선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 특히 ALA의 전구체로 사용되는 글리신과 숙신산 그리고 ALAD의 저해제로 사용되는 LA (levulinic acid)의 첨가에 따른 균체 성장과 ALA 생산 특성을 살펴보고자 한다. 그리고 배양액의 온도, pH 및 재조합 유전자의 유도 발현에 따른 ALA 생산 특성을 연구하여 ALA의 최적 생산 조건을 조사하고자 한다.
- 그러나 과량의 LA 첨가는 세포 성장에 영향을 주며 heme의 생합성을 완전히 중단시킬 수도 있으므로 적절한 시간에 적정량을 첨가할 필요가 있다(1, 2, 6, 9). 따라서 본 실험에서는 LA의 첨가 시간과 첨가량을 다르게 하여 균체 성장 및 ALA 생산성을 조사하였다. 먼저 LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산 특성을 조사하기 위해 15 mM 숙신산과 30 mM 글리신이 첨가된 MS 8 배지에 접종 후 0시간, 14시간, 16시간, 18시간 및 20시간에 각각 30 mM LA를 첨가하여 실험하였으며 LA를 첨가하지 않은 경우와 비교, 고찰하였다.
- 본 연구에서는 ALA의 생산 공정을 개발하기 위해 재조합 플라스미드, pFLS45를 도입한 재조합 대장균의 성장과 ALA 생산 특성을 조사하였다. 30 mM 숙신산과 15 mM 글리 신이 첨가된 배양액에서 균체 성장이 원활하고 높은 ALA 생산성을 보였다.
- 본 연구에서는 ALA의 생산에 관여하는 Bradyrhizobium japonicum 균주에서 분리한 hemA 유전자를 egfp (enhanced green fluorescent protein) 유전자와 융합한 플라스미드 (pFLS45)를 제조한 후 대장균에 도입한 재조합 대장균에 의한 ALA의 생산 특성을 연구하고자 한다. 특히 ALA의 전구체로 사용되는 글리신과 숙신산 그리고 ALAD의 저해제로 사용되는 LA (levulinic acid)의 첨가에 따른 균체 성장과 ALA 생산 특성을 살펴보고자 한다.
- ALA의 생산 특성을 연구하고자 한다. 특히 ALA의 전구체로 사용되는 글리신과 숙신산 그리고 ALAD의 저해제로 사용되는 LA (levulinic acid)의 첨가에 따른 균체 성장과 ALA 생산 특성을 살펴보고자 한다. 그리고 배양액의 온도, pH 및 재조합 유전자의 유도 발현에 따른 ALA 생산 특성을 연구하여 ALA의 최적 생산 조건을 조사하고자 한다.
제안 방법
- 그리고 일반적인 pET 계열의 재조합 대장균의 발현 양상과 달리 유도 발현하지 않고 LA만을 때첨가했을 때 ALA 생산 농도는 800 mg/L 이상으로 매우 높았다. 7 L급 생물반응기를 이용하여 MS8 배지에 기질 (포도당, 숙신산, 글리신) 및 LA를 간헐적으로 첨가하여 균체 성장 및 ALA 생산 특성을 살펴보았다. 균체량은 높지 않았지만 기질첨가 이후 ALA 생산량은 꾸준히 증가하여 기존의 ALA 생산량보다 두 배 이상 증가한 1300 mg/L 정도 생산되었으며 ALAD의 활성은 다른 실험 결과와 비교할 때 30% 정도 낮았다.
- ALA 생산 전구체인 글리신과 숙신산의 농도, LA (levulinic acid)의 최적 주입농도 및 첨가 시간에 따른 균체 의성장 및 ALA의 생산성을 조사하였다. 생물반응기 실험을 위해 2.
- ALA의 생산 전구체인 숙신산과 글리신, 탄소 원으로 사용되는 포도당 및 ALAD의 활성을 저해하기 위한 LA을 지수성장기에 간헐적으로 첨가하면서 균체 성장 및 ALA 생산 특성을 살펴보았다(Fig. 7).
- , USA, Ka/)에 삽입하여 재조합플라스미드, pET-28b/ALAS를 제조하였다. ALA의 생합성 특성을 2차원 형광 센서로 모니터링하기 위해 pEGFP (Clontech Co., USA, AmpR) 벡터에 존재하는 egfp (from Aequorea victoria) 유전자를 pET-28b/ALAS에서의 hemA 유전자와 융합하여 재조합 플라스미드 pFLS45를 제조하였다(Fig. 2).
- 4 mM)와 ALAD 저해제인 LA (30 mM)를 첨가하여 ALA 생산 특성을 비교하였다. IPTG는 균체가 OD6oo 5-6.5 정도로 성장했을 때 그리고 LA는 균체가 OD«» 7-8 정도로 성장하여 휴지기에 도달하였을 때 일회용 주사기를 이용하여 각각 첨가하였다. LA 첨가 이후에는 pH를 6.
- 균체의 성장이 거의 끝날 무렵에 LA를 첨가하므로 균체 성장 속도는 LA 농도에 따라 큰 차이가 없었으며 최종 pH 값도 큰 차이를 보이지 않았다. LA 농도에 따른 ALA 생산농도는 30 mM LA가 첨가 되었을 때 670 mg/L 정도 생산되었으므로 향후 배양실험에서는 30 mM LA를 배양액에 첨가하였다.
- 및 ALA 생산성을 조사하였다. 그리고 ALAD의 저해제인 LA의 첨가 농도 및 시간을 다르게 하여 균체 성장과 ALA 생산 특성을 조사하였다.
- 4 mM의 isopropyl-0-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 첨가하였다. 또한, 배양 온도에 따른 hemA 유전자의 발현 정도를 조사하기 위해 재조합 균주를 30°C2} 37°C에서 배양한 후 IPTG를 첨가하였다. 생물반응기 내의 각종 공정변수들 즉 pH, 용존산소 농도, 배 가스 등을 모니터링하기 위해 pH 전극 (pH electrode, Mettler Co.
- 따라서 본 실험에서는 LA의 첨가 시간과 첨가량을 다르게 하여 균체 성장 및 ALA 생산성을 조사하였다. 먼저 LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산 특성을 조사하기 위해 15 mM 숙신산과 30 mM 글리신이 첨가된 MS 8 배지에 접종 후 0시간, 14시간, 16시간, 18시간 및 20시간에 각각 30 mM LA를 첨가하여 실험하였으며 LA를 첨가하지 않은 경우와 비교, 고찰하였다.
- 4b). 배양 조건은 LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산량을 비교한 실험과 같게 하였으며 LA의 첨가 농도는 0에서 60 mM까지 10 mM 간격으로 하고 균체 성장이 정지되기 시작하는 시간인 접종 후 20시간에 첨가하였다. 균체의 성장이 거의 끝날 무렵에 LA를 첨가하므로 균체 성장 속도는 LA 농도에 따라 큰 차이가 없었으며 최종 pH 값도 큰 차이를 보이지 않았다.
- 2)를 사용하였다. 본 배양에는 복합배지인 LB 배지나 최소 배지인 MS8 배지 (29, Glucose; 6 g/L, MgSOJ/HQ: 1 g/L, NH4CI: 0.2 g/L, KH2PO4: 13 g/L, K2HPO4: 10 g/L, NaH2PO4: 6 g/L, Trace elements stock solution: 0.4 mL/mL, Vitamin stock solution: 0.4 mL/mL)에 ALA의 전구체로 사용되는 글리신과 숙신산을첨가하였다. 배양액 및 반응기는 121 °C, 14 ps에서 최소 20 분 이상 멸균하였으며, 최소 배지의 탄소 원과 가용성 염은분리하여 멸균한 후 혼합하였다.
- 시킬 수 있다(35). 본 실험에서 배양온도를 30°C와 37°C 로 변화시키고 발효 공정 중에 유도발현 물질인 IPTG (0.4 mM)와 ALAD 저해제인 LA (30 mM)를 첨가하여 ALA 생산 특성을 비교하였다. IPTG는 균체가 OD6oo 5-6.
- 본 연구에서 재조합한 플라스미드 pFLS45는 glycine과 succinyl-CoA를 기질로 사용하여 C-4 경로를 통해 ALA를 생합성 하므로 전구물질인 글리신과 숙신산의 농도에 따른 균체 성장 및 ALA 생산성을 조사하였다. 그리고 ALAD의 저해제인 LA의 첨가 농도 및 시간을 다르게 하여 균체 성장과 ALA 생산 특성을 조사하였다.
- 또한, 배양 온도에 따른 hemA 유전자의 발현 정도를 조사하기 위해 재조합 균주를 30°C2} 37°C에서 배양한 후 IPTG를 첨가하였다. 생물반응기 내의 각종 공정변수들 즉 pH, 용존산소 농도, 배 가스 등을 모니터링하기 위해 pH 전극 (pH electrode, Mettler Co., Germany), 용존산소센서 (6 sensor, Mettler Co., Germany), O2/CO2 7'-스 분석기 (LOKAS Co., Korea) 등을 사용하였다. 실시간 모니터링된 자료를 수집하기 위해 데이터 수집 보드 (PCI 6024E DAQ board, National Instrument Co.
- ALA 생산 전구체인 글리신과 숙신산의 농도, LA (levulinic acid)의 최적 주입농도 및 첨가 시간에 따른 균체 의성장 및 ALA의 생산성을 조사하였다. 생물반응기 실험을 위해 2.5 L 또는 7 L 생물반응기 (KoBiotech Co. Korea)를 사용하였는데 반응기 내의 본 배양 배지 (working vol.; 1 L or 5.5 L)에 전 배양액의 1%를 접종하였다. 반응기의 운전 조건은 37°C, 400 rpm (or 370 rpm), 통 기량 1 vvm으로 하였으며, 발효액의 pH 조절에는 3 N NaOH와 3 N HC1 을 사용하였다.
- 생물반응기를 이용한 배양실험에서 배양액의 pH를 5.0, 6.0, 7.0로 조절한 경우와 pH를 조절하지 않는 경우의 균체성장 및 ALA 생산 특성을 조사하였다. Fig.
- 숙신산 농도에 따른 ALA 생산 특성을 조사하기 위해 15 mM의 글리신을 포함한 MS8 배지를 사용하였으며 숙신산의농도를 0에서 90 mM까지 15 mM 간격으로 다르게 첨가한후 배양액의 초기 pH 값은 6.8로 조절하여 진탕배양 실험을수행하였다. Fig.
- 우선, 글리신 농도에 따른 ALA 생산 특성을 조사하기 위해숙신산 (30 mM)이 첨가된 MS8 배지를 사용하였고 글리신의농도를 0에서 30 mM까지 5 mM 간격으로 각각 다르게 하고배양액의 초기 pH를 6.8로 조절하여 진탕배양 실험을 하였다. Fig.
- 글리신, 숙신산 및 LA 농도와 첨가 시간 등은 진탕 배양의 실험 결과를 이용하였다. 재조합 hemA 유전자의 유도발현 정도를 연구하기 위해 미생물의 지수 성장기 후반에 0.4 mM의 isopropyl-0-D-thio-galactopyranoside (IPTG)를 첨가하였다. 또한, 배양 온도에 따른 hemA 유전자의 발현 정도를 조사하기 위해 재조합 균주를 30°C2} 37°C에서 배양한 후 IPTG를 첨가하였다.
- 3a에 글리신 농도에 따른 균체 성장과 ALA의 생산량을 나타내었다. 최종 균체량은 모든 실험에서 유사하므로 균체 성장을 비교하기 위해 접종 후 12시간일 때 비성장 속도 U (specific cell growth rate, “ = -Tn(Wj)를 계산하였다. 균체의 성장은 글리신이 첨가된 배지에서 빨랐으며, 낮은 글리신 농도에서 성장이 촉진되는 것을 볼 수 있었다.
- 단, 교반속도는 반응기의 직경대비 동력비를 고려하여 370 rpm으로 하였다. 포도당 (30 tnM)과 숙신산 (30 mM), 글리신 (15 mM)은 분리, 멸균한 후 혼합하여 기질로써 반응기에첨가하였으며 첨가 시간 (20, 23시간)은 지수성장기에서 포도당의 소비속도 (최대 2.5 g^/hr)를 고려하여 결정하였다. 한편, LA (30 mM)는 포도당 첨가 후 1.
- LA는 기질이 모두 소모되고 성장이 끝나는 시간에 첨가되어 균체량에는 크게 영향을 미치지 않았다. 한편, 37 °C 에서 배양할 때 IPTG 첨가에 의한 유도발현을수행하지 않고 접종 후 16시간에 LA만을 첨가하여 유도발현실험결과와 균체성장 및 ALA 생산성을 비교하였다. 접종 후 16시간까지 균체는 정상적인 성장을 하였으며 LA의 첨가 이후 균체량은 감소하지 않았다.
- 5 g^/hr)를 고려하여 결정하였다. 한편, LA (30 mM)는 포도당 첨가 후 1.5시간 정도 (21.5, 25시간)에 첨가하였으며 첨가 이후 배양액의 pH는 첨가 이전의 pH와 동일하도록 조절하였다. 발효 초기에 균체 성장이 원활하지 못하여 성장 시간이 2.
- 한편, LA 첨가 농도에 따른 ALA 생산특성을 조사하였다 (Fig. 4b). 배양 조건은 LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산량을 비교한 실험과 같게 하였으며 LA의 첨가 농도는 0에서 60 mM까지 10 mM 간격으로 하고 균체 성장이 정지되기 시작하는 시간인 접종 후 20시간에 첨가하였다.
대상 데이터
- 재조합 플라스미드 pFLS45의 안정성을 유지하기 위해 고체및 액체배지에는 ampicillin 용액 (75 jig/mL)을 첨가하였다. 균주의 활성화를 위해 LB agar 배지 (Yeast extract: 5 g/L, Tryptone: 10 g/L, NaCl: 10 g/L)를 사용하였으며 종균배양및 전 배양에는 LB 배지 (pH 7.2)를 사용하였다. 본 배양에는 복합배지인 LB 배지나 최소 배지인 MS8 배지 (29, Glucose; 6 g/L, MgSOJ/HQ: 1 g/L, NH4CI: 0.
- 단백질의 정량은 ALAD와 ALAS의 효소 활성측정을위해 얻은 효소 상등액을 Bradford 법(32)에 의해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 정량을 위한 표준물질로 BSA (bovine serum albumin, Sigma Co., USA)를 사용하였다.
- 배양 배지로는 MS8 배지를 사용하였으며 발효기로는 7 L 급 스테인리스 반응기를 이용하였으며 배양 부피는 5.5 L로하였고 회분배양 조건은 2.5 L 생물반응기와 같게 하였다. 단, 교반속도는 반응기의 직경대비 동력비를 고려하여 370 rpm으로 하였다.
- 본 연구에서 ALA의 생산을 위해 사용한 유전자는 Bradyrhizobium japonicum 균주에서 분리한 hemA 유전자로써 pET-28b(+) (Novagen Co., USA, Ka/)에 삽입하여 재조합플라스미드, pET-28b/ALAS를 제조하였다. ALA의 생합성 특성을 2차원 형광 센서로 모니터링하기 위해 pEGFP (Clontech Co.
데이터처리
- , Korea) 등을 사용하였다. 실시간 모니터링된 자료를 수집하기 위해 데이터 수집 보드 (PCI 6024E DAQ board, National Instrument Co., USA)를 사용하였으며 LabVIEW ver. 6.1 (National Instrument Co., USA)를 이용하여 프로그래밍하였다.
이론/모형
- 발효액 중 세포 외 ALA 농도와 세포내 효소, ALAS (ALA synthetase)의 활성측정은 Mauzerall와 Granick의 방법(30)을 사용하였으며 ALAD (ALA dehydratase)의 활성은 Sato의 방법(31)으로 측정하여 수행하였다. 단백질의 정량은 ALAD와 ALAS의 효소 활성측정을위해 얻은 효소 상등액을 Bradford 법(32)에 의해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 정량을 위한 표준물질로 BSA (bovine serum albumin, Sigma Co.
- 한편, 균체 중 colony를 형성할수 있는 세포 수 (CFU, colony forming unit)를 측정하기 위해배양 중 채취한 시료를 고체 LB 배지에 50~100개 정도의 colony가 형성되도록 멸균수로 적절히 희석하여 도말한 후 37°C에서 하루동안 배양하였다. 발효액 중 세포 외 ALA 농도와 세포내 효소, ALAS (ALA synthetase)의 활성측정은 Mauzerall와 Granick의 방법(30)을 사용하였으며 ALAD (ALA dehydratase)의 활성은 Sato의 방법(31)으로 측정하여 수행하였다. 단백질의 정량은 ALAD와 ALAS의 효소 활성측정을위해 얻은 효소 상등액을 Bradford 법(32)에 의해 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 발효액의 상등액 내 포도당 농도는 GOD-POD (glucose oxidase-peroxidase)와 ABTS (2, 2 -azino-bis (3-ethylbenz- thiazoline-6-sulfonic acid))를 이용한 비색법으로 측정하였다 (37). 건조 균체량의 측정은 1.
- 이와 같이 제조된 재조합 플라스미드 pFLS45를 CaCl2 방법을 이용하여 E. coll BL21 (DE3) pLysS에 십■입하였다(28). 재조합 플라스미드 pFLS45의 안정성을 유지하기 위해 고체및 액체배지에는 ampicillin 용액 (75 jig/mL)을 첨가하였다.
성능/효과
- 6c에는 배양온도와 유도 발현이 ALA 생산에 미치는 영향을 나타내었다. 3(rc에서 배양할 경우 균체 성장이 다른 발효 실험에서 보다 빠르게 되었으나 높은 균체량과 원활한 대사와는 무관하게 ALA의 생산량은 200 mg/L 정도밖에 되지 않았다. 배양온도를 37 °C로 하여 IPTG를 첨가하였을 때 포도당 소비 속도가 감소하여 발효액 중 포도당은 18시간 전후까지 존재하였으나 ALA는 650 mg/L 정도 생산되었다.
- 특성을 조사하였다. 30 mM 숙신산과 15 mM 글리 신이 첨가된 배양액에서 균체 성장이 원활하고 높은 ALA 생산성을 보였다. 그리고 LA는 균체 성장이 거의 다 이루어진 정지기에 첨가될 때 균체 성장에 저해를 일으키지 않으면서 ALA 생산성을 높일 수 있었다.
- 배양액의 온도가 37°C인 경우 IPTG와 LA는 접종 후 15시간과 18시간에각각 첨가되었다. 30°C 배양에서와는 달리 유도발현 이후 균체량은 증가폭이 감소하였으며 CFU는 거의 증가하지 않고일정하게 유지되었으므로 IPTG가 균체 성장에 유해하게 작용함을 알 수 있다. LA는 기질이 모두 소모되고 성장이 끝나는 시간에 첨가되어 균체량에는 크게 영향을 미치지 않았다.
- 포도당도 많이 소모되지 않아 배양액 중의 포도당 농도는 11 g/L 이상이었으나 배양 종결 시에는 8 g/L 정도의 포도당이 발효액 중에 존재하였다. ALA의 생산량은 기질 첨가 이후 1000 mg/L 이상 생산되었으며, 세포 성장이 원활하지 못한 23.5시간 이후에도 ALA 생산량은 증가하였으며 ALA의 최종 농도는 1300 mg/L 정도이었다. 세포내 효소, ALAS와 ALAD 활성은 세포성장과함께 증가하였지만 LA와 포도당 첨가에 따라 ALAD의 활성은 감소하였는데 전반적으로 다른 실험과 비교할 때 30% 정도 낮은 ALAD 활성을 보였다.
- 배양액의 온도를 30°C로 하였을 경우 37 °C 에서 배양할 때보다 균체 성장이 빨랐다. IPTG와 LA 는 접종 후 11시간과 13시간에 각각 첨가되었으며 유도발현이후 균체량의 증가 폭이 줄 거나 CFU 값이 감소하지 않았다 (37). 또한 LA 첨가에 따라 CFU의 최고값은 pH를 조절하지않았던 실험보다 다소 감소하였는데 이는 LA 첨가로 인한순간적인 pH 변화에 따른 영향으로 생각된다.
- 또한 지수성장기에 LA를 첨가했을 때 LA가 최종 균체량에 크게 영향을 미치는 것을 볼 수 있다. LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산은 균체량의 변화와 거의 유사하게 나타났으며, 접종 후 20시간 이전에 LA를 첨가한 경우 균체의 성장 지연으로 LA를 첨가하지 않았을 때보다 ALA 생산량이 감소하였다. 한편, 접종 후 20시간에 LA를 30 mM 첨가했을 때 균체 성장에는 큰 영향이 없었으며 ALA 생산성은 LA를 첨가하지 않았을 때보다 30% 가량 증가하였다.
- 6b에는 배양 온도와 IPTG 및 LA 첨가에 따른 이산화탄소 생성속도 (CPR) 과 산소 소비속도 (OUR) 그리고 생물반응기내 용존 산소 농도를 모니터링하였다. 각 발효 실험에서 LA 첨가 시 pH 값이 낮아져 CPR 및 OUR이 감소하고 용존 산소농도는 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 IPTG의 첨가로 성장이 지연되고 대사과정도 원활하지 못하였음을 알수 있었다.
- 7 L급 생물반응기를 이용하여 MS8 배지에 기질 (포도당, 숙신산, 글리신) 및 LA를 간헐적으로 첨가하여 균체 성장 및 ALA 생산 특성을 살펴보았다. 균체량은 높지 않았지만 기질첨가 이후 ALA 생산량은 꾸준히 증가하여 기존의 ALA 생산량보다 두 배 이상 증가한 1300 mg/L 정도 생산되었으며 ALAD의 활성은 다른 실험 결과와 비교할 때 30% 정도 낮았다. 한편, LA 및 숙신산의 첨가 이후 낮아진 배양액의 pH는 균체 성장을 저해하였는데 발효 중 기질을 첨가한 후 pH를 잘 제어하면서 유가식 또는 연속식 발효를 수행하면 ALA 생산성을 증대시킬 수 있을 것으로 생각된다.
- 최종 균체량은 모든 실험에서 유사하므로 균체 성장을 비교하기 위해 접종 후 12시간일 때 비성장 속도 U (specific cell growth rate, “ = -Tn(Wj)를 계산하였다. 균체의 성장은 글리신이 첨가된 배지에서 빨랐으며, 낮은 글리신 농도에서 성장이 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 이는 일정한 농도 (6-12 mM)의 글리신이 대장균의 초기 및 지수성장에서 세포성장 촉진 효과가 있다고 보고한 Han 등의 연구와일치한다(33).
- 배양 조건은 LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산량을 비교한 실험과 같게 하였으며 LA의 첨가 농도는 0에서 60 mM까지 10 mM 간격으로 하고 균체 성장이 정지되기 시작하는 시간인 접종 후 20시간에 첨가하였다. 균체의 성장이 거의 끝날 무렵에 LA를 첨가하므로 균체 성장 속도는 LA 농도에 따라 큰 차이가 없었으며 최종 pH 값도 큰 차이를 보이지 않았다. LA 농도에 따른 ALA 생산농도는 30 mM LA가 첨가 되었을 때 670 mg/L 정도 생산되었으므로 향후 배양실험에서는 30 mM LA를 배양액에 첨가하였다.
- 따라서 pH 조절을 하지 않은발효실험에서 균체 성장 및 호흡이 원활하게 이루어지는 것을 알 수 있다. 그러나 pH를 5.0 또는 6.0으로 조절하기 위해 중화제 (3 N HC1/3 N NaOH)를 첨가한 경우 중화제가 첨가되지 않은 경우와 비교할 때 용존 산소 농도가 높았으며 CPR과 OUR은 낮아지는 경향을 보였다. 또한 지수성장기에 3 N NaOH가 첨가된 경우 균체의 성장과 대사가 지연되었으며 (pH 5.
- 30 mM 숙신산과 15 mM 글리 신이 첨가된 배양액에서 균체 성장이 원활하고 높은 ALA 생산성을 보였다. 그리고 LA는 균체 성장이 거의 다 이루어진 정지기에 첨가될 때 균체 성장에 저해를 일으키지 않으면서 ALA 생산성을 높일 수 있었다. 또한 세포내효소 ALAD의 활성은 30 mM LA가 첨가되었을 때 가장 효과적으로 저해되었다.
- 30°C 에서 배양한 경우 균체의 성장은 원활하였지만 ALA의 생산성이 매우 낮았다. 그리고 일반적인 pET 계열의 재조합 대장균의 발현 양상과 달리 유도 발현하지 않고 LA만을 때첨가했을 때 ALA 생산 농도는 800 mg/L 이상으로 매우 높았다. 7 L급 생물반응기를 이용하여 MS8 배지에 기질 (포도당, 숙신산, 글리신) 및 LA를 간헐적으로 첨가하여 균체 성장 및 ALA 생산 특성을 살펴보았다.
- ALA의 생산 농도는 보통 균체량이 최고점에이르는 시간 즉, 18-22시간 사이에서 최대 농도를 보였으며최대 생산 시간이 지나면 ALAD에 의해 빠르게 분해되었다. 글리신 농도에 따른 ALA 생산성은 글리신 농도가 15 mM일때 최대 600 mg/L까지 증가하였으며, 15 mM보다 높은 농도에서 ALA 생산성은 다시 감소하는 경향을 보였다. 이는 균체량이 많을수록 발현된 ALAS 활성이 높아져 많은 ALA가생산되지만 글리신 농도가 너무 높을 경우 오히려 균체에 독성 작용을 일으켜 ALA 생산이 중지되었다.
- 숙신산이 30 mM 첨가된 실험에서 ALA가 최대 600 mg/L까지 생산되었지만 45 mM 이상 첨가될 경우 균체 성장이 지연되어 ALA 생산에는 효율적이지 못하였다. 따라서 회분배양에서 최적 숙신산의 농도는 균체의 성장을 촉진시키면서 ALA 생산량이 가장 높은 30 mM로 하였다.
- 그리고 LA는 균체 성장이 거의 다 이루어진 정지기에 첨가될 때 균체 성장에 저해를 일으키지 않으면서 ALA 생산성을 높일 수 있었다. 또한 세포내효소 ALAD의 활성은 30 mM LA가 첨가되었을 때 가장 효과적으로 저해되었다. 본 연구에서 사용한 재조합 대장균은 pH 조절을 위한 산이나 알칼리 첨가에 민감하여 pH를 조절하지 않은 경우에 균체의 성장이 가장 원활하였고 ALA 생산성도 높았다.
- 0으로 조절하기 위해 중화제 (3 N HC1/3 N NaOH)를 첨가한 경우 중화제가 첨가되지 않은 경우와 비교할 때 용존 산소 농도가 높았으며 CPR과 OUR은 낮아지는 경향을 보였다. 또한 지수성장기에 3 N NaOH가 첨가된 경우 균체의 성장과 대사가 지연되었으며 (pH 5.0), pH 7.0으로 배양한 경우에는 pH 값이 균체성장에 적절하지 않아 미생물의 성장 및 호흡이 거의 이루어지지않았다. 이 결과로 미루어볼 때 배양액의 pH를 조절한 경우가 배양액의 pH를 조절하지 않은 경우보다 세포 성장 및 호흡 등의 대사과정이 원활하지 못하였음을 알 수 있다.
- 5b에는 배양액의 pH에 따른발효공정에서 생산된 이산화탄소 생성 속도 (carbon dioxide production rate, CPR) 및 산소 소비속도 (oxygen uptake rate, OUR) 그리고 생물반응기 내의 용존 산소농도 변화를 나타내었다. 발효공정에서 pH를 조절하지 않았을 경우 지수성장기중반 (접종 후 11-13시간)에 용존산소 농도는 최저 55%까지감소하며, CPR과 OUR도 같은 시간대에서 각각 0.5와 0.6 mmol/L/min까지 증가하였다. 따라서 pH 조절을 하지 않은발효실험에서 균체 성장 및 호흡이 원활하게 이루어지는 것을 알 수 있다.
- 5 mL의 시료를 원심 분리 (13000 rpm, 5 min) 한 후 수집된 균체를 멸균수 세척과 원심분리 과정을 세 번 반복한 후 80°C에서 하루 동안 건조하여 무게를 측정하였다. 배양 중 세포 농도는 600 nm 파장에서 흡광도 (ODax))를 측정하였는데 건조균체량과 좋은 선형관계를 보였다(37, DCW = 0.3457 * ODsoo + 0.1757, R2 = 0.9983, 0.0 < ODsoo < 5.0). 한편, 균체 중 colony를 형성할수 있는 세포 수 (CFU, colony forming unit)를 측정하기 위해배양 중 채취한 시료를 고체 LB 배지에 50~100개 정도의 colony가 형성되도록 멸균수로 적절히 희석하여 도말한 후 37°C에서 하루동안 배양하였다.
- 높았다. 배양액의 pH를 5.0으로 조절한 경우에는 17시간까지 포도당이 완전히 소비되지 않았으며 ALA 생산량도미미한 수준이었다. 그리고 포도당이 완전히 소모되고 균체량이 일정해지는 시간 즉, 접종 후 17시간 이후부터 일정양의 ALA (100 mg/L)가 생산되는 것을 볼 수 있다.
- 그리고 포도당이 완전히 소모되고 균체량이 일정해지는 시간 즉, 접종 후 17시간 이후부터 일정양의 ALA (100 mg/L)가 생산되는 것을 볼 수 있다. 배양액의 pH를 6.0으로 조절한 경우에는 pH 조절이 거의 이루어지지않았던 접종 후 14시간 이전에는 pH를 조절하지 않은 실험과 비슷하게 포도당이 소모되었으며 ALA 생산량도 476 mg/L까지 생산되었으나 14시간 이후부터 첨가된 HC1 의 영향으로 ALA 생산량이 다소 감소하였다. 한편, 배양액의 pH를 7.
- 배양액의 pH를 조절하지 않은 경우 세포성장이 원활하여기질 소모 속도가 가장 빨랐는데 ALA 생산량도 503 mg/L로가장 높았다. 배양액의 pH를 5.
- 0으로 조절한 경우 균체가 성장하지 않으므로 ALA 생산이거의 이루어지지 않았다. 본 실험에 사용된 재조합 대장균은회분배양에서 지수적으로 성장하는 단계에 배양액의 pH를임으로 5.0 또는 6.0으로 조절하면 균체 성장 및 대사가 저해되므로 배양액의 pH를 조절하지 않는 것이 세포성장 및 ALA의 생산을 증대시키는데 유리할 것으로 생각된다.
- 본 실험에서 균체 성장, ALA 생산 특성 그리고 세포내 효소 활성변화로 미루어 볼 때 배양액의 pH를 6.0 정도로 조절하고 기질, 즉 포도당 및 ALA 생산 전구체 (글리신, 숙신산) 을 간헐적으로 첨가하면 ALA의 대량 생산이 가능할 것으로생각되며 LA는 ALA가 PBG로 전환되는 것을 저해하기 위해포도당이 완전히 소모되기 직전에 첨가하는 것이 가장 효과적일 것으로 생각된다.
- 또한 세포내효소 ALAD의 활성은 30 mM LA가 첨가되었을 때 가장 효과적으로 저해되었다. 본 연구에서 사용한 재조합 대장균은 pH 조절을 위한 산이나 알칼리 첨가에 민감하여 pH를 조절하지 않은 경우에 균체의 성장이 가장 원활하였고 ALA 생산성도 높았다. 30°C 에서 배양한 경우 균체의 성장은 원활하였지만 ALA의 생산성이 매우 낮았다.
- 5시간 이후에도 ALA 생산량은 증가하였으며 ALA의 최종 농도는 1300 mg/L 정도이었다. 세포내 효소, ALAS와 ALAD 활성은 세포성장과함께 증가하였지만 LA와 포도당 첨가에 따라 ALAD의 활성은 감소하였는데 전반적으로 다른 실험과 비교할 때 30% 정도 낮은 ALAD 활성을 보였다. 한편, 배 가스 중의 이산화탄소 농도와 반응 기내 용존 산소 농도 변화는 기질이 첨가된시간인 20-21.
- 3b에는 숙신산 농도에 따른 비성장속도 (11 E2)와 ALA의 최대생산농도를 나타내었다. 숙신산 농도에 따른 균체 성장은 숙신산의 농도가 증가할수록 성장속도는 감소하였다. 특히 숙신산 농도가 45 mM 이상 첨가될 경우 성장이 지연되어 최종 균체량은 숙신산 농도가 30 mM일 때의절반 수준밖에 이르지 못하였다.
- LA 첨가로 생산된 ALA는 더 이상 분해되지 않았고 생산농도가 증가하여 800 mg/L이 이르렀다. 이러한 실험 결과로부터 본 연구에서 사용한 재조합 대장균에 의한 ALA 생산 공정에는 IPTG를 첨가하지 않고 LA 만을 첨가한 경우가 ALA 생산에 효과적이며 배양온도는 30°C보다 37°C가 더 적절함을 알 수 있었다.
- 한편, 37 °C 에서 배양할 때 IPTG 첨가에 의한 유도발현을수행하지 않고 접종 후 16시간에 LA만을 첨가하여 유도발현실험결과와 균체성장 및 ALA 생산성을 비교하였다. 접종 후 16시간까지 균체는 정상적인 성장을 하였으며 LA의 첨가 이후 균체량은 감소하지 않았다.
- 8 g/L정도 밖에 되지 않았다. 첫 번째 기질 첨가 이후 pH값이 감소하였으나 pH 값을 다시 6.3 정도로 조절하였는데 이에 따라균체량과 ALA의 생산량이 크게 증가하였다. 한편, LA 첨가직후 pH 조절에 필요한 NaOH 양이 많이 소모되어 pH 조절이 원활하지 못하였는데 두 번째 기질 첨가 이후 즉, 23.
- 배양온도가 30°C일 때 성장 속도 및 대사가 37°C 배양에서 보다빠르게 진행되었으며 IPTG와 LA의 첨가는 성장 및 호흡에별다른 영향을 주지 않았다. 한편, 37°C에서 배양할 때 유도발현 시간 (15시간)에서부터 균체 성장이 지연되었으며 OUR 과 CPR의 최대 점은 각각 0.4와 0.2 mmol/L/min 정도이었으며 LA가 첨가된 18시간에서 OUR 및 CPR은 다시 감소하였고 용존 산소 농도는 10% 이상 증가하였다. 그러나 IPTG에의한 유도발현을 수행하지 않고 37 °C 에서 배양하여 16시간에 LA 만을 첨가한 경우 LA 첨가 직후 OUR과 CP®] 약 0.
- 세포내 효소, ALAS와 ALAD 활성은 세포성장과함께 증가하였지만 LA와 포도당 첨가에 따라 ALAD의 활성은 감소하였는데 전반적으로 다른 실험과 비교할 때 30% 정도 낮은 ALAD 활성을 보였다. 한편, 배 가스 중의 이산화탄소 농도와 반응 기내 용존 산소 농도 변화는 기질이 첨가된시간인 20-21.5시간대와 23-25시간대에서 이산화탄소 농도는증가하고 용존산소의 농도는 10-25% 감소하여 균체 성장과호흡 활성은 증가함을 볼 수 있다. 그러나 기질 및 LA의 첨가 직후 pH 값이 낮아진 상태, 즉 배양액의 pH 조절이 원활하지 못한 시간대에서는 용존 산소의 농도는 급격히 증가하고 이산화탄소 농도는 급격히 감소하였다.
- LA 첨가 시간에 따른 ALA 생산은 균체량의 변화와 거의 유사하게 나타났으며, 접종 후 20시간 이전에 LA를 첨가한 경우 균체의 성장 지연으로 LA를 첨가하지 않았을 때보다 ALA 생산량이 감소하였다. 한편, 접종 후 20시간에 LA를 30 mM 첨가했을 때 균체 성장에는 큰 영향이 없었으며 ALA 생산성은 LA를 첨가하지 않았을 때보다 30% 가량 증가하였다. 그리고 ALAD의 활성이 저해되어 생합성된 ALA가 크게 감소하지 않고 일정 농도를 유지하였다.
후속연구
- 한편, LA 및 숙신산의 첨가 이후 낮아진 배양액의 pH는 균체 성장을 저해하였는데 발효 중 기질을 첨가한 후 pH를 잘 제어하면서 유가식 또는 연속식 발효를 수행하면 ALA 생산성을 증대시킬 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 고농도의 ALA 생산은 균체 생존에 영향을 주므로(37) 생산된 ALA 를 적절히 분리하는 방법이 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.