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제안 방법
- B16 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생합성 저해도 판별을 위하여 B16 멜라닌 생성세포를 5xitf (cells/Dish-35 mm) 의 농도로 10% 소태아혈청을 함유하는 현탁액으로 현탁 시킨 후, 현탁세포를 조직 배양하여 플라스크에 넣고 각각의 시료를 10 , 1/g/mL, 50 g/mL, 100 g/mL씩 첨가하여 CO2배양기(5% 이산화탄소/95% 공기조건)에서 37℃로 3일간 배양한 후, 배양액의 색으로 멜라닌 생성정도를 1차 판별하고, 세포를 인산완충액으로 씻은 후, 트립신 처 리하여 플라스크로부터 분리하였다. 분리된 세포를 튜브 에 모은 후, 인산완충액으로 씻고 원심 분리하여 튜브 아 래쪽에 침전된 멜라닌 생성량을 통해 멜라닌 색소 분비 억제 정도를 비교 평가하였다.
- Chromometer와 입도 분석기(모델명 Zetasizer 3000H, MALVERN사, 영국)를 이용하여 각각 입자크기, 제타 전 위를 측정하였다. 유화기기로는 microfluidizer (모델명 M110F, Microfluidics 사, 미국) 를 이용하였으며, transmission electron microscope으로는 TEM (JEM1010, JEOL, 일본)을 사용하였다.
- SK306RW 추출물의 피부 미백효과를 세포수준에서 관 찰하기 위하여 in vitro 방법으로 멜라닌 생성세포 내에서 멜라닌 생성 억제 효능을 확인하였다. 마우스에서 유 래한 세포균주인 멜라닌 흑색색소를 분비하는 B16 멜라 닌 생성세포를 ATCC (american type culture collection) 로부터 분양 받아 인공배양하면서 본 실험의 추출물 및 상기의 기존 미백원료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다.
- 자 외선 조사 후 색소침착이 최고가 되는 14일 뒤에 각 미 백시료를 1일 2회 30일간 계속 도포하였다. 각 미백시료는 부틸렌글리콜: 물: 에탄올(50:30: 20)의 혼합용매에 녹 여 희석되었으며, 면봉으로 도포하고 다른 부위에는 용매 를 도포하는 음성대조 부위를 두었다.
- 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도한 후, 각 미백시료를 도포하여 30일 후에 색차계를 이용하여 피부의 색소침착 정도를 흑백 명암판정법으로 측정하였다. 각 시료는 실시 예 1~3 추출물 및 양성 대조군으 로 비교적 피부 자극성이 적은 알부틴, 비타민-C, 에틸아 스코빌에테르, 상백피 추출물을 부틸렌글리콜: 물: 에탄올 (50:30: 20)의 혼합용매에 녹여 아침, 저녁 2회씩 도포하였다. 효과의 판정은 동물시험에서와 같이 피부의 명암을 나타내는 L*값을 구하여 평가하고 [우리나라 사람의 피 부색 50~80값을 나타냄], /L*를 계산하여 Table 4에 나타내었다.
- 건강한 남자 15명을 대상으로 피검자의 등 뒷쪽 부위에 직경 1.5 cm의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(minimal erythema dose)의 2배 정도의. 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도한 후, 각 미백시료를 도포하여 30일 후에 색차계를 이용하여 피부의 색소침착 정도를 흑백 명암판정법으로 측정하였다.
- 건조된 추출물을 이용하여 티로시나제 효소 활성 억제 효과, 마우스의 색소세포를 이용한 B16 멜라닌 생성 억제 효과, brown guinea pig의 동물 피부의 미백효과를 측정하였다. 이러한 추출된 SK306RW는 용해성이 좋지 않고 빛, 열, 산소에 의하여 변색되기 쉽다.
- 또한 천화분근, 하고초엽, 위령선근을 안정화시키기 위해서 PG/hydrogenated lecithin/MCT/glycerin/water< microfludizer를 이용하여 30~50 nm인 리포좀을 만들었 다. 이러한 리포좀은 기존의 처리되지 않은 추출물에 비하여 빛과 열에 3~5배 안정성을 보였다.
- SK306RW 추출물의 피부 미백효과를 세포수준에서 관 찰하기 위하여 in vitro 방법으로 멜라닌 생성세포 내에서 멜라닌 생성 억제 효능을 확인하였다. 마우스에서 유 래한 세포균주인 멜라닌 흑색색소를 분비하는 B16 멜라 닌 생성세포를 ATCC (american type culture collection) 로부터 분양 받아 인공배양하면서 본 실험의 추출물 및 상기의 기존 미백원료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다.
- 미놀타 색차계를 사용하여 피부의 흑백정도를 측정하여 미백효과를 판정하였다. 색을 표시하는데는 L*a*b 표 색계를 사용하여 주로 L* 값을 지표로 하여 측정은 1개 부위에 3회 이상 반복하여 색소 침착부를 균등하게 측정하였다.
- 이러한 추출된 SK306RW는 용해성이 좋지 않고 빛, 열, 산소에 의하여 변색되기 쉽다. 본 연구에서는 SK306RW 를 PG/hydrogenated lecithin/MCT/glycerin/ water를 이용하여 리포좀을 만들었다. 리포좀과 나노 에 멀젼은 phosphatidyl choline (PC), phosphatidyl ethanolamine (PE), phosphatidyl serine (PS), sphingomyelins, cardiolipids, plasmalogens, phosphatidic acid, cerebroside 같은 인지질로 구성되어 있는 이중층 폐쇄막을 형성하여 물과 평형 상태에 있는 분자단을 리포좀이라 하는데, 지 질 구성 성분들은 양친매성 성질을 자체 내에 갖고 있어, 극성인 하이드로필릭과 비극성(친유성)을 가진 알킬 체인 인 리포 필릭이 원료 성분의 양친매성 성격이다.
- 배양기(5% 이산화탄소/95% 공기조건)에서 37℃로 3일간 배양한 후, 배양액의 색으로 멜라닌 생성정도를 1차 판별하고, 세포를 인산완충액으로 씻은 후, 트립신 처 리하여 플라스크로부터 분리하였다. 분리된 세포를 튜브 에 모은 후, 인산완충액으로 씻고 원심 분리하여 튜브 아 래쪽에 침전된 멜라닌 생성량을 통해 멜라닌 색소 분비 억제 정도를 비교 평가하였다..
- 미놀타 색차계를 사용하여 피부의 흑백정도를 측정하여 미백효과를 판정하였다. 색을 표시하는데는 L*a*b 표 색계를 사용하여 주로 L* 값을 지표로 하여 측정은 1개 부위에 3회 이상 반복하여 색소 침착부를 균등하게 측정하였다. 도포 시작시점과 완료시점의 피부색의 차이 (L*)를 계산하고 이를 Table 3에 나타내었다.
- 최근 기능성 화장품의 새로운 미백제들과 메카니즘이 다양하게 연구되고 있다. 우리는 천화분근, 하고초엽, 위 령선근(이하 SK306RW라 칭한다)를 이용하여 효능, 효과가 우수한 새로운 미백제를 만들었다. 위령선(威靈仙, clematis chinensis osbeck)은 으아리 및 미나리아제비과 식물 위령선의 뿌리를 일컫는 것으로서 가을에 채취하여 경엽, 수염뿌리를 제거하고 깨끗이 썰어서 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하여온 무독한 한방생약이다[1, 2].
- 5X2.5 cm?의 정방형의 구멍이 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착 시킨 후, SE 램프(파장 290-320 nm)로 총조사 에너지량이 1350 mL/ cm%] 되게 자외선을 조사 한 후, 알루미늄 호일을 벗겨 내고 아래와 같은 도포방법으로 각 미백시료를 도포하여 평가하였다. 자외선 조사 후 색소침착은 3~4일 뒤에 나 타나며 약 2주 후에 최고에 달한다.
- 나노에멀젼은 안정성, 유변학적 특성, 균일성, 높은 계면 면적 등 기존의 일반 에멀젼과는 다른 물리화학적 특성을 지닌다[4-6]. 이러한 리포좀은 기존의 처리되지 않은 주출물과 비교 실험을 위하여 particle size analyzer, FF- TEM, chromameter, HPLC의 분석장비를 사용하였다.
- 생성된 자외선 색소 반의 색조가 동일하며 얼룩이 생기지 않는 것이 중요하 고, 자외선 색소반이 고르지 않은 개체는 제외하였다. 자 외선 조사 후 색소침착이 최고가 되는 14일 뒤에 각 미 백시료를 1일 2회 30일간 계속 도포하였다. 각 미백시료는 부틸렌글리콜: 물: 에탄올(50:30: 20)의 혼합용매에 녹 여 희석되었으며, 면봉으로 도포하고 다른 부위에는 용매 를 도포하는 음성대조 부위를 두었다.
- 5 cm의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(minimal erythema dose)의 2배 정도의. 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도한 후, 각 미백시료를 도포하여 30일 후에 색차계를 이용하여 피부의 색소침착 정도를 흑백 명암판정법으로 측정하였다. 각 시료는 실시 예 1~3 추출물 및 양성 대조군으 로 비교적 피부 자극성이 적은 알부틴, 비타민-C, 에틸아 스코빌에테르, 상백피 추출물을 부틸렌글리콜: 물: 에탄올 (50:30: 20)의 혼합용매에 녹여 아침, 저녁 2회씩 도포하였다.
- 티로시나제에 대한 저해활성은 in vitro 상에서 SK 306RW 추출물 및 양성 대조군으로 코지산, 알부틴, 하이 드로퀴논, 비타민-C, 에틸아스코빌에테르, 상백피 추출물 시료 각각 15 를 마이크로플레이트(96웰)에 넣고, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 150 L, 기질인 1.5 mM L-티로신 용 액 25 L를 넣은 후 16 unit/mL 버섯 티로시나제(0.05 M 인산완충액, pH 6.8) 7 L를 첨가하여 37℃ 에서 10분간 반응시킨 후 신속하게 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중단시킨 다음, 반응 생성물인 도파크롬의 흡수파장인 475 nm에서 흡광도를 측정하고 티로시나제 효소 억제율 (tyrosinase inJiibition rate)을 구했다(Table 1).
- . 평가 방법은 세포배양액 중에 아무것도 처리하지 않은 것과 각 시료를 처리했을 때의 검은 멜라닌 색소를 분비하는 정도에 따라 색상이 변화되는 정도를 475 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성세포의 개수로 계산하여 평가하였다.
대상 데이터
- SK306RW 리포좀의 안정성을 알아보기 위하여 chro- mameter를 사용하여 측정하였다. 측정결과(Figure 3) 빛 과 열 안정성에서 리포좀을 처리한 것이 처리하지 않은 것에 비하여 3~5배 안정성이 뛰어났다
- 본 실험에서 사용된 레시친은 Lipoid사의 Lipoid S 75 (불포화레시친), Lipoid S 75-3(포화레시친)이다. 물은 양 이온-음이온 교환수지를 통과한 물을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 레시친은 Lipoid사의 Lipoid S 75 (불포화레시친), Lipoid S 75-3(포화레시친)이다. 물은 양 이온-음이온 교환수지를 통과한 물을 사용하였다.
- Chromometer와 입도 분석기(모델명 Zetasizer 3000H, MALVERN사, 영국)를 이용하여 각각 입자크기, 제타 전 위를 측정하였다. 유화기기로는 microfluidizer (모델명 M110F, Microfluidics 사, 미국) 를 이용하였으며, transmission electron microscope으로는 TEM (JEM1010, JEOL, 일본)을 사용하였다.
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