혈전 관련 질환 예방 및 혈류개선 기능성 식품의 개발을 목표로, 식용 및 약용 산채류 55종의 메탄을 추출물을 조제한 후 트롬빈 저해활성을 검색하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 아스피린보다 우수한 항혈전 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 첫버들 추출물 등 8종을 선별하였으며, aPTT, 혈전 용해활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하며 참나물, 큰까치수영 및 갯버들 추출물을 최종 선별하였다. 참나물의 경우 열안정성이 낮은 반면 소화효소 비저해로 인해 그 이용성이 높으며, 큰 까치수영 및 갯버들의 경우 부분적인 소화효소 저해능이 있으나 우수한 항혈전활성 및 열 안정성을 나타내어 다양한 식품소재로 개발이 가능함을 확인하였다.
혈전 관련 질환 예방 및 혈류개선 기능성 식품의 개발을 목표로, 식용 및 약용 산채류 55종의 메탄을 추출물을 조제한 후 트롬빈 저해활성을 검색하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 아스피린보다 우수한 항혈전 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 첫버들 추출물 등 8종을 선별하였으며, aPTT, 혈전 용해활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하며 참나물, 큰까치수영 및 갯버들 추출물을 최종 선별하였다. 참나물의 경우 열안정성이 낮은 반면 소화효소 비저해로 인해 그 이용성이 높으며, 큰 까치수영 및 갯버들의 경우 부분적인 소화효소 저해능이 있으나 우수한 항혈전활성 및 열 안정성을 나타내어 다양한 식품소재로 개발이 가능함을 확인하였다.
Inhibitory activities of 58 methanol extracts, which were prepared from different parts of 55 kinds of edible and medicinal plants, against human thrombin were evaluated. Analysis of the anti-coagulation activity determined by thrombin time enabled us to select 8 herb extracts as possible sources of...
Inhibitory activities of 58 methanol extracts, which were prepared from different parts of 55 kinds of edible and medicinal plants, against human thrombin were evaluated. Analysis of the anti-coagulation activity determined by thrombin time enabled us to select 8 herb extracts as possible sources of anti-thrombosis agent. Further analysis of anti-thrombosis activity determined by activated partial thromboplastin time and fibrinolytic activity, and heat stability and inhibition against other proteolytic digestive enzymes provided new information that Pimpinella brachycarpa, Lysimachia clethroides, and Salix gracilistyla could be used as a potential anti-thrombosis agent. Our results suggest that edible and medicinal plants could be the potential source of thrombin inhibitor.
Inhibitory activities of 58 methanol extracts, which were prepared from different parts of 55 kinds of edible and medicinal plants, against human thrombin were evaluated. Analysis of the anti-coagulation activity determined by thrombin time enabled us to select 8 herb extracts as possible sources of anti-thrombosis agent. Further analysis of anti-thrombosis activity determined by activated partial thromboplastin time and fibrinolytic activity, and heat stability and inhibition against other proteolytic digestive enzymes provided new information that Pimpinella brachycarpa, Lysimachia clethroides, and Salix gracilistyla could be used as a potential anti-thrombosis agent. Our results suggest that edible and medicinal plants could be the potential source of thrombin inhibitor.
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문제 정의
알려지고 있다. 따라서, 본 연구에서는 혈전 관련 질환 예방 및 혈류개선 기능강화 식품의 개발을 목표로, 현재 상대적으로 연구가 미비한 식용 및 약용 산채류 55 종을 대상으로 혈전 생성에 중추적인 역할을 하는 트롬빈의 저해물질을 검색하고자 하였으며, 300% 이상의 트롬빈 저해 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 추출물 등 8종의 산채 추출물을 1차로 선별한 후, aPTT [3], 혈전 용해활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하여 참나물, 큰까치수영 및 갯버들추출물을 최종적으로 선별하였다. 이러한 산채류 추출물의 항혈전 활성, 특히 참나물 및 큰까치수영의 항혈전 활성은 현재까지 보고된 바 없으며, 식용 및 약용 산채류로부터 심혈관 질환의 예방 및 개선용 식물 생약 및 기능성 식품의 개발이 가능함을 제시하고 있다.
혈전 관련 질환 예방 및 혈류개선 기능성 식품의 개발을 목표로, 식용 및 약용 산채류 55 종의 메탄올 추출물을 조제한 후 트롬빈 저해활성을 검색하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 아스피린보다 우수한 항혈전 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 추출물 등 8종을 선별하였으며, aPTT, 혈전 용해 활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하여 참나물, 큰까치수영 및 갯버들 추출물을 최종 선별하였다.
제안 방법
사용하였다. 건조 재료 약 100 g을 메탄올을 사용하여 3일간 3회 추출하였으며, 추출액은 감압 농축하여 분말로 제조하여, 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였으며, DMSO (di- methylsulfoximide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 트롬빈 저해 활성, 혈전 용해활성, 소화효소 저해활성 등을 측정하였다. 사용한 재료, 추출 부위는 Table 1에 나타내었다.
후 트롬빈 저해활성을 검색하였다. 그 결과, 대조군으로 사용된 아스피린보다 우수한 항혈전 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 추출물 등 8종을 선별하였으며, aPTT, 혈전 용해 활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하여 참나물, 큰까치수영 및 갯버들 추출물을 최종 선별하였다. 참나물의 경우 열안정성이 낮은 반면 소화효소 비저해로 인해 그 이용성이 높으며, 큰까치수영 및 갯버들의 경우 부분적인 소화효소 저해능이 있으나 우수한 항혈전활성 및 열 안정성을 나타내어 다양한 식품소재로 개발이 가능함을 확인하였다.
산채류의 트롬빈 저해 활성을 평가하기 위해 55 종의 식용 및 약용 산채류의 메탄올 추출물을 조제한 후 Thrombin Time을 측정 하였다(Table 1). 시료의 최종농도가 1.
배양하였다. 양성 대조군으로는 plasmin (0.1 U)을, 음성 대조구는 시료 용매인 DMSO를 10 ul 사용하였으며, 37℃에서 18 시간동안 반응시킨 후, 형성되는 투명환의 크기를 측정하였다[1, 12].
37C 에서 3 분간 배 양하였다. 이후 50 )11 CaCl2 (35 mM) 을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다[3, 4], 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조 구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
인산완충용액(10 mM, pH 8.0)에 피브리노겐을 0.3% 첨가하여 완전히 용해한 후 평판에 붓고, 45℃로 유지한 1% 살균 agarose 용액을 동량 첨가하여 충분히 혼합한 후, 트롬빈 100 U를 첨가하고, 상온에서 1시간 방치하여 고화된 피브린 평판을 준비하였다. 이 후, 평판에 적정수의 미세구멍을 만들고, 각각의 미세구멍에 다양한 산채류 추출액
트롬빈 이외 의 a -chymotrypsin, trypsin 및 pepsin에 대한 저해활성은 Anson방법을 변형하여 사용하였다μ7]. 즉, 1/15 M Mcllvaine buffer (pH 7.
aPTT에 의한 혈액 항응고 활성 평가의 결과(Table 2), 큰까치수영에서 가장 우수한 저해 활성이 나타나 항응고성 물질을 포함하고 있음을 확인하였다. 한편, 혈전관련 질환의 예방 및 치료를 위해서는 이미 생성된 혈전의 분해활성 또한 중요하므로 선별된 8종의 산채추출물을 대상으로 혈전분해 활성을 평가하였다. 그러나 대조구로 사용된 plasmin을 제외한 어떤 추출물 시료에서도 혈전분해에 따른 투명환을 확인할 수 없었다.
, Japan). 효소액의 조제는 pepsin (Sigma Co., USA) 의 경우 1/15 M KC1-HC1 buffer (pH 2.0) 에 최종 농도 10 unit 되도록 조정 하였으며, a -chymotrypsin 과 trypsin의 경우에는 1/15 M Mcllvaine buffer (pH 7.6) 에녹여 최종농도가 각각 5 unit, 70 unit 되도록 조정하여 사용하였다. 각각의 효소 활성의 저해율은 다음의 식에 의해 계산하였다.
대상 데이터
2000년 7월에서 2001년 7월 사이에 경북 영양, 봉화지역 및 강원도 일대에서 구입, 채취한 55 종 식용 및 약용 산채류를[1 이, 대한식물도감에서 검증하여[13] 음건한 후 세절하여 추출에 사용하였다. 건조 재료 약 100 g을 메탄올을 사용하여 3일간 3회 추출하였으며, 추출액은 감압 농축하여 분말로 제조하여, 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였으며, DMSO (di- methylsulfoximide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 트롬빈 저해 활성, 혈전 용해활성, 소화효소 저해활성 등을 측정하였다.
구하였다[7]. 시료 대조구로는 아스피린(Sigma Co., USA) 과헤파린(heparan; Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조 구로는 DMSO를 사용하였고, DMSO의 경우 32 초의 응고 시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30 분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다.
성능/효과
2에 나타내 었다. 100℃, 30분간 열처리에 의해 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망의 경우 거의 활성을 상실하였으며, 붉나무, 큰까치수영, 갯버들의 경우 활성 변화가 미약하였다. 이러한 결과는, 우수한 트롬빈 저해활성과 소화효소 비 저해능을 가진 참나물의 경우 열처리하지 않은 상태로 식품소재로 이용되어야 하며, 큰까치수영 및 갯버들은 다양한 열처리 과정을 거쳐 식품소재화 할 수 있음을 추측케 한다.
실제 salicylate를 동일농도로 처리한 경우 그 활성은 아스피린과 유사하였다(results not shown). aPTT에 의한 혈액 항응고 활성 평가의 결과(Table 2), 큰까치수영에서 가장 우수한 저해 활성이 나타나 항응고성 물질을 포함하고 있음을 확인하였다. 한편, 혈전관련 질환의 예방 및 치료를 위해서는 이미 생성된 혈전의 분해활성 또한 중요하므로 선별된 8종의 산채추출물을 대상으로 혈전분해 활성을 평가하였다.
1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조 구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
그러나 대조구로 사용된 plasmin을 제외한 어떤 추출물 시료에서도 혈전분해에 따른 투명환을 확인할 수 없었다. 선별된 추출물의 식품 소재 및 식물생약으로의 개발 가능성을 위해 8종의 선별 산채 추출물에 대해 트롬빈 이외의 소화효소 저해 활성을 검토 한 결과(Table 3), 추출물 최종농도 1 mg/ml 의 농도에서 pepsin (carboxyl protease)을 저해하는 산채류는 없었으며, 트롬빈과 동일계열의 trypsin, chymotrypsin (serine protease)을 저해하는 추출물이 다수 확인되었다. 특히 붉나무, 우산나물, 쥐다래, 할미밀망의 경우 아스피린보다 매우 높은 저해활성을 나타내었으며, 사삼, 참나물, 큰 까치 수영 및 갯버들 추출물은 저해가 거의 없거나 미약하였다.
측정 하였다(Table 1). 시료의 최종농도가 1.5 mg/ml되게 첨가한 경우, 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 등 8 종의 추출물에서 300% 이상의 트롬빈 저해율을 나타냄을 확인하였다. 특히, 붉나무, 우산나물, 참나물 할미밀망, 큰까치수영 및 갯버들 추출물은 동일 농도의 아스피린 항혈전 활성(380% 저해율)보다 1.
그 결과, 대조군으로 사용된 아스피린보다 우수한 항혈전 활성을 나타내는 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 추출물 등 8종을 선별하였으며, aPTT, 혈전 용해 활성, 열 안정성, 기타 소화효소 저해활성 등을 평가하여 참나물, 큰까치수영 및 갯버들 추출물을 최종 선별하였다. 참나물의 경우 열안정성이 낮은 반면 소화효소 비저해로 인해 그 이용성이 높으며, 큰까치수영 및 갯버들의 경우 부분적인 소화효소 저해능이 있으나 우수한 항혈전활성 및 열 안정성을 나타내어 다양한 식품소재로 개발이 가능함을 확인하였다.
선별된 추출물의 식품 소재 및 식물생약으로의 개발 가능성을 위해 8종의 선별 산채 추출물에 대해 트롬빈 이외의 소화효소 저해 활성을 검토 한 결과(Table 3), 추출물 최종농도 1 mg/ml 의 농도에서 pepsin (carboxyl protease)을 저해하는 산채류는 없었으며, 트롬빈과 동일계열의 trypsin, chymotrypsin (serine protease)을 저해하는 추출물이 다수 확인되었다. 특히 붉나무, 우산나물, 쥐다래, 할미밀망의 경우 아스피린보다 매우 높은 저해활성을 나타내었으며, 사삼, 참나물, 큰 까치 수영 및 갯버들 추출물은 저해가 거의 없거나 미약하였다. 선별 산채 추출물의 열 안정 성을 측정한 결과는 Fig.
5 mg/ml되게 첨가한 경우, 붉나무, 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망, 큰까치수영, 갯버들 등 8 종의 추출물에서 300% 이상의 트롬빈 저해율을 나타냄을 확인하였다. 특히, 붉나무, 우산나물, 참나물 할미밀망, 큰까치수영 및 갯버들 추출물은 동일 농도의 아스피린 항혈전 활성(380% 저해율)보다 1.5-3 배 이상의 저해활성을 나타내어 항혈전 예방 및 치료제로 개발 가능성이 충분함을 확인하였다. 8종의 추출물의 농도별 트롬빈 저해 활성을 확인한 결과는 Fig.
후속연구
이러한 결과는, 우수한 트롬빈 저해활성과 소화효소 비 저해능을 가진 참나물의 경우 열처리하지 않은 상태로 식품소재로 이용되어야 하며, 큰까치수영 및 갯버들은 다양한 열처리 과정을 거쳐 식품소재화 할 수 있음을 추측케 한다. 따라서 본 연구 결과는 심혈관계 질환의 예방 및 치료가 가능한 산채류의 선정, 식품 소재개발 및 가공적성의 기초적인 결과로 활용될 수 있다. 현재, 참나물, 큰까치수영 및 갯버들의 활성성분 검색과 조추출물에 의한 in vivo 활성평가가 진행 중이다.
이러한 농도증가에 따른 급격한 변화는 특히 갯버들, 할미밀망, 우산나물 등에서 뚜렷하였으며, 이는 아스피린과 달리 사용된 시료가 정제되지 않은 상태이므로 나타나는 현상으로 이해된다. 따라서 선정 산채류의 활성 성분의 정제 및 처리량의 조절을 통해 더욱 증가된 항혈전 활성을 얻을 수 있으리라 기대된다. 한편 버드나무과의 용버들(Salix matsntoia), 백 버들(Sa0x alba) 등에서 항응고 활성을 나타내는 살리신(아스피린의 전구체)이 보고 된 바 있으나[9, 14], 갯버들의 경우 보고되어 있지 않으며 또한 활성 측면에서 아스피린과 많은 차별을 보이므로 그 활성 주성분이 살리신은 아닌 것으로 판단된다.
100℃, 30분간 열처리에 의해 사삼, 우산나물, 쥐다래, 참나물, 할미밀망의 경우 거의 활성을 상실하였으며, 붉나무, 큰까치수영, 갯버들의 경우 활성 변화가 미약하였다. 이러한 결과는, 우수한 트롬빈 저해활성과 소화효소 비 저해능을 가진 참나물의 경우 열처리하지 않은 상태로 식품소재로 이용되어야 하며, 큰까치수영 및 갯버들은 다양한 열처리 과정을 거쳐 식품소재화 할 수 있음을 추측케 한다. 따라서 본 연구 결과는 심혈관계 질환의 예방 및 치료가 가능한 산채류의 선정, 식품 소재개발 및 가공적성의 기초적인 결과로 활용될 수 있다.
참고문헌 (17)
Astrup, Tage, Müllertz, Sten.
The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity.
Archives of biochemistry and biophysics,
vol.40,
no.2,
346-351.
Krivoy, N, Pavlotzky, E, Chrubasik, S, Eisenberg, E, Brook, G.
Effect of salicis cortex extract on human platelet aggregation..
Planta medica,
vol.67,
no.3,
209-212.
Kwon, Chong-Suk, Kim, Ji-Hyeon, Son, Kun-Ho, Kim, Young-Kyoon, Lee, Jeong-Soon, Lim, Jin-Kyu, Kim, Jong-Sang.
Induction of Quinone Reductase, an Anticarcinogenic Marker Enzyme, by Medicinal Herb Extracts.
Nutraceuticals and food,
vol.7,
no.4,
358-366.
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