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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 토양에 존재하는 휴믹물질의 특성자료에 대한 데이터베이스 구축을 위한 연구의 일환으로서 제주 지역의 토양에서 추출한 풀빅산의 분자량 분포특성 및 형광특성을 분석하였다. 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 풀빅산의 분자량 분포를 확인할 수 있었고, 형광분석을 통하여 분자량 영역별 풀빅산의 excitation, emission, synchronous 형광특성을 밝힐 수 있었다.
- 본 연구의 목적은 겔 여과 크로마토그래피 (GFC: Gel Filtration Chromatography)를 이용하여 토양 풀빅산의 분자량분포 특성을 분석하고, 풀빅산을 3개의 분자량 영역으로 분리하여 분자량 영역별 풀빅산의 excitation, emission, synchronous 형광특성을 분석하는 것이다. 본 연구에서 얻어진 결과는 국내 토양에 존재하는 휴믹 물질의 특성자료에 대한 데이터베이스 구축에 사용된다.
제안 방법
- 처음 틈새부피에 해당하는 부피는 버리고 100 mL간격으로 3회에 걸쳐서 시료 용액을 분리하였다.11 풀빅산의 총유기탄소 (Total Organic Carbon Contents) 함량은 TOC 분석기 (Model 5000A, SHIMADZU)를 사용하여 측정하였다.
- 폴리에틸렌 글리콜은 pH 및 이온강도의 변화에 의해 분자 크기의 변화가 작기 때문에 겔 여과 크로마토그래피의 컬럼 보정용으로 많이 사용된다.14 덱스트란 블루 (Mw = 2,000,000 Dalton)는 분자크기가 Sephadex G-50 fine 겔의 내부 구멍 (pore)보다 크기 때문에 틈새부피 (V0)을 측정하는 데 사용하였으며, 아세톤은 분자크기가 작아 겔 내부의 모든 구멍 속으로 침투할 수 있으므로 total permeation volume (Vt)을 측정하는데 사용하였다. 아세톤과 덱스트란 블루 분자크기의 사이에 있는 폴리에틸렌 글리콜은 표준검량선을 작성하는 데 사용하였다.
- Excitation 형광 스펙트럼은 방출 단색화 장치(emission monochromator)를 550 nm에 고정시키고, 들뜨기 단색화 장치 (excitation monochromator)의 파장을 250～500 nm로 변화시키면서 측정하였다. Emission 형광스펙트럼은 들뜨기 단색화 장치의 파장을 357 nm로 고정시켜 풀빅산을 여기 시킨 후 방출 단색화 장치의 파장을 370～600 nm변화시키면서 측정하였다. Synchronous 형광 스펙트럼은 두 단색화 장치 사이의 파장차이 (Δλ)를 30 nm로 설정한 후 290～600nm의 파장영역에서 측정하였다.
- 형광분석은 Luminescence Spectrometer(Aminco-Bowman Series 2)를 사용하여, excitation mode와 emission mode 그리고 synchronous mode에서 측정하였다. Excitation 형광 스펙트럼은 방출 단색화 장치(emission monochromator)를 550 nm에 고정시키고, 들뜨기 단색화 장치 (excitation monochromator)의 파장을 250～500 nm로 변화시키면서 측정하였다. Emission 형광스펙트럼은 들뜨기 단색화 장치의 파장을 357 nm로 고정시켜 풀빅산을 여기 시킨 후 방출 단색화 장치의 파장을 370～600 nm변화시키면서 측정하였다.
- Emission 형광스펙트럼은 들뜨기 단색화 장치의 파장을 357 nm로 고정시켜 풀빅산을 여기 시킨 후 방출 단색화 장치의 파장을 370～600 nm변화시키면서 측정하였다. Synchronous 형광 스펙트럼은 두 단색화 장치 사이의 파장차이 (Δλ)를 30 nm로 설정한 후 290～600nm의 파장영역에서 측정하였다. 스펙트럼 측정시 들뜨기 단색화 장치의 슬릿 폭은 2 nm, 방출 단색화 장치의 슬릿 폭은 4 nm로 조정하였다.
- 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 3개의 분자량 영역으로 분리된 풀빅산의 형광 측정은 총유기 탄소농도(TOC) 기준으로 16 mg C/L (I=0.1 M NaClO4, pH=5)로 희석한 후, 이 용액 2～3 mL를 형광측정용 석영셀에 담아 실시하였다. 용액의 pH는 NaOH와 HClO4를 사용하여 5.
-
5. 풀빅산의 분자량 분리
분자량 분리는 풀빅산 농도 5 mg/mL (I=0.1 M NaClO4, pH=6)의 시료 용액을 앞서 보정된 컬럼에 적용하여 표준 분자량 분포 측정에서와 동일한 과정으로 수행하였다
. 즉, 풀빅산 시료용액 4. - 분자량과 용리부피 사이의 관계는 아세톤 (acetone: 58 Da), 덱스트란 블루 (Dextrane Blue: 2,000,000Da), 포리에틸렌 글리콜 (PEG: Polyethylene glycol) PEG 400 (400Da), PEG 1000 (1,000Da), PEG 4600 (4,600Da)을 사용하여 표준 분자들의 GFC-elution profile을 작성하여 결정하였다. 표준 분자량 분포의 측정과정은 다음과 같다: (i) 용리액인 0.
- 풀빅산의 분자량 분리에 사용된 겔 여과 크로마토그래피 시스템은 Peristaltic 펌프, 시료 주입기, 분자량 분리칼럼, UV 모니터 (Waters 486), 아날로그-디지탈 변환기, 컴퓨터 등으로 구성하였다. 분자량 분리 컬럼은 Pharmacia C26 컬럼 (I.
- 1로 조정하였다. 형광분석은 Luminescence Spectrometer(Aminco-Bowman Series 2)를 사용하여, excitation mode와 emission mode 그리고 synchronous mode에서 측정하였다. Excitation 형광 스펙트럼은 방출 단색화 장치(emission monochromator)를 550 nm에 고정시키고, 들뜨기 단색화 장치 (excitation monochromator)의 파장을 250～500 nm로 변화시키면서 측정하였다.
대상 데이터
- 16 들뜸 형광 스펙트럼은 357 nm에서 가장 강한 형광세기를 나타냈다. 그러므로 방출 스펙트럼 측정 시 풀빅산의 여기파장으로 357 nm를 사용하였다. Table 1에 정리된 357 nm에서 excitation 형광세기는 FA3 > FA0 > FA2 > FA1 순이었으나, 468 nm (π-결합으로 연결된 방향족 화합물의 fluorescent)에서는 FA0> FA3 > FA2 > FA1 순으로 FA3의 형광세기가 비 분리 풀빅산인 FA0 (풀빅산 원액 5 mg/mL의 50배 희석액)보다 낮았다.
- 본 실험에 사용한 풀빅산은 한라산의 표층토 (0～10㎝)로부터 추출되었다. 시료채취 지점에 대한 정확한 정보는 문헌에 보고되어 있다.
- 풀빅산의 분자량 분리에 사용된 겔 여과 크로마토그래피 시스템은 Peristaltic 펌프, 시료 주입기, 분자량 분리칼럼, UV 모니터 (Waters 486), 아날로그-디지탈 변환기, 컴퓨터 등으로 구성하였다. 분자량 분리 컬럼은 Pharmacia C26 컬럼 (I.D.×L = 2.6×100 ㎝)을 사용하였으며, 전처리 된 겔 (Sephadex G-50 fine)을 컬럼에 86 ㎝까지 채워 충전 부피가 457 mL가 되도록 하였다.
성능/효과
- (1) GFC 분자량 분리시스템 교정 결과, 분자량 분리시스템의 void volume은 130 mL이고, total permeation volume은 404 mL을 나타냈다. 용리부피 (Ve)와 표준분자의 분자량(log Mw) 사이에는, log Mw = 4.
- (2) 풀빅산의 분자량 분리 결과, 풀빅산은 190～8,900 Da의 분자량 분포를 보였으며 피크점에서의 분자량(MWp)은 930 Da이었다. 틈새부피 용리후 100 mL씩 수집하여 3개 영역으로 분자량을 분리한 결과, FA1은 2,200 Da～8,900 Da, FA2는 540 Da～2,200 Da, FA3은 190 Da～540 Da의 분자량 분포 나타냈다.
- (3) 방출 형광분석 결과, 풀빅산의 방출 형광스펙트럼은 345～365 nm와 380～395 nm에서 다소 넓은 특성 피크를 보였으며, 450 nm, 463 nm, 468 nm에서 특성적인 형광 피크를 나타냈다. 상대적인 excitation 형광피크세기는 I345～365nm > I380～395nm > I450～468nm 순서를 나타냈다.
- (4) 방출 형광분석 결과, 방출 스펙트럼은 특성피크를 나타내지 않았으며 450 nm에서 피크점을 보이며 전체적으로 넓은 스펙트럼을 나타냈다. 분자량 분리를 하지 않은 풀빅산 (FA0)의 상대 형광세기가 1.
- (5) Synchronous 형광분석 결과, 분자량 분포별 풀빅산의 synchronous 형광스펙트럼은 390 nm와 400～460 nm 및 498 nm에서 특성적인 세 개의 피크를 나타냈다. 분자량별 구조 차이를 나타내는 형광피크의 상대비 (I498nm/I390nm)는 분자량이 클수록 증가하였다.
- 본 연구에서는 국내 토양에 존재하는 휴믹물질의 특성자료에 대한 데이터베이스 구축을 위한 연구의 일환으로서 제주 지역의 토양에서 추출한 풀빅산의 분자량 분포특성 및 형광특성을 분석하였다. 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 풀빅산의 분자량 분포를 확인할 수 있었고, 형광분석을 통하여 분자량 영역별 풀빅산의 excitation, emission, synchronous 형광특성을 밝힐 수 있었다. 이상에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 덱스트란 블루와 아세톤은 비교적 반나비 (half width)가 매우 작은 크로마토그램을 보여주었으나, PEG 표준분자들은 반나비가 상대적으로 넓은 크로마토그램을 나타냈다. 또한, PEG-1000의 경우 부가 피크가 크로마토그램에 나타났다.
- 5는 그룹 I～III의 풀빅산에 대한 방출 스펙트럼을 보여준다. 방출 스펙트럼은 특성피크를 나타내지 않았으며, 450 nm에서 피크점을 보이며 전체적으로 넓은 스펙트럼을 나타냈다. 이는 전형적인 토양 풀빅산의 방출 형광스펙트럼의 피크영역인 435～465 nm에 해당한다.
- 제주 한라산에서 추출한 풀빅산의 겔 여과 크로마토그래피 분석결과 190～8900 Da의 분자량 분포를 보였으며, 피크점에서의 분자량 (Mwp)은 930 Da이었다. 분리된 풀빅산의 TOC 분석을 실시한 결과 FA1은 16 mg C/L, FA2는 31 mg C/L, FA3은 20 mg C/L의 총유기탄소 함량을 나타냈다.
- (4) 방출 형광분석 결과, 방출 스펙트럼은 특성피크를 나타내지 않았으며 450 nm에서 피크점을 보이며 전체적으로 넓은 스펙트럼을 나타냈다. 분자량 분리를 하지 않은 풀빅산 (FA0)의 상대 형광세기가 1.00일 때 FA1은 0.14, FA2는 0.90, FA3은 1.47로서, 분자량이 작을수록 방출 형광세기는 증가하는 경향을 보였다.
- 4는 그룹 I～III의 풀빅산에 대한 들뜸 스펙트럼을 보여준다. 분자량 분포별 풀빅산 (16 mg C/ℓ)의 excitation 형광스펙트럼은 345～365 nm와 380～395 nm에서 다소 넓은 특성 피크를 보였으며, 450 nm, 463 nm, 468 nm에서 특성적인 피크를 나타냈다. 분자량 분포별 풀빅산의 들뜸 형광스펙트럼 분석결과는 Table 1에 정리하였다.
- 풀빅산을 세 그룹의 분자량별로 분리한 결과, 그룹 I (FA1)은 2200 Da～8900 Da의 분자량 분포를, 그룹 II (FA2)는 540 Da～2200 Da, 그룹 III (FA3)은 190 Da～540 Da의 분자량 분포 나타냈다. 제주 한라산에서 추출한 풀빅산의 겔 여과 크로마토그래피 분석결과 190～8900 Da의 분자량 분포를 보였으며, 피크점에서의 분자량 (Mwp)은 930 Da이었다. 분리된 풀빅산의 TOC 분석을 실시한 결과 FA1은 16 mg C/L, FA2는 31 mg C/L, FA3은 20 mg C/L의 총유기탄소 함량을 나타냈다.
- )은 930 Da이었다. 틈새부피 용리후 100 mL씩 수집하여 3개 영역으로 분자량을 분리한 결과, FA1은 2,200 Da～8,900 Da, FA2는 540 Da～2,200 Da, FA3은 190 Da～540 Da의 분자량 분포 나타냈다. 각 분자량 영역의 총 유기탄소함량 (TOC)은 FA1이 16 mg C/L, FA2는 31 mg C/L, FA3은 20 mg C/L을 나타냈다.
- 3에 나타냈다. 풀빅산의 크로마토그램은 비교적 대칭을 보였으나, 용출 부피가 420 mL인 영역에서 아주 작은 어깨 피크를 보였다.
후속연구
- 본 연구에서 얻어진 결과는 국내 토양에 존재하는 휴믹 물질의 특성자료에 대한 데이터베이스 구축에 사용된다.8-11 또한, 여기서 사용된 분석방법은 지표수나 해수에서 추출한 휴믹물질의 분자량분포 및 형광특성을 해석하는데도 유용하게 적용될 수 있을 것이다.
- 본 연구의 목적은 겔 여과 크로마토그래피 (GFC: Gel Filtration Chromatography)를 이용하여 토양 풀빅산의 분자량분포 특성을 분석하고, 풀빅산을 3개의 분자량 영역으로 분리하여 분자량 영역별 풀빅산의 excitation, emission, synchronous 형광특성을 분석하는 것이다. 본 연구에서 얻어진 결과는 국내 토양에 존재하는 휴믹 물질의 특성자료에 대한 데이터베이스 구축에 사용된다.8-11 또한, 여기서 사용된 분석방법은 지표수나 해수에서 추출한 휴믹물질의 분자량분포 및 형광특성을 해석하는데도 유용하게 적용될 수 있을 것이다.
- 이상에서 얻어진 토양 풀빅산의 분자량 분포 특성 및 형광특성 자료는 앞서 발표된 결과와 함께 국내 토양 휴믹물질의 특성 자료에 대한 데이터베이스 구축 및 토양 오염물질의 거동 평가를 위한 토양 유기물의 물리화학적 역할을 이해하는데 중요한 기초자료로 활용 될 수 있다.
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