya 등, 2004; Clark 등, 2004; Ginis 등, 2004)를 다중 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 수행할 수 있도록 두 가지 세트 (multiplex set 1: 미분화 마커 5종, multiplex s안 2: 미분화 및 삼배엽 마커 4종)로 구성을 하였다(Table 1~3Z Fig.
성능/효과
- 그 후 dPB$로 서]척을 해준 뒤 위상차 현미경으로 관찰하였다. Alkaline Phosphatase(86R-lkt, SIGMA, USA) 킷을 이용하여 실험에 이용된 세포가 미분화 세포임을 확인하였다.
- GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였으며, POU5F1 을 통해 미분화 인간 배아줄기세포로부터 만들어진 배상체의 미분화 유전자 발현 정도를 확인하였다. 내배엽 세포의 대표적인 유전자인 AFP와 중배엽세포의 대표적인 유전자인 ACTC1 이 일부 배상체(Fig. 4A, #1, 2)에서 발현되고 있음 을 확인하였으며, 외배엽세포의 대표적인 유전자인 SOX1 도 배상체의 모양에 따라 발현 여부가 달라짐을 알 수 있었다(Fig. 4A, #4). 인간 배아줄기세포로부터 그리고 배상 체로부터 분화되어 확립된 두 종류의 세포주와 태아의 심장, 간 그리고 피부의 cDNA를 사용하여 삼배엽 마커를 확인하였다(Fig.
- 따라서, 본 연구에서 제안한 다중 역전사 중합효소 연쇄 반응을 통한 줄기세포 유전자 발현 패턴에 관한 측정은 저비용, 시간단축, 고효율의 분석 방법이며, 목적에 따라 대상 프라이머 세트를 쉽게 변경할 수 있는 장점을 가지고 있다. 줄기세포 수립에 있어 따르는 시료 채취의 제한성과, 줄기세포 유지 배양 상태의 점검(quality control) 뿐만 아니라 분화 기술 적용에 있어서도 보다 쉽고 간단한 방법으로 사용될 것으로 기대된다.
- 또한, 이 프라이머 세트는 그 사용 목적에 따라 구성 프라이머를 다양하게 조합할 수 있다. 미분화 인간 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포, 자연 분화된 인간 배아줄기세포 및 배상체에 대한 다중 역전사 중합효소 연쇄 반응 수행에 있어 이들 프라이머 세트는 구성 목적에 따라 정확하게 마커들의 발현과 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 3~5). 특히, 주목할 만한 차이는 인간 배아줄기세포에서 모두 발현되던 미분화 마커가 유도만능 줄기세포에서는 바이러스에 의해 도입된 POU5F1, NANOG의 발현이 상대적으로 높게 발현되는 반면, DPPA5 UTF1의 발현은 이뤄지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- GAPDH를 이용하여 전체적인 유전자 발현량을 동일시 하였다. 미분화 인간 배아줄기세포는 단일 콜로니를이용하였으며, 육안으로 확인하였을 때 미분화 상태로 동일해 보였으나, 각자가 가지는 미분화 유전자의 발현 정도의 차이가 있었다. 하지만 전체적으로 모든 미분화 마커가 정상적으로 발현을 하고 있는 것을 확인하였다(Fig.
- 3C). 유도 만능 줄기세포에서 특이적으로 ZFP42, POU5F1과 NA- NOG가 높게 발현되고 있었으며, DPPA5와 UTF1의 발현은 확인할 수 없었다. 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포를 통해 미분화 마커들로 짜여진 다중 역전사 중합 연쇄 반응 프라이머 세트가 정상적으로 작동하는 것을 보여줄 수 있으며, 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포의 단일 콜로니로부터 미분화 유전자의 발현 정도와 발현 여부를 확인할 수 있었다.
- . 인간 배아줄기세포로부터 배상체가 정상적으로 형성됨을 확인하였다(Fig. 1).
- 4B). 인간 배아줄기세포로부터 분화되어 확립된 세포주(Fig. 4B, #1, 2)에서는 미분화 마커가 발현되지 않고, 중배엽 마커가 약하게 발현하고 있음을 확인할 수 있었으며, 17주 태아의 심장에서는 미분화 마커는 전혀 발현되지 않으며, 내배엽과 중배엽 마커가 강하게 발현하고 있음을 확인할 수 있었으며' 간에서도 미분화 마커의 발현을 확인할 수 없었으며, 내배엽 마커만이 강하게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 피부에서는 외배엽 마커만이 발현되고 있음을 확인할 수 있었디' 다중 역전사 중합연쇄 반응을 통해 적은 양의 세포를 사용하여 짧은 시간 안에 여러 종류의 유전자를 확인할 수 있음을 보여준다.
-
실험에 시용된 세포들의 특성 확인
인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포가 미분화 세포임을 확인하기 위하여 알칼라인 포스파테이즈 염색을 시행하여 미분화상태를 정상적으로 유지하고 있음을 확인하였다 . 인간 배아줄기세포로부터 배상체가 정상적으로 형성됨을 확인하였다(Fig.
- 유도 만능 줄기세포에서 특이적으로 ZFP42, POU5F1과 NA- NOG가 높게 발현되고 있었으며, DPPA5와 UTF1의 발현은 확인할 수 없었다. 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포를 통해 미분화 마커들로 짜여진 다중 역전사 중합 연쇄 반응 프라이머 세트가 정상적으로 작동하는 것을 보여줄 수 있으며, 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포의 단일 콜로니로부터 미분화 유전자의 발현 정도와 발현 여부를 확인할 수 있었다.
- 3A). 자발적 분화가 진행된 인간 배아줄기세포는 육안으로 관찰하였을 때 다른 양상으로 분화가 진행된 콜로니를 선별하여 샘플링을 시행하였으며, 부착부위의 바깥쪽 부분에 분화경향이 보이는 콜로니에서는 POU5F1의 발현이 유지하고 있음을 확인하였고, 자발적으로 분화가 진행된 인간 배아줄기세포에서 전체적으로 미분화 마커가 눈에 띄게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 유도만능 줄기세포에서의 미분화 마커에 따른 발현양상을 확인하기 위해 인간 배아줄기세포와 유도만능 줄기세포를 비교하여 미분화 유전자의 발현 정도를 확인하였다(Fig.
- 3~5). 특히, 주목할 만한 차이는 인간 배아줄기세포에서 모두 발현되던 미분화 마커가 유도만능 줄기세포에서는 바이러스에 의해 도입된 POU5F1, NANOG의 발현이 상대적으로 높게 발현되는 반면, DPPA5 UTF1의 발현은 이뤄지지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이는 각 줄기세포의 미분화 상태뿐만 아니라 줄기세포간의 미분화 마커의 발현 차이도 간접적으로 확인할 수 있다는 점에서 의의가 있다고 할 수 있다.
- 미분화 인간 배아줄기세포는 단일 콜로니를이용하였으며, 육안으로 확인하였을 때 미분화 상태로 동일해 보였으나, 각자가 가지는 미분화 유전자의 발현 정도의 차이가 있었다. 하지만 전체적으로 모든 미분화 마커가 정상적으로 발현을 하고 있는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 자발적 분화가 진행된 인간 배아줄기세포는 육안으로 관찰하였을 때 다른 양상으로 분화가 진행된 콜로니를 선별하여 샘플링을 시행하였으며, 부착부위의 바깥쪽 부분에 분화경향이 보이는 콜로니에서는 POU5F1의 발현이 유지하고 있음을 확인하였고, 자발적으로 분화가 진행된 인간 배아줄기세포에서 전체적으로 미분화 마커가 눈에 띄게 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 있다. 줄기세포 수립에 있어 따르는 시료 채취의 제한성과, 줄기세포 유지 배양 상태의 점검(quality control) 뿐만 아니라 분화 기술 적용에 있어서도 보다 쉽고 간단한 방법으로 사용될 것으로 기대된다.
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