Anti-Outer Membrane Protein 면역단백질을 이용한 Sandwich ELISA 방법에 의한 우유 내 Salmonella의 검출 Detection of Salmonella in Milk by Sandwich ELISA using Anti-Outer Membrane Protein Immunoglobulins원문보기
우유내 Salmonella를 검출하기 위한 Sandwich ELISA의 특이성을 조사하였다. Sandwich ELISA에 사용한 항체들은 OMP 분획을 닭에 면역주사하여 얻은 IgY와 OMP 분획을 gel filtration하여 얻은 분자량 40,000의 OMP를 토끼에 면역 주사하여 얻은 토끼 IgG를 사용하였다. Immnoblot assay에서 IgY는 분자량 6,000의 OMP에 강하게 반응하였으며 토끼 IgG는 분자량 40,000, 35,000과 6,000의 OMP들에 강하게 반응하였다. IgY와 토끼 IgG는 Salmonella typhimurium의 다른 단백질에도 반응하였다. Competitive ELISA에서 IgY가 Salmonella의 두 개 균주에 대해 특이성을 나타냈으며 Eshcherchia coli와 Yersinia enterocolitica에 의하여서는 반응을 나타내지 않았다. 우유에 세균을 첨가하여 실시한 sandwich ELISA에서 Salmonella typhimurium 2균주가 가장 높은 흡광도를 보였다. Salmonella cholerasuis 균주들은 상대적으로 흡광도가 낮았으며 이루 일부 Salmonella cholerasuis 균주들은 비 Salmonella 균주들과 차이가 없었다.
우유내 Salmonella를 검출하기 위한 Sandwich ELISA의 특이성을 조사하였다. Sandwich ELISA에 사용한 항체들은 OMP 분획을 닭에 면역주사하여 얻은 IgY와 OMP 분획을 gel filtration하여 얻은 분자량 40,000의 OMP를 토끼에 면역 주사하여 얻은 토끼 IgG를 사용하였다. Immnoblot assay에서 IgY는 분자량 6,000의 OMP에 강하게 반응하였으며 토끼 IgG는 분자량 40,000, 35,000과 6,000의 OMP들에 강하게 반응하였다. IgY와 토끼 IgG는 Salmonella typhimurium의 다른 단백질에도 반응하였다. Competitive ELISA에서 IgY가 Salmonella의 두 개 균주에 대해 특이성을 나타냈으며 Eshcherchia coli와 Yersinia enterocolitica에 의하여서는 반응을 나타내지 않았다. 우유에 세균을 첨가하여 실시한 sandwich ELISA에서 Salmonella typhimurium 2균주가 가장 높은 흡광도를 보였다. Salmonella cholerasuis 균주들은 상대적으로 흡광도가 낮았으며 이루 일부 Salmonella cholerasuis 균주들은 비 Salmonella 균주들과 차이가 없었다.
The specificity of sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Salmonella in milk was determined in this study. The antibodies used in sandwich ELISA were egg yolk immunoglobulin G (IgY) obtained after immunization of hen with outer membrane protein (OMP) fraction from Salmonella ty...
The specificity of sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Salmonella in milk was determined in this study. The antibodies used in sandwich ELISA were egg yolk immunoglobulin G (IgY) obtained after immunization of hen with outer membrane protein (OMP) fraction from Salmonella typhimurium and rabbit IgG obtained after immunization of rabbit with the purified OMP with the molecular weight of 40,000. The immunoblot assay showed that the IgY reacted strongly with OMP with the molecular weight of 6,000 and the rabbit IgG reacted strongly with OMP with the molecular weights of 40,000, 35,000, and 6,000 from the bacteria including Salmonella which belongs to Enterobacteriaceae. The IgY and rabbit IgG also reacted with other proteins from Salmonella typhimurium in immunoblot assay. Competitive ELISA showed that IgY showed specifity to react with two strains of Salmonella typhimurium and Salmonella cholerasuis but not with Escherichia coli and Yersinia enterocolitica. Two strains of Salmonella typhimurium added to UHT milk showed the highest absorbance of all the bacteria used in the sandwich ELISA. Some strains of Salmonella cholerasuis showed higher absorbances than non-Salmonella bacteria.
The specificity of sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Salmonella in milk was determined in this study. The antibodies used in sandwich ELISA were egg yolk immunoglobulin G (IgY) obtained after immunization of hen with outer membrane protein (OMP) fraction from Salmonella typhimurium and rabbit IgG obtained after immunization of rabbit with the purified OMP with the molecular weight of 40,000. The immunoblot assay showed that the IgY reacted strongly with OMP with the molecular weight of 6,000 and the rabbit IgG reacted strongly with OMP with the molecular weights of 40,000, 35,000, and 6,000 from the bacteria including Salmonella which belongs to Enterobacteriaceae. The IgY and rabbit IgG also reacted with other proteins from Salmonella typhimurium in immunoblot assay. Competitive ELISA showed that IgY showed specifity to react with two strains of Salmonella typhimurium and Salmonella cholerasuis but not with Escherichia coli and Yersinia enterocolitica. Two strains of Salmonella typhimurium added to UHT milk showed the highest absorbance of all the bacteria used in the sandwich ELISA. Some strains of Salmonella cholerasuis showed higher absorbances than non-Salmonella bacteria.
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문제 정의
Salmonella typhimurium KCTC 2421의 OMP 분획에 대한 IgY의 반응의 특이성을 조사하기 위하여 competitive ELISA 를 하였다. Microplate의 well의 표면에 흡착된 OMP 분획에 대해 Salmonella typhimurium KCTC 2421, Salmonella cholerasuis KCTC 2930, Escherichia coli KCTC 2441 및 Yersinia enterocolitica ATCC 23715의 균체가 IgY가 OMP 분획에 결합하는 것을 억제하는지 각각 1 mL 당 105, 106, 107, 108, "의 세균을 IgY와 함께 well에 가하였다.
본 연구는 Salmonella 1으로부터 분리한 OMP 단백질들을 닭과 토끼와 면역주사하여 얻은 난황 immunoglobulin G(IgY)과 토끼 immunoglobulin G의 특이성을 조사하여 Salmonella 검출을 위한 ELISA 방법으로서의 가능성을 : 즈사하였다.
본 연구에서 Salmonella typhimuriwn의 0MP 분획과 40K-OMP를 각각 면역주사하여 얻는 IgY와 닭과 토끼의 다가항체를 이용하여 Salmonella를 검출할 수 있는 면역방법을 개발하고자 시도하였다. 그러나 OMP 분획의 주단백질인 40K-OMP가 닭과 토끼에서 항체를 형성하는 능력이 낮았다.
제안 방법
Salmonella typhimurium KCTC 2421의 OMP 분획에 대한 IgY의 반응의 특이성을 조사하기 위하여 competitive ELISA 를 하였다. Microplate의 well의 표면에 흡착된 OMP 분획에 대해 Salmonella typhimurium KCTC 2421, Salmonella cholerasuis KCTC 2930, Escherichia coli KCTC 2441 및 Yersinia enterocolitica ATCC 23715의 균체가 IgY가 OMP 분획에 결합하는 것을 억제하는지 각각 1 mL 당 105, 106, 107, 108, "의 세균을 IgY와 함께 well에 가하였다. Salmonella typhimurium KCTC 2421와 Salmonella cholerasuis KCTC 2930은 세균수가 증가함에 따라 흡광도가 감소하였으나 Escherichia coli KCTC 2441와 Yersinia enterocoliticaATCC 23715은 세균수의 증가에 따라 흡광도의 변화가 없었다.
7에 분산시켜 37 ℃ 에서 18시간 반응시켰다. 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, pH 7.7으로 평형화된 Sephacryl S-400-HR gel filtration column(2.5 cmx48 cm)을 사용하여 outer membrane proteins을 chromatography하였다. 용출액을 280 nm에서 흡광도를 측정하였다.
토끼 항체를 well에 흡착시키고 UHT 우유에 첨가된 Salmonella 7 균주를 비롯한 총 16개의 세균들의 반응을 측정하였다. IgY와 토끼 anti-IgY alkaline phosphatase conjugate 를 이용하여 결합한 세균을 검출하였다(Table 1). Salmonella typhimurium 2 균주가 2.
이 OMP 분획을 닭에 면역주사하여 난 황으로부터 IgY를 얻었다. OMP 분획을 Sephacryl S-400-HR 겔여과 크로마토그래 피로 4 분획으로 분리하여 SDS-PAGE로 분석하였다(Fig. 1의 C, D, E, F). 분자량이 40K-OMP(Fig.
Salmonella typhimurium KCTC 2421, Escherichia coli ATCC 43895, Shigella sonnei KCTC 2009, Enterobacter sakazaki KCTC 2949, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Citrobacter freundii KCTC 2006의 세균 추출물에 대한 IgY와 토끼IgG의 면역반응 특성을 조사하였다. 각 세균을 SDS-PAGE에 의해 전기영동하여 nitrocellulosee, blotting한 후 rnmunoblot하였다(Fig.
Salmonella typhimurium KCTC2421 으로부터 sodium lauroyl sarcosinate을 가하여 원심분리한 OMP 분획에는 분자량 이 40, 000, 35,000, 17, 000, 6, 000인 4종의 OMP(40K-OMP, 35K-OMP, 17K-OMP, 6K-OMP)를 함유하였다(Fig 1, B). 이 OMP 분획을 닭에 면역주사하여 난 황으로부터 IgY를 얻었다.
용출액을 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 분획을 채취하여 SDS-PAGE로 단백질의 분포를 조사하였다.
Salmonella typhimurium KCTC 2421, Escherichia coli ATCC 43895, Shigella sonnei KCTC 2009, Enterobacter sakazaki KCTC 2949, Klebsiella pneumoniae KCTC 2208, Citrobacter freundii KCTC 2006의 세균 추출물에 대한 IgY와 토끼IgG의 면역반응 특성을 조사하였다. 각 세균을 SDS-PAGE에 의해 전기영동하여 nitrocellulosee, blotting한 후 rnmunoblot하였다(Fig. 2). IgY는 Salmonella typhimurium KCTC 2421의 6K-OMP와 함께 고분자량의 단백질들에 강하게 반응하였다.
Salmonella를 검출하기 위한 전통적인 방법은 증식배양, 선택배양 및 생화학 검사를 이용하여 분리하고 동정되므로 3~5일이 소요되어 조기에 검출하여 식중독을 차단하는 것이 불가능하다. 반면에 증식배양 후에 면역학적 방법을 사용하여 Salmonella를 검출함으로서 하루 만에 검출이 가능하다. 그러나 면역학적 방법은 세균의 사멸 여부에 관계없이 세균항원을 검출하는 방법이기 때문에 세균 검출의 확정적 증 W 로서 인식되지 못하고 있다.
토끼 항체를 well에 흡착시키고 UHT 우유에 첨가된 Salmonella 7 균주를 비롯한 총 16개의 세균들의 반응을 측정하였다. IgY와 토끼 anti-IgY alkaline phosphatase conjugate 를 이용하여 결합한 세균을 검출하였다(Table 1).
대상 데이터
연구에서 사용한 KCTC 균주들과 ATCC 균주들은 각각 생명공학 연구원 유전자은행과 American Type Culture Col- lection에서 구입하였다(Table 1). 각 세균은 Tryptic soy agar 바 Tryptic soy broth에서 배양하였다.
각 세균은 Tryptic soy agar 바 Tryptic soy broth에서 배양하였다. 우유 내에 함유된 Salmonella를 검출하는 sandwich ELISA 실험에서 시중에서 구입한 UHT 우유를 사용하였다.
이론/모형
, 1998) 등을 사용하여 연구된 바 있다. Outer core lipopolysaccharide0]] 대한단가항체를 이용한 ELISA 방법을 이용하여 높은 특이성과 민감도로 Salmonella를 검출하였다<Ng et al., 1996). 본연구에서 보고한 Sgmla의 OMP 뿐만 아니라 다른 항원에 대해 특이적으로 반응하는 다가항체 또는 단가항체를 개발하기 위하여 추가적인 연구가 필요하다.
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis는 Laemmli(1970)의 방법에 따라 실시하였다. 분리된 단백질을 100V에서 2시간 전기 영동하여 nitrocellulose에 옮겼다.
Akta와 Nakai(1992)의 방법에 따라 난 황의 lipoprotein을 침전시켜 얻은 수용성분 획으로부터 IgY를 분리하였다. 토끼의 면역 단백질은 Johnstone과 Thorpe(1987)의 방법에 따라 sodium sulfate를 혈청에 가하여 면역단백질을 침전시켜 분리 하였다.
성능/효과
Anti-OMP 면역 단백질을 이용한 Sandwich ELISA를 이용하여 우유에 존재하는 Salmonellayphimurium을 검출할 수 있음을 알 수 있다. 그러나 Immunoblot assay에서 본 바와 같이 항체가 다른 세균에도 부분적으로 교차 반응을 함을 알 수 있었다.
Competitive ELISA와 sandwich ELISA가 Salmonella를 부분적으로 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. Competitive ELISA에서 시료 내 세균 수가 1” 이상일 때에 검출 가능하였으며 Sandwich ELISA에서 Salmonella ghi에는 민감도가 높으나 일부 Salmonella oemwis에 대해서 반응이 상대적으고 약하고 균주 간에 차이가 많았다.
IgY와 토끼 항체가 Salmonella?} 아닌 다른 세균에도 결합하는 것을 보아 40K-OMP와 6K-OMP는 그람음성 세균에 공통적으로 존재하는 것으로 보였다. Competitive ELISA와 sandwich ELISA가 Salmonella를 부분적으로 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다. Competitive ELISA에서 시료 내 세균 수가 1” 이상일 때에 검출 가능하였으며 Sandwich ELISA에서 Salmonella ghi에는 민감도가 높으나 일부 Salmonella oemwis에 대해서 반응이 상대적으고 약하고 균주 간에 차이가 많았다.
또한 OMP 분획과 40K-OMP를 항원으로 사용하여 각각 얻은 IgY와 토끼 항체에 Salmonella typhumu-의 다른 단백질들에 대한 항체도 상당히 존재함을 알 수었다. SDS-PAGE와 겔여과 크로마토그래피에서 OMP 분획에서 40KOMP가 주단백질인데도 immunoblot에서 IgY가 자량이 40K-OMP보다도 6K-0M에 더 강하게 반응하므 분자량이 6K-0M가 40K-OMP보다도 항원으로서의 활성이 상대적으로 더 강함을 알 수 있었다. 또한 토끼항체를 얻기 위하여 사용한 40K.
Microplate의 well의 표면에 흡착된 OMP 분획에 대해 Salmonella typhimurium KCTC 2421, Salmonella cholerasuis KCTC 2930, Escherichia coli KCTC 2441 및 Yersinia enterocolitica ATCC 23715의 균체가 IgY가 OMP 분획에 결합하는 것을 억제하는지 각각 1 mL 당 105, 106, 107, 108, "의 세균을 IgY와 함께 well에 가하였다. Salmonella typhimurium KCTC 2421와 Salmonella cholerasuis KCTC 2930은 세균수가 증가함에 따라 흡광도가 감소하였으나 Escherichia coli KCTC 2441와 Yersinia enterocoliticaATCC 23715은 세균수의 증가에 따라 흡광도의 변화가 없었다. 따라서 두 개의 Salmonella 균주가 IgY가 OMP 분획에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
반면에 분자량이 6K-OMP는 immuno blot에서 IgY와 토끼 항체를 결합하는 것을 보면 6K-0M의 항체 형 성 능력이 높은 것이 나타났다. IgY와 토끼 항체가 Salmonella?} 아닌 다른 세균에도 결합하는 것을 보아 40K-OMP와 6K-OMP는 그람음성 세균에 공통적으로 존재하는 것으로 보였다. Competitive ELISA와 sandwich ELISA가 Salmonella를 부분적으로 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
Salmonella typhimurium KCTC 2421와 Salmonella cholerasuis KCTC 2930은 세균수가 증가함에 따라 흡광도가 감소하였으나 Escherichia coli KCTC 2441와 Yersinia enterocoliticaATCC 23715은 세균수의 증가에 따라 흡광도의 변화가 없었다. 따라서 두 개의 Salmonella 균주가 IgY가 OMP 분획에 결합하는 것을 특이적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.Salmonella가 1 mL 당 10, 이상이 되어야 흡광도의 감소가 나타나 민감도가 낮았다.
따라서 IgY와 토끼 항체가 상대적으로 #에 대해 반응성이음을 알 수 있었으나 다른 그람음성 세균에도 상당히 반응학을 알 수 있었다. 또한 OMP 분획과 40K-OMP를 항원으로 사용하여 각각 얻은 IgY와 토끼 항체에 Salmonella typhumu-의 다른 단백질들에 대한 항체도 상당히 존재함을 알 수었다. SDS-PAGE와 겔여과 크로마토그래피에서 OMP 분획에서 40KOMP가 주단백질인데도 immunoblot에서 IgY가 자량이 40K-OMP보다도 6K-0M에 더 강하게 반응하므 분자량이 6K-0M가 40K-OMP보다도 항원으로서의 활성이 상대적으로 더 강함을 알 수 있었다.
후속연구
, 1996). 본연구에서 보고한 Sgmla의 OMP 뿐만 아니라 다른 항원에 대해 특이적으로 반응하는 다가항체 또는 단가항체를 개발하기 위하여 추가적인 연구가 필요하다.
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