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문제 정의
- 본 연구는 전통 장류의 발효 시 문제되는 독소 생산 B. cereus 균의 증식을 효율적으로 억제하는 균들을 분리하고 그 특성을 조사한 뒤, 장류 생산에 적용 함으로서 B. cereus가 없는 무독성 전통 장류를 생산하는 데 그 목표를 두었다.
- 항균 물질의 물리화학적 특성을 알기 위하여 온도에 의한 영향과 가수분해 효소의 반응성을 조사하였다. 배양액(pH 8.
- 항균 물질의 열 저항성과 protease 저항성이 B. licheniformis 가 생산하는 lichenysin이나 lichenicidin, 또는 B. subtilis의 surfactin의 물리화학적 특성과 유사하였으므로 SCK 121057균이 이들 합성 효소 유전자나 수식 효소 유전자들을 가지는지 확인하고자 PCR을 수행하였다. 양성 대조군으로 사용한 B.
가설 설정
- licheniformis SCD 112023 as a positive control. (B) B. licheniformis SCD 112028 as a negative control. (C) The strain SCK121057.
- cereus 균수 변화를 관찰하였다(Table 4). 두 균 사이의 비율 10의 값은 주 발효균인 SCK 121057가 삶은 콩에서 증식하는 동안 1/10 비율로 B. cereus가 오염된다는 가정이며 실제 오염 비율은 장류 제조 환경에 따라 달라질 수 있다. B.
제안 방법
- 16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 universal primer로서 518F (5′-CCAGCAGCCGCGGTAATA CG-3′)와 800R (5′-TACCAGGGTATCTAATCC-3′)을 이용, 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭 후, 동정에 중요한 50-900 bp 염기 서열을 포함하는 1,443 bp를 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 해독하였다.
- 37°C, 21시간 배양한 B. cereus JBE 0008 배양액 0.1 ml과 동일 조건에서 배양한 SCK 121057 배양액 0.9 ml을 섞어 미리 멸균한 삶은 콩에 접종하고 47°C, 50시간 배양하여 청국장을 제조하였다.
- Cereulide 합성 효소 유전자 cesA, cesB 및 설사독소들을 발현시키는 전사조절 유전자 plcR-papR 검출용 primer 서열들은 Table 1과 같고, PCR 조건으로 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C 1분간 변성, 58°C1분간 결합, 72°C 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72°C에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
- cereus 선택 배지[chromogenic polymyxin B-methoprim agar (CPMA)] 표면에 희석된 균액을 각각 200 μl씩 도포하고 30°C에서 24시간 배양 후, NA에서 자란 집락수에 비해 CPMA에서 자란 집락수의 비율이 매우 낮았던 12종의 장류를 선발하였다. NA에서 배양한 이 선발 장류의 집락들을 toothpick로 찍어 미리 만들어둔 NA와 CPMA 배지의 같은 위치에 각각 접종하여 24시간 후 CPMA에 자라지 않은 균들 만을 수집하였다. 수집한 균들을 대상으로 Yun 등의 방법(16)에 따라 B.
- Nutrient agar (NA)와 B. cereus 선택 배지[chromogenic polymyxin B-methoprim agar (CPMA)] 표면에 희석된 균액을 각각 200 μl씩 도포하고 30°C에서 24시간 배양 후, NA에서 자란 집락수에 비해 CPMA에서 자란 집락수의 비율이 매우 낮았던 12종의 장류를 선발하였다.
- 고정 탈수된 균을 membrane filter (0.22 μm, Millipore JG)에 옮기고 80°C에서 10시간 건조시킨 뒤 ion sputter로 20분간 금(Au)을 코팅시켜 주사전자현미경(Bio-LV SEM, Hitachi, Japan)에서 관찰하였다.
- 냉동 보관했던 원심분리 상층액을 녹여 paper disc 중앙에 20 μl를 분주하고 21시간 37°C로 배양 뒤 투명환 크기를 측정하여 8종의 B. cereus 모두에 대해 길항 능력을 가진 한 종(SCK 121057)을 분리하였다.
- 발효한 청국장을 상온(22-24°C)으로 옮겨 날짜 별로 일정량 콩을 꺼내 NB에 희석한 뒤, CPMA 표면에 희석액 100 μl를 도포하여 B. cereus 집락수를 측정하였다.
- 배양액(pH 8.6°C±0.2)을 37°C에서 3개월간 밀봉 저장한 후 항균 활성력은 밀봉 전과 동일하였다.
- 사용한 primer 서열들은 Table 1과 같고, PCR 조건은 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C 1분간 변성, 60°C 1분간 결합, 72°C 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72°C에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
- , USA)를 사용하여 해독하였다. 이 염기 서열은 NCBI database로부터 BLASTN program (17)과 Ribosomal Database Project 10.10 (RDP)의 Seqmatch program (version 3)을 사용하여 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 표준 균주와 함께 16S rRNA 유전자 서열과 높은 서열 일치도를 보인 균주들 중 게놈 프로젝트를 통해 균주 동정에 대한 신뢰성이 확인된 균주들도 함께 사용하였으며 염기 서열들 간의 상호 비교는 CLUSTAL W 프로그램(13)을 사용하였다.
- cereus 균수가 매우 낮다는 것을 발견했다. 이는 Bacillus 속들끼리 서로 길항적으로 작용하여 B. cereus에 대한 항균 능력이 있는 균의 우세 때문일 것으로 생각할 수 있기 때문에 이들 장류에서 B. cereus를 억제하는 발효균들의 분리를 시도 하였다.
- 이와 함께, 활발하게 증식한 B. cereus JBE0006 배양액 0.5 ml에 SCK121057 배양 원심 상층액 0.5 ml를 첨가하고 37°C에서 3시간과 6시간 후에 B. cereus의 운동성을 녹색 필터를 장착한 위상차 현미경에서 관찰했다.
- 전통 방법에 따라 제조한 150종의 된장 고추장, 청국장들을 구입 후 5 g을 취해 0.3 mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 희석하였다. Nutrient agar (NA)와 B.
- 표준 균주인 B. cereus KACC 11240과 본 실험실에서 분리한 B. cereus JBE 0001 (GenBank accession no. FJ 982655), JBE 0002 (FJ 982656), JBE 0004 (FJ 982654), JBE 0005 (FJ 982657), JBE 0006 (FJ 982658), JBE 0008 (FJ 982659), JBE 0011 (FJ 982661)을 NB에서 37°C, 21시간 배양 후 100μl를 각 NA 표면에 골고루 도말하고 배지 중앙에 4 mm paper disc (3 M filter paper)를 올려놓았다.
- 하지만 실제 장류 발효 과정 중에서도 B. cereus에 대한 증식 억제능이 있는지 확인하기 위하여 SCK 121057과 B. cereus JBE0008을 삶은 콩 g당 각각 2.2×105 CFU와 2.33×104 CFU(약 10:1)로 혼합 접종한 뒤 21-23°C의 조건에서 31일간 B. cereus 균수 변화를 관찰하였다(Table 4).
- Cereulide 합성 효소 유전자 cesA, cesB 및 설사독소들을 발현시키는 전사조절 유전자 plcR-papR 검출용 primer 서열들은 Table 1과 같고, PCR 조건으로 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C 1분간 변성, 58°C1분간 결합, 72°C 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72°C에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다. 항균물질 유전자 유무를 확인하기 위해 B. licheniformis의 lichenysin 합성 효소 유전자인 lchAA, lchAB, lchAC와 lantibiotic 수식 효소 유전자인 licM1, licM2, B. subtilis의 surfactin 합성효소 유전자 srfAA, srfAB, srfAC를 선택하여 PCR을 수행하였다. 사용한 primer 서열들은 Table 1과 같고, PCR 조건은 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C 1분간 변성, 60°C 1분간 결합, 72°C 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72°C에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
대상 데이터
- B. cereus, B. licheniformis, B. subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 배양은 Nutrient broth (NB) 배지, B. cereus 검출은 CPMA, Lactobacillus brevis와 Enterococcus faecalis 배양은 각각 Lactobacilli MRS broth와 Trypticase soy broth, Aspergillusflavus, A. fumigatus, A. ochraceus, A. parasiticus는 potato dextrose broth, Candida albicans는 yeast extract broth를 사용하였다. 사용한 균주들은 B.
- 9 ml을 섞어 미리 멸균한 삶은 콩에 접종하고 47°C, 50시간 배양하여 청국장을 제조하였다. 대조군은 B. cereus JBE 0008 배양액 0.1 ml 과 NB 0.9 ml을 넣고 같은 조건에서 청국장을 제조하였다. 발효한 청국장을 상온(22-24°C)으로 옮겨 날짜 별로 일정량 콩을 꺼내 NB에 희석한 뒤, CPMA 표면에 희석액 100 μl를 도포하여 B.
- parasiticus는 potato dextrose broth, Candida albicans는 yeast extract broth를 사용하였다. 사용한 균주들은 B. cereus JBE 및 B. licheniformis SCD strain들을 제외하고 표준 균주(type strain)이었으며 JBE 및 SCD strain들은 순창장류연구소가 수집하여 16S rRNA 유전자 서열 판독 후 계통도 분석과 46종류의 생화학적 검사에 의해 동정된 균주들이었다. 배양온도로 A.
- 장류 제조에 Bacillus cereus의 오염을 줄이기 위한 방법으로 전국 150 종 장류에서 분리한 무독소 Bacillus subtilis 및 Bacillus licheniformis 균들을 대상으로 B. cereus에 대해 억제 능력이 큰 한 균주 SCK 121057를 선발하였다. SCK 121057은 생화학 검사 및 16S rRNA 유전자 서열에 의한 계통도 분석 결과 B.
데이터처리
- 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method (8)와 maximum parsimony method를 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 Bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며 계통 분석과 bootstrap 분석은 PAUP (version 4.0b)을 사용하였다(11).
- 10 (RDP)의 Seqmatch program (version 3)을 사용하여 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 표준 균주와 함께 16S rRNA 유전자 서열과 높은 서열 일치도를 보인 균주들 중 게놈 프로젝트를 통해 균주 동정에 대한 신뢰성이 확인된 균주들도 함께 사용하였으며 염기 서열들 간의 상호 비교는 CLUSTAL W 프로그램(13)을 사용하였다. 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method (8)와 maximum parsimony method를 사용하여 작성하였다.
이론/모형
- SCK 121057균이 B. cereus의 설사 독소 유전자(nheABC, hblACD, cytK) 또는 구토 독소 합성 효소 유전자(cesA 및 cesB)를 갖는가를 확인하기 위하여 Yun 등의 방법(16)에 따라 multiplex PCR을 실시하였다. Cereulide 합성 효소 유전자 cesA, cesB 및 설사독소들을 발현시키는 전사조절 유전자 plcR-papR 검출용 primer 서열들은 Table 1과 같고, PCR 조건으로 94°C에서 2분간 초기 변성 후, 94°C 1분간 변성, 58°C1분간 결합, 72°C 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72°C에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.
- 계통도는 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 gap이 최소화되도록 보정한 후 Kimura’s two-parameter method (8)와 maximum parsimony method를 사용하여 작성하였다.
- 수집한 균들을 대상으로 Yun 등의 방법(16)에 따라 B. cereus 독소 유무 검사를 한 뒤, 선발한 균들을 Nutrient broth (NB)에 37°C, 78시간 배양하고 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액만을 모아 -20°C에 보관하였다.
성능/효과
- 10,000배로 확대한 주사전자현미경(SEM) 관찰 결과 균의 형태는 간균으로 0.7-0.8 μm × 2.2-4.0 μm의 크기를 보였으며 편모들을 가진 것이 확인되었다(Fig. 1B).
- 1B). 46종류의 생화학적 검사 결과를 Vitec 2 Compact Software에서 분석한 결과 91%의 확률로 B. licheniformis로 분류되었다(Table 2), 계통도 분석 결과 SCK 121057은 표준 균주인 B. licheniformis DSM 13과 가장 가까운 근연 관계로 16S rRNA 유전자 서열 상동성은 99.72% (1,439 bp/1,443 bp)였다(Fig. 2). 따라서 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 SCK 121057을 B.
- B. cereus만 접종한 대조군은 배양 시간이 증가함에 따라 꾸준히 증가하여 한달 후 5.1×106 CFU/g까지 증가한 반면, SCK 121057균과 혼합 접종한 경우 B. cereus 균수는 1.3×102 CFU/g에 머물러 장류 제조에 실제 적용 가능함을 보였다.
- cereus의 세포막을 손상시켜 ghost cell을 형성하였다. SCK 121057 균과 B. cereus를 혼합 접종한 청국장 적용 실험 결과 B. cereus 균수는 대조군에 비해 극적으로 감소되었다.
- cereus에 대해 억제 능력이 큰 한 균주 SCK 121057를 선발하였다. SCK 121057은 생화학 검사 및 16S rRNA 유전자 서열에 의한 계통도 분석 결과 B. licheniformis로 동정되었고 12 종의 B. cereus 이외에 중요 병원성 균인 Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. parasiticus 등의 증식을 억제하였다. SCK 121057이 생산하는 항균 물질은 고압멸균 조건에서 열 안정성, proteinase K에 대한 가수 분해 저항성, 37°C에서 장기 저장성을 지닌 구조적으로 매우 안정한 물질이었고, 전자 현미경 관찰에서 이 물질은 B.
- 3은 SCK 121057균을 NB배지에서 37°C로 배양했을 때 배양 시간에 따른 성장 곡선과 항균 물질의 생성을 나타낸 것이다. 균 증식은 배양 후 18시간에 최대에 도달하였지만 항균 물질 생성은 48시간 이후부터 급격히 증가하여 90-100시간 이후부터는 일정한 활성을 보였다. 미생물 증식 과정 중 사멸기에 이르러 항균 물질 방출이 시작된 점과, B.
- 균을 1,500× 배율의 광학 현미경으로 관찰하였을 때 움직임이 매우 활발하였고 그람 염색에서 양성을 나타냈다.
- subtilis들에 대해서는 모두 증식이 억제되었다. 따라서 SCK 121057균을 장류 주 발효균으로 사용할 경우 B. subtilis들은 증식 저해 때문에 발효 과정에 효과적으로 관여 못할 것으로 예상되었다. 이 항균 물질은 또한 효모인 Candida albicans를 제외하고 곰팡이들에 대해 항진균 특성을 나타냈는데, ochratoxin A 생산균인 A.
- 따라서 SCK 121057균의 장류 적용 시험에서는 KFDA의 B. cereus 허용 기준(1×104 CFU/g sample) 을 충족시켰다.
- 2). 따라서 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 SCK 121057을 B. licheniformis로 동정하였다.
- 5C). 또한 SCK 121057은 B. cereus의 구토 독소 합성 효소 유전자 cesA, cesB 와 설사독소 전사조절 유전자인 plcR 및 papR도 함유하지 않아 B. cereus 장독소들 역시 생산하지 않음을 알 수 있었다(결과 미제시). SCK 121057의 항균 물질은 앞으로 구조 분석이 필요하지만 저장 보존성과 매우 높은 열 안정성, 비특이적protease에 의해 분해되지 않는 것으로 볼 때 일반 단백질의 성분이 아닌 D-형 아미노산이 포함되거나 cyclic form으로 된 peptide 계열 물질, 또는 저분자의 비 단백질 계통의 화학 물질로 추정되었다.
- 전통 장류 발효 시 mycotoxins의 생성은 위생상 중요한 문제이고 이들 독소들은 간암이나 신장 독성을 유발할 수 있기 때문에 항진균 효과를 가진 이 균의 사용은 숙성과정에서 위생 발효를 위해 가치가 있을 것으로 예상된다. 또한 이 항균 물질은 병원성 세균으로서 S. aureus, E. coli, M. luteus에 대한 저해 능력(투명환 직경 10-12 mm)이 있었고 특히 식중독과 염증 반응에 중요한 병원성 균인 S. aureus는 5균주 모두 증식이 확실히 억제되었다. 앞으로 식품 이외 의료나 위생분야에서 사용 가능성을 위해 methicillin 저항 균주(MRSA)를 포함하는 S.
- licheniformis의 lichenysin, lichenicidine 등은 이와 같은 펩타이드계 저분자 물질로서 항세균 또는 항진균 특성을 나타낸다(1, 2, 6, 12, 14, 15). 우리는 전통 장류에서 B. cereus 계수 모니터링 동안 일부 제품에서 B. cereus 균수가 매우 낮다는 것을 발견했다. 이는 Bacillus 속들끼리 서로 길항적으로 작용하여 B.
- subtilis들은 증식 저해 때문에 발효 과정에 효과적으로 관여 못할 것으로 예상되었다. 이 항균 물질은 또한 효모인 Candida albicans를 제외하고 곰팡이들에 대해 항진균 특성을 나타냈는데, ochratoxin A 생산균인 A. ochraceus와 aflatoxin B, G, M을 생산하는 A. flavus 및 A. parasiticus 균들에 대해 효과적(투명환 직경 9-17 mm) 이었다. 전통 장류 발효 시 mycotoxins의 생성은 위생상 중요한 문제이고 이들 독소들은 간암이나 신장 독성을 유발할 수 있기 때문에 항진균 효과를 가진 이 균의 사용은 숙성과정에서 위생 발효를 위해 가치가 있을 것으로 예상된다.
- cereus 저해균의 사용은, HACCP 시스템의 도입이 어려운 장류 업체에서 오염 문제를 해결할 수 있는 효과적 대안으로 여겨진다. 장류 주요 발효 균주들인 B. subtilis와 B. licheniformis 각 6종을 대상으로 저해 효과를 확인한 결과 B. licheniformis 에 대해서는 전혀 증식 저해를 보이지 않았으나 B. subtilis들에 대해서는 모두 증식이 억제되었다. 따라서 SCK 121057균을 장류 주 발효균으로 사용할 경우 B.
- cereus의 운동성을 녹색 필터를 장착한 위상차 현미경에서 관찰했다. 첨가 직전 B. cereus 균들은 매우 활발한 운동성을 보였으나 첨가 3시간 후 움직임은 현저히 감소했고, 6시간 후에는 거의 정지 되었다(결과 미제시).
- 표준 균주들과 전통 장류에서 분리한 B. cereus 12종을 대상으로 한 증식 억제 효과에서, 저해 정도에 차이는 있었으나 12종 모두 SCK 121057의 항균 물질에 의해 저해를 받았다. 이러한 점을 고려할 때 장류 발효 균으로 SCK 121057과 같은 B.
- 항균력을 나타내는 투명환의 직경은 27°C에서 82시간 배양시 5.5 mm, 37°C에서 8 mm, 47°C에서 4 mm로서 37°C의 배양 조건이 항균 물질 생산에 적합한 온도였다.
- 형성된 집락은 NA 배양액에 희석 후 46종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 BCL ID card (bioMérieux Vitek Inc., USA)에 주입하였고, 15분 간격으로 결과들이 VITEK 2 Compact software (bioMérieux Vitek) 에 통합적으로 저장 분석되면서 14시간 후 동정이 완료되었다.
후속연구
- 산업적인 장류 제조 관점에서 항균 물질을 생산하는 발효 균의 채용은, 항균 물질에 의한 인체 독성 문제를 고려해야 함과 동시에 발효과정 중 병원성 균 증식을 억제 함으로서 병원성 독소 생산을 감소시킬 수 있는 양면적인 특성을 가진다고 할 수 있다. 따라서 SCK 121057균을 장류에 사용하기 위해항균성 물질들의 구조 규명과 장류 섭취에 대한 인체 안전성 평가가 선행되어야 할 것이고, 이를 위해 이 균으로 제조한 장류 제품을 동물에서 독성 검사를 통해 안전성을 검증 받을 필요가 있다.
- aureus는 5균주 모두 증식이 확실히 억제되었다. 앞으로 식품 이외 의료나 위생분야에서 사용 가능성을 위해 methicillin 저항 균주(MRSA)를 포함하는 S. aureus균들에 대해 이 물질의 항균력을 광범위하게 조사할 필요가 있다.
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