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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 사람의 분변에서 담즙산 분해능이 띄어난 젖산균을 분리하고, 이 젖산균의 혈중 콜레스테롤의 서하효과에 관한 기초 지식을 얻고자, 젖산균의 내산성, 내담즙산성 및 항대장균성 등 균주특성을 조사하여 활성이 높은 군주를 선별하고, 동정하였다.
- , 1990). 이에 본 연구에서는 젖산균의 생존에 영향을 미치는다양한 pH(pH 2.0~5.0)에서의 생존율을 조사하였다(Table 2). 이상으로 pH 4에서는 모든 유산균주들이 약 94% 이상으로생존하였으나, pH가 낮아짐에 따라 생존율이 감소하였다.
제안 방법
- 본 연구에서 선발된 젖산균들 중 가장 우수한 결과를 보여준 Lactobacillus sp. CK 102를 API kit를 이용한 당발효 실험과 16S rRNA 분석을 통하여 동정하였다. API kit 분석에서는 Lactobacillus 으로 나타났다(Table 4).
- 0×l08 CFU/mL)를 접종하여 37℃로 6시간 동안 방치하였다. MRS agar plate에 도말하여 배양한 후 다음식에 의해 내산성 또는 내담즙성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다.
- A)를 사용하였다. Oxgall과 bile extract를 MRS 배지에 각각 0.5% 첨가하고 agar(Difco, Detroit, U.S.A.)를 1.7% 첨가하여 멸균한 다음 한천배지평판을 만들고, 시험 젖산균을 도말 접종한 후, 37℃로 조정한 배양기에서 3일간 배양하였다. 담즙산 분해반응의 정도는 균락 주위에 형성된 투명환을 육안으로 관찰하여 3등급으로 구분하였다.
- 건강한 성인 30명으로부터 분변을 채취하여 멸균된 시료병에 넣은 다음 아이스박스에 넣어 실험실로 옮긴 후, 분변을 0.02% sodium azide(NaN3)가 첨가된 MRS 액체배지가 담긴 15mL 시험관에 멸균된 면봉을 이용하여 넣고, 멸균된 가위를 이용하여 면봉의 1/3 부분을 잘라 넣은 후, 37℃에서 약 2 일간 배양하였다. MRS 한천 배지상에 생성된 균락을 백금이로 채집하여 MRS 액체 배지에 접종하고, 다시 배양하였다.
- 건강한 성인의 분변으로부터 담즙산 분해능이 우수한 젖산균의 분리를 위하여 무작위 선별법과 도말법을 사용하여 총 120주의 젖산균을 1차 분리하였고, 그 중 5종의 젖산균을 최종 선발하였다. 유용한 젖산균이 갖추어야할 중요한 성질인 내산성, 내담즙산성, 대장균 저해능을 시험한 결과 Lactobacillus sp.
- 담즙산 분해능이 우수한 균주의 내산성 또는 내담즙성의 분석을 위하여 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0인 1/15M KH2PO4-HCl 완충용액과 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0%(w/v)의 bile salt를 함유한 각각의 MRS broth에 각 분리 균주(2.0×l08 CFU/mL)를 접종하여 37℃로 6시간 동안 방치하였다. MRS agar plate에 도말하여 배양한 후 다음식에 의해 내산성 또는 내담즙성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다.
- 7% 첨가하여 멸균한 다음 한천배지평판을 만들고, 시험 젖산균을 도말 접종한 후, 37℃로 조정한 배양기에서 3일간 배양하였다. 담즙산 분해반응의 정도는 균락 주위에 형성된 투명환을 육안으로 관찰하여 3등급으로 구분하였다.
- 접종된 배지를 37℃ 배양기에서 정치배양하면서 3시간 또는 6시간 간격으로 배양액을 채취하여 멸균 생리식염수로 희석한 후 LB 평판배지에 나타난 군락으로부터 대장균 수를 측정하였다. 분리균에 의한 대장균의 생육억제 정도는 MRS 배지에 단독으로 접종하여 배양한 대장균수와 비교하여 계산하였다.
- 분리균주들은 MRS 배지에서 대장균은 LB 배지에서 12~24시간 배양한 후, 하나의 MRS 배지에는 대장균을 약 5.0×lO8 CFU/mL이 되도록 접종하고 다른 하나의 MRS 배지에는 분리균주와 대장균이 각각 약 5.0×108 CFU/mL의 수가 되도록 혼합 접종하였다. 접종된 배지를 37℃ 배양기에서 정치배양하면서 3시간 또는 6시간 간격으로 배양액을 채취하여 멸균 생리식염수로 희석한 후 LB 평판배지에 나타난 군락으로부터 대장균 수를 측정하였다.
- , 1996). 이러한 목적을 달성하기 위해서는 사용하고자 하는 젖산균을 건강한 성인의 분변에서 분리하는 것이 가장 좋을 것으로 생각되어 동물 및 인간의 장으로부터 분리하는 것보다 분변을 사용하였다.
- 0×108 CFU/mL의 수가 되도록 혼합 접종하였다. 접종된 배지를 37℃ 배양기에서 정치배양하면서 3시간 또는 6시간 간격으로 배양액을 채취하여 멸균 생리식염수로 희석한 후 LB 평판배지에 나타난 군락으로부터 대장균 수를 측정하였다. 분리균에 의한 대장균의 생육억제 정도는 MRS 배지에 단독으로 접종하여 배양한 대장균수와 비교하여 계산하였다.
대상 데이터
- 선발된 균주중 답즙산이 첨가된 배지에서 1차적으로 투명환의 형성이 비교적 큰 균주 5종을 선별하여 Lactobacillus sp. CK 101, CK 102, CK 103, CK 104, CK 105)로 명명하고, 다음 시험에 이용하였다.
- MRS 한천 배지상에 생성된 균락을 백금이로 채집하여 MRS 액체 배지에 접종하고, 다시 배양하였다. 배양된 균주의 colony의 형태, catalse 음성, Gram 양성, 유산생성 등을 기준으로 하여 젖산균으로 추정되는 균주를 선발하였다. 선발된 균주들을 원심분리(7,000 rpm, 15 min)하고상등액을 멸균된 20% 탈지유로 치환하여 냉동(-70℃ 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 시람의 분변 현탁액을 분리원으로 하여 120여개의 단일 colony를 얻었으며, 얻어진 colony의 형태, catalse 음성, Gram 양성, 유산생성 등을 기준으로 하여 젖산균으로 추정되는 30 여주를 선발하였다(data not shown). 선발된 균주중 답즙산이 첨가된 배지에서 1차적으로 투명환의 형성이 비교적 큰 균주 5종을 선별하여 Lactobacillus sp.
- plate assay를 이용하여 시험하였다. 시험에 사용한 담즙산은 oxgall powder와 bile extract(Sigma, Louis U.S.A)를 사용하였다. Oxgall과 bile extract를 MRS 배지에 각각 0.
- )를 사용하였다. 젖산균 배양배지로는 MRS broth(Difco, Detroit, U.S.A.)를 사용하였고, 내장균은 LB broth(1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, 1.0% WaCl)를 사용하였으며 배양조건은 37℃에서 1일간 호기적으로 배양하였다.
- 젖산균은 건강한 성 인의 분변으로부터 분리하여 사용하였고, 대장균은 한국유전자은행 (KCTC)의 표준균주 E. coli KCTC 1041를 실험에 사용하였고, 담즙산은 oxgall powder와 bile extract(Sigma, Louis U.S.A.)를 사용하였다. 젖산균 배양배지로는 MRS broth(Difco, Detroit, U.
데이터처리
- 실험에 의한 자료처리는 Windows 용 MS Excel 및 SAS (Stastic Analytical System, USA) Program(1989) 을 사용하여 구하였고 신뢰구간 검정은 K2 검정에 의하였고, 유의차 검정은 Duncan Multiple Range Test로 모두 95% 이상의 신뢰구간을 기준으로 산술하였다.
이론/모형
- 분리균주 중 특성이 가장 우수한 Lactobacillus sp. CK 102 균주를 API kit를 이용한 당 발효실험과 Bergey's manual (Williams and Wilkins, 1986)에 의한 동정을 실시한 후, 16S rRNA sequencing 방법 (Loffler et al., 2000)을 사용하여 동정 하였다.
- 젖산균의 담즙산 분해는 Dashkeviez와 Feighner(1989)의 agar plate assay를 이용하여 시험하였다. 시험에 사용한 담즙산은 oxgall powder와 bile extract(Sigma, Louis U.
성능/효과
- Lactobacillus sp. CK 102 균주는 pH 2.0에서 68% 이상의 내성과 1.0% 담즙산이 함유된 배지에서 90% 이상의 내성을 나타냈으며 MRS 배지에서 대장균과 혼합 배양시 18시간 이내에 대장균을 100% 사멸시켰다. 젖산균제로써 기능이 가장 우수한 균주인 Lactobacillus sp.
- 이상의 결과로부터 분리된 Lactobacillus sp. CK 102 균주는 담즙산 분해능과 내산성, 내담즙산성이 뛰어나며, 대장균 억제효과가 있는 Lactobacillus plantarum으로 판명되었다.
- 이는 내산성이 강한 Lactobacillus sp. CK 102, 104 균주들이 비교적 산성이 강한 담즙산에도 강한 생존율을 나타내는 것임을 알 수 있었다.
- 젖산균제로써 기능이 가장 우수한 균주인 Lactobacillus sp. CK 102를 API kit와 16S rRNA sequencing 방법을 사용하여 동정한 결과 Lactobacillus platarum 으로 밝혀졌다. 이상의 결과에서 분리한 Lactobacillus sp.
- 2에 나타내었다. 대부분의 분리 젖산균들은 접종 후 6~9시간까지 완만한 저해효과를 나타내었고, 30시간에는 거의 모든 대장균을 사멸시키는 효과가 나타났다. 특히 Lactobacillus sp.
- 대장균의 성장억제가 배양과정에서 젖산균이 생성한 젖산에 의해 낮아진 pH의 영향인지 파악하기 위하여 pH 별로 대장균 성장억제 실험을 실시해 본 결과 산성 pH에서는 성장은 억제되었으나 사멸은 되지 않았음을 알 수 있었다(data not shown). 젖산균에 의한 유해 세균의 억제는 젖산균이 생산하는 bacteriocin에 의해서 이루어지는 것으로 알려져 있다(Huttu-men et al.
- 3). 따라서 동정된 CK 102 균주는 미생물제로써 사용이 가능한 안전성이 있는 젖산균임을 알 수 있었다.
- , 1977). 본 실험에서는 분리된 균주를 담즙산이 0-1.0% 함유된 MRS 배지에 도말하였을 때 담즙산 함량에 반비례하여 성장하였고, 담즙산 함량이 높은(0.5% 이상 함량) 배지에서는 colony 형태가 pin point형인 것으로 보아 이는 분리된 균주가 담즙산에 의해 사멸되지는 않고 성장이 저해되는 것으로 추측되어진다.
- 십이지장에서 분비되는 담즙에 대한 내성을 실험하기 위하여 담즙산의 다양한 농도(0.1 ~1.0%)에서의 생존율을 조사한 결과, CK 102 균주가 담즙산 농도 1.0%에서 생존율 92.2% 로 가장 우수한 생존율을 나타내었고 CK 104 균주도 65.2% 로 우수한 결과를 나타내었다(Table 3). 이는 내산성이 강한 Lactobacillus sp.
- 0)에서의 생존율을 조사하였다(Table 2). 이상으로 pH 4에서는 모든 유산균주들이 약 94% 이상으로생존하였으나, pH가 낮아짐에 따라 생존율이 감소하였다. pH 2.
후속연구
- 본 균종은 건강한 인체의 분변에서 분리하였기 때문에 어느정도 안전성이 확보되어 있을 것으로 추정되며, 담즙산 분해능으로 인한 콜레스테롤 저하효과를 추가적인 실험으로밝힌다면 건강보조식품 또는 사료첨가제 등의 유용한 소재로 사용이 가능할 것으로 생각되었다.
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