상업적 가치가 높고 양식 가능성이 있는 백합과 5종을 대상으로 RAPD방법을 이용한 개체간의 유전적 유연관계를 조사하였다. DNA 추출은 protein K-phenol방법을 사용하여 각 종의 후폐각근에서 추출하였다. RAPD-PCR결과 15개의 primer들이 증폭되었고, 그들로부터 각각 1-3개의 band를 볼 수 있었다. 백합과 5종간 유전적 유사도는 살조개와 바지락간에는 0.84, 개조개와 백합간에는 0.87로 각각의 두 종간에는 놓은 유사도를 보였고, 가무락조개는 살조개와 바지락간에 0.78의 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개간에는 0.46의 비교적 낮은 유전적 유사도를 보였다. RAPD 방법으로 종내개체 유전변이를 파악하기는 힘들어도, 양식이나 자원증식을 위한 패류의 우수형질 선택에 있어 기본 정보를 제공 할 수는 있을 것이다. 또한, 살조개 대량종묘생산의 방법은 유전적 유사도가 가장 가까운 바지락을 중심으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
상업적 가치가 높고 양식 가능성이 있는 백합과 5종을 대상으로 RAPD방법을 이용한 개체간의 유전적 유연관계를 조사하였다. DNA 추출은 protein K-phenol방법을 사용하여 각 종의 후폐각근에서 추출하였다. RAPD-PCR결과 15개의 primer들이 증폭되었고, 그들로부터 각각 1-3개의 band를 볼 수 있었다. 백합과 5종간 유전적 유사도는 살조개와 바지락간에는 0.84, 개조개와 백합간에는 0.87로 각각의 두 종간에는 놓은 유사도를 보였고, 가무락조개는 살조개와 바지락간에 0.78의 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개간에는 0.46의 비교적 낮은 유전적 유사도를 보였다. RAPD 방법으로 종내개체 유전변이를 파악하기는 힘들어도, 양식이나 자원증식을 위한 패류의 우수형질 선택에 있어 기본 정보를 제공 할 수는 있을 것이다. 또한, 살조개 대량종묘생산의 방법은 유전적 유사도가 가장 가까운 바지락을 중심으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
The random amplified polymorphic DNAs (RAPD) technique was used to characterize the genetic relationship of five species from in the family of Veneridae which is one of the commercially important clam family in Korea. The veneride clams' DNA were extracted from adductor muscular by the proteinase K-...
The random amplified polymorphic DNAs (RAPD) technique was used to characterize the genetic relationship of five species from in the family of Veneridae which is one of the commercially important clam family in Korea. The veneride clams' DNA were extracted from adductor muscular by the proteinase K-phenol method. Among 20 primers, 15 unit primers were amplified and produced at least, 2 or 3 from the top band. Genetic similarity between the purplish washington, Saxidomus purpuratus and the hard clam, Meretrix lusoria was the highest (0.87); the lowest genetic similarity (0.46) was formed between the little clam, Ruditapes philppinarum and the purplish washington, S. purpuratus. The genetic relationship between the venus clam, Protothaca jedoensis and the little clam, R. philppinarum was a closer than those between others. These results may indicate that the method of artificial seeding production of P. jedoensis for the propagation of resources can be focused on R. philppinarum.
The random amplified polymorphic DNAs (RAPD) technique was used to characterize the genetic relationship of five species from in the family of Veneridae which is one of the commercially important clam family in Korea. The veneride clams' DNA were extracted from adductor muscular by the proteinase K-phenol method. Among 20 primers, 15 unit primers were amplified and produced at least, 2 or 3 from the top band. Genetic similarity between the purplish washington, Saxidomus purpuratus and the hard clam, Meretrix lusoria was the highest (0.87); the lowest genetic similarity (0.46) was formed between the little clam, Ruditapes philppinarum and the purplish washington, S. purpuratus. The genetic relationship between the venus clam, Protothaca jedoensis and the little clam, R. philppinarum was a closer than those between others. These results may indicate that the method of artificial seeding production of P. jedoensis for the propagation of resources can be focused on R. philppinarum.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 패류양식의 활성화를 위해 새로운 양식대상종으로 개발 가능성이 높은 백합과 5종(백합, Meretrix lusoria, 바지 락, Ruditapes philippinarum, 가무락조개 , Cyclina sinensis, 개조기], Saxidomus purpuratus, 살조개, Protothaca jedoensis)의 유전학적 집단구조분석을 위한 기초자료를 얻기 위하여 RAPD-PCR방법을 이용, RAPD 밴드 패턴 비교에 의한 백합과 5종간의 종간 유전적 유연관계를 밝혀보고자 한다.
제안 방법
20 μl의 PCR반응액은 Premix-Top (Bioneer)을 사용하여 1 μl의 template DNA (3 ng/|il), 1 μl의 primer (5 pM/ |il)와 3차 멸균증류수 18 )11 첨가하여 구성하였으며 GeneAmp PCR System 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems)을 사용하여 94℃에서 5분간 1 회 변성한 후, 94℃에서 30초간 변성, 34℃에서 1분간 결합, 72℃에서 1분간 신장을 40회 실시하고 나서 , 최종 72℃에서 5분간 신장하였다.
20가지로된 10-mer arbitrary primer Kits A (Operon Technologies Inc., California)중에서 A1-A20의 primer를 이용하여 PCR반응을 하였다(Table 3).
, 2000). DNA 정 량 및 순도는 OD260/OD280을 이용하여 측정하였다.
각 종별 샘플을 폐각근 조직에서 추출된 DNA (Table 2)를 20 ng/gl 농도로 조절한 후 10개의 염기로 구성된 arbitrary primer 20 종류를 단일로 사용하여 PCR반응을 시켰다. 실험결과 primer OPA-03, 09, 10, 17, 20을 제외한 15개의 단일 primer에서 증폭이 일어났고, primer의 종류에 따라 개체별 최소 1에서 최대 3의 band가 생성되었다(Table 3).
상업적 가치가 높고 양식 가능성이 있는 백합과 5종을 대상으로 RAPD방법을 이용한 개체간의 유전적 유연관계를 조사하였다. DNA 추출은 proteinase K-phenol방법을 사용하여 각 종의 후폐각근에서 추출하였다.
1). 시료 채취 후 ice box에 넣어 실험실로 운반한 다음 각장, 각고, 각폭, 육중량을 측정하고 탈각 후 이물질을 제거한 후, 육질부와 내장부를 분리하고 육질부에서도 폐각근 부분을 분석시료로 사용하였다(Table 1).
형광물질(Ethidium bromide)로 염색한 PCR 증폭산물은 1% agarose gel에서 30분간 전기 영동한 후(100V), UV transilluminator 위에서 육안으로 밴드를 확인 후 디지탈카메라로 촬영하였다.
대상 데이터
살조개는 전남 고흥군 봉래면, 바지락과 백합은 전남 강진군 도암면, 개조개는 전남 여수시 가막만, 가무락조개는 여수시 율촌면에서 채집하였다(Fig. 1). 시료 채취 후 ice box에 넣어 실험실로 운반한 다음 각장, 각고, 각폭, 육중량을 측정하고 탈각 후 이물질을 제거한 후, 육질부와 내장부를 분리하고 육질부에서도 폐각근 부분을 분석시료로 사용하였다(Table 1).
이론/모형
DNA 추출은 proteinase K-phenol방법을 사용하여 각 종의 후폐각근에서 추출하였다. RAPD-PCR결과 15개의 primer들이 증폭되었고, 그들로부터 각각 1-3개의 band를 볼 수 있었다.
이 유사도 값을 이용해 개체간 유사관계가 완전히 일치하는 경우를 1로, 불일치하는 경우를 0으로 하여 유전적 유사 정도를 표시하였다(Nei, 1987; Magurram, 1988). 종간 계통유연관계는 비가중산술결합법 (UPGMA)을 이용하여 분석하였다.
성능/효과
Proteinase K-phenol추출법에 따라 추출된 DNA의 agarose gel 전기영동 결과 모든 시료에서 DNA의 분자량이 23 kb보다 높게 나타났으며, 다량의 RNA도 함께 추출되었다(Fig. 2). 폐각근의 근육조직에서 추출된 각 종별 DNA 검출량은 살조개 6.
유전적 유사도를 보였다. 가무락조개는 살조개와 바지락간에 비교적 높은 유전적 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개간에는 아주 낮은 유전적 유사도를 보였다(Fig. 5). 또한 Kim et al.
결론적으로 백합과 5종의 RAPD-PCR 방법은 Chee et al. (2001)이 가리비류에서의 제안처럼 한국 연안에 서식하는 백합과 5종에 대한 유전적 특이성을 구명하고, 우리나라 연안의 백합과 5종에 대한 종 보존의 측면에서 매우 유용한 표지인자가 될 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 또한, 이러한 분자유전 표지의 확보는 모패 계통의 성장률 차이나 사망률과 같은 특성의 차이를 구명하여 양식품종으로 기대되는 백합과 5종 양식산업에서 성장에 강한 우수형질의 선발과 백합과 5종의 품종 개발에 필요한 자료가 될 수 있을 것이다.
87로 각각의 두종간에는 높은 유사도를 보여 종별 유전적 유사도가 높게 나타났다. 그러나 가무락조개, C. sinensis^ 살조개와 바지락간에 0.78의 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개 간에는 0.46의 비교적 낮은 유사도를 보였다(Fig. 5).
7 μg/g으로 추출되 어 바지 락에서 가장 많은 DNA가 추출되었다. 그리고 OD20OD280측정 결과 살조개 1.76, 바지락 1.55, 백합 1.64, 개조개 1.74, 가무락조개 L63으로 살조개가 가장 단백질 오염이 적게 나타났으며, 대부분의 종에서 단백질의 혼입이 적게 나타났다(Table 2). 주형 DNA 농도별 PCR 생성물을 확인한 결과 주형 DNA의 농도는 20 ng/)11 농도가 PCR 생성물을 일정하게 생성하였으므로 가장 이상적인 농도를 결정하였다.
RAPD-PCR결과 15개의 primer들이 증폭되었고, 그들로부터 각각 1-3개의 band를 볼 수 있었다. 백합과 5종간 유전적 유사도는 살조개 와 바지락간에는 0.84, 개조개와 백합간에는 0.87로 각각의 두 종간에는 높은 유사도를 보였고, 가무락조개는 살조개와 바지락간에 0.78의 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개간에는 0.46의 비교적 낮은 유전적 유사도를 보였다. RAPD 방법으로 종내개체 유전변이를 파악하기는 힘들어도, 양식이나 자원증식을 위한 패류의 우수형질 선택에 있어 기본 정보를 제공 할 수는 있을 것이다.
백합과 5종에 관하여 유전적 유사도를 분석한 결과 살조개, P. jedoensis와 바지락, R. philppinarum간에는 0.84, 개조개, S. purpurmus와 백합, M. lusoria 간에는 0.87로 각각의 두종간에는 높은 유사도를 보여 종별 유전적 유사도가 높게 나타났다. 그러나 가무락조개, C.
본 연구결과에서는 백합과 5종에 관하여 유전적 유사도를 분석하여 살조개와 바지락간 그리고 개조개와 백합간에는 아주 높은 유전적 유사도를 보였다. 가무락조개는 살조개와 바지락간에 비교적 높은 유전적 유사도를 보였으며, 개조개와 백합, 살조개, 바지락, 가무락조개간에는 아주 낮은 유전적 유사도를 보였다(Fig.
, 1997), Sundberg and Andersson (1995)은 Oerstedia dorsalis (Nemertea) 종내 외부형태의 차이에 대한 유전적 차이점을 찾아내지 못하여 RAPD-PCR방법 이 종내변이 (intraspecific variation)를 분석하는데는 효율적이지 못함을 밝혔다. 본 연구에서 또한 백합과 5종 내의 종내변이를 분석하는 데는 미약한 부분을 보였다. 현재 국내에서는 이매패류에 있어서 이러한 RAPD 연구결과들이 부족한 싱태이며 , Yoon et al.
실험결과 primer OPA-03, 09, 10, 17, 20을 제외한 15개의 단일 primer에서 증폭이 일어났고, primer의 종류에 따라 개체별 최소 1에서 최대 3의 band가 생성되었다(Table 3). PCR 반응 생성물은 primer의 종류에 따라 유사한 패턴 및 특이적인 1개의 패턴, 또는 다양한 패턴을 나타내었다(Fig.
74, 가무락조개 L63으로 살조개가 가장 단백질 오염이 적게 나타났으며, 대부분의 종에서 단백질의 혼입이 적게 나타났다(Table 2). 주형 DNA 농도별 PCR 생성물을 확인한 결과 주형 DNA의 농도는 20 ng/)11 농도가 PCR 생성물을 일정하게 생성하였으므로 가장 이상적인 농도를 결정하였다.
2). 폐각근의 근육조직에서 추출된 각 종별 DNA 검출량은 살조개 6.4 μg/g, 바지락 7.2 |ig/g, 백합 5.7 μg/g, 개조개 6.2 μg/g, 가무락조개 6.7 μg/g으로 추출되 어 바지 락에서 가장 많은 DNA가 추출되었다. 그리고 OD20OD280측정 결과 살조개 1.
후속연구
(1994)는 sea scallop의 유전적 구조를 이해하는데 이 방법을 사용하였는데 , 집단조사에서 RAPD 유전자 좌위에 있는 positive와 negative allele (대립유전자)에 대한 빈도는 Hardy-Weinberg식에 따라 계산되어 질 수 있기 때문에 sea scallop 집단의 유전적 구조를 이해하는 부가적인 수단으로 사용 가능함을 제시하였다. 그러나, 본 실험에서는 유전자 좌위에 있는 대립유전자에 대한 빈도를 구하지는 않았으나, 살조개를 비롯한 백합과 5종에 대한 집단 유전적 구조를 더욱 명확하게 이해하기 위해서는 차후 보강되어져야할 부분으로 사료된다. Lee et al.
이처럼 살조개와 바지락의 형태적 및 유전적 유사도가 높게 나오는 것은 그들의 계통유연 관계가 다른 종에 비해 매우 밀접함을 의미한다. 그러므로 살조개의 자원증식을 위한 인공종묘생산을 시도하고자 한다면 근연관계가 가장 가까운 바지락을 중심으로 한 활용방안을 모색해 보아야 할 것으로 사료된다. 그럼에도 불구하고 바지락과 살조개가 유사한 서식환경에서 혼성할 수 있는 것은 그들의 생태적 차이에 기 인할 수 있다.
(2001)에 의해 제안된 것처럼 광범위한 DNA 분석이 가능하므로 종간의 유전적 유사성을 간단히 비교할 수 있는 장점이 있으나, 분자 진화과정에 대한 정보는 제공하지 못하는 단점을 가지고 있다. 따라서 이러한 단점은 MtCOI, 18S rDNA 그리고 microsatellite 같은 DNA 염기서열 분석방법과 병행 사용함으로서 RAPD PCR에서 단점으로 지적되어온 분자 진화 과정의 시간 반영을 더욱 명확하게 보여줄 수 있을 것이라 생각된다.
RAPD 방법으로 종내개체 유전변이를 파악하기는 힘들어도, 양식이나 자원증식을 위한 패류의 우수형질 선택에 있어 기본 정보를 제공 할 수는 있을 것이다. 또한, 살조개 대량종묘생산의 방법은 유전적 유사도가 가장 가까운 바지락을 중심으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
(2001)이 가리비류에서의 제안처럼 한국 연안에 서식하는 백합과 5종에 대한 유전적 특이성을 구명하고, 우리나라 연안의 백합과 5종에 대한 종 보존의 측면에서 매우 유용한 표지인자가 될 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 또한, 이러한 분자유전 표지의 확보는 모패 계통의 성장률 차이나 사망률과 같은 특성의 차이를 구명하여 양식품종으로 기대되는 백합과 5종 양식산업에서 성장에 강한 우수형질의 선발과 백합과 5종의 품종 개발에 필요한 자료가 될 수 있을 것이다.
staminea의 개체군은 지역간 유전적 구별이 명확하다고 보고하였다. 이러한 사실은 백합과 5종 지역간의 패각의 크기 및 분포지역이 다양하게 나타남을 고려할 때, 보다 정확한 종의 동정을 위해서는 지역개체군간의 유전적 차이점을 조사해 보아야 될 것으로 사료된다.
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