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문제 정의
- 2003) 등의 사용이 매우 바람직할 것이다. 본 연구에서는 산화스트레스에 의해 발현이 강하게 유도되는 SWPA2 프로모터를 이용하여 CuZnSOD 와 APX를 동시에 엽록체에서 발현하는 형질전환 벡터를 제작하여 복합 환경 스트레스에 내성을 가진 감자를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 1 mg/L GA3 + 400 mg/L claforan + 100 mg/L kanamycin) 에서 배양하였다. 3주 간격으로 새로운 배지로 계대배양한 후, 선발배지에서 유도된 shoote 뿌리 유도를 위해 뿌리유도배지 (MS 기본배지 + 400 mg/L claforan + 100 mg/L kanamycin)로 옮기고 뿌리가 발생하면 4~5일간 순화시켜 화분으로 옮겨 배양기에서 재배하였다.
- Kanamycin 배지에서 선발된 소식물체를 대상으로 S0R42 프로모터 특이 primer를 사용하여 PCR을 수행하여 일차적인 선별을 실시하였다. 이때 SWPA2 primer를 사용하였으며 PCR 결과 593 bp의 DNA 단편이 합성되었다(결과 미제시).
- Kanamycin 함유배지에 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 PCR로 확인하였다. PCR에 사용된 primer는 SWPA2 프로모터의 특이 염기서열 부분을 사용하였다.
- 생육 8주 된 식물체의 잎 (위로부터 3-4번째)을 절취하여 10 pM의 MV 용액이 5 mL씩 들어있는 직경 5 cm의 Petri dish에 3개씩의 잎을 띄웠다. MV 처리실험은 0.4 M sorbitol이 첨가된 MV 용액에 leaf disc를 띄워 25℃의 암 조건에서 12시간 동안 배양한 후 광 조건에서 72시간 배양하여 잎의 손상정도를 육안으로 조사하였다. 이와 같은 실험을 위해 10 개체 이상을 사용하였으며 3회 반복 실시하였다.
- 이때 SWPA2 primer를 사용하였으며 PCR 결과 593 bp의 DNA 단편이 합성되었다(결과 미제시). PCR로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체를 품종별로 2개체씩 무작위로 선발하여 SWPA2 특이 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시하였다. 그 결과 형질전환 식물체내로 pSSA-K가 도입되었음을 확인할 수 있었다 (Figure 3).
- PCR에 사용된 primer는 SWPA2 프로모터의 특이 염기서열 부분을 사용하였다. PCR로 형질전환이 확인된 감자 식물체를 벡터별로 무작위로 선발하여 Southern분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 감자 식물체의 잎으로부터의 genomic DNA 분리는 Asemota(1995)의 방법에 따라 수행하였다.
- 후 온실에서 생육시켰다. Pot에서 약 8주 생장한 형질전환 감자식물체 3-4번째 잎을 취하여 10 pM MV 용액이 든 Petri dish에 띄워 72시간 배양하여 잎의 손상 정도를 관찰하였다(Figure 4). MV를 처리하여 광 조건에서 배양한 지 24시간이 경과 후부터 잎의 손상이 관찰되기 시작하였다.
- 고구마 배양세포에서 분리한 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터 (Kim et al. 2003)를 이용하여 카사바 cytosolic CuZnSOD cDNA, mSODI(Lee et al. 1999)과 완두 APX(Allen et al. 1997)가 동시에 엽록체에서 발현될 수 있도록 연결시킨 후, neomycin phosphotransferase (nptⅡ) 유전자를 선발표지로 가지고 있는 pCAMBIA2300에 도입한 벡터를 제작하여 pSSA-K라 명명하였다 (Figure 1). 이것을 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 도입하였으며, 또한 대조구로 이용하기 위하여 pCAMBIA2300 벡터만 도입된 Agrobacterium도 준비하였다.
- 이 DNA를 동위원소 [α-32P] dCTP로 labelling 시켜 prehybridization 용액(Zeta Probe membrane용)에 첨가하여 60℃에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.
- 배양기에서 생육중인 감자 식물체의 잎으로부터의 genomic DNA 분리는 Asemota(1995)의 방법에 따라 수행하였다. 분리한 DNA (30 Ug)를 EcoRI으로 각각 절단하여 0.8% agarose gel에 전기영동한 후, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전이시켰다. Probe는 SWPA2 프로모터 특이부분에서 제작된 primer를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)로 합성하여 이용하였다 (593 bp).
- pot로 옮겼다. 생육 8주 된 식물체의 잎 (위로부터 3-4번째)을 절취하여 10 pM의 MV 용액이 5 mL씩 들어있는 직경 5 cm의 Petri dish에 3개씩의 잎을 띄웠다. MV 처리실험은 0.
대상 데이터
- 2003) 본 연구에서는 품종간의 큰 차이는 관찰되지 않았다. MW에 대한 내성 결과로부터 에 대해 백화현상이 거의 일어나지 않은 식물체를 2 line씩 선발하였다 (*로 표시). 선발된 line들은 복합재해 내성 감자 개발을 위하여 포장에서 식물체 수준에서 MV, 고온 등의 여러가지 환경 스트레스에 대한 내성특성 분석에 재료로 이용할 계획이다.
- 감자 (Solanum tuberosum L.) 형질전환에는 국내에서 식용인 수미(Superior)와 가공용인 대서 (Atlantic) 품종을 기내에서 증식시켜 사용하였다. 식물체 증식은 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지에 sucrose를 3% 첨가하여 16시간 일장, 40 μmol • m-2 • sec-1의 cool-white 형광, 25℃의 배양실에서 배양하였으며 2주 동안 배양한 잎과 줄기조직을 형질전환 재료로 사용하였다.
- ) 형질전환에는 국내에서 식용인 수미(Superior)와 가공용인 대서 (Atlantic) 품종을 기내에서 증식시켜 사용하였다. 식물체 증식은 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지에 sucrose를 3% 첨가하여 16시간 일장, 40 μmol • m-2 • sec-1의 cool-white 형광, 25℃의 배양실에서 배양하였으며 2주 동안 배양한 잎과 줄기조직을 형질전환 재료로 사용하였다.
- 1997)가 동시에 엽록체에서 발현될 수 있도록 연결시킨 후, neomycin phosphotransferase (nptⅡ) 유전자를 선발표지로 가지고 있는 pCAMBIA2300에 도입한 벡터를 제작하여 pSSA-K라 명명하였다 (Figure 1). 이것을 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 도입하였으며, 또한 대조구로 이용하기 위하여 pCAMBIA2300 벡터만 도입된 Agrobacterium도 준비하였다.
이론/모형
- PCR로 형질전환이 확인된 감자 식물체를 벡터별로 무작위로 선발하여 Southern분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 감자 식물체의 잎으로부터의 genomic DNA 분리는 Asemota(1995)의 방법에 따라 수행하였다. 분리한 DNA (30 Ug)를 EcoRI으로 각각 절단하여 0.
- 형질전환은 기내에서 배양중인 식물체에서 신초의 위에서부터 2-3번째 잎과 줄기조직을 절취하여 Youm 등 (2002)의 방법에 따라 Agrobacterium과 공동배양하였다. 공동배양 후 잎과 줄기 절편체를 MS 기본 액체배지로 씻어 선발배지(MS + 2 mg/L zeatin + 0.
성능/효과
- 형질전환 벡터에 의한 shoot 유도율의 차이는 관찰되지 않았지만, 사용한 식물조직에 의한 차이는 뚜렷하였다. Shoot 유도율은 줄기 절편체에서 두 품종 모두 높게 나타났으며(대서 82%, 수미 73%), 잎 절편체로부터는 대서 4%, 수미 2.1%로 줄기조직에 비해 낮은 shoot 유도율을 나타내었다. 따라서 대서가 수미에 비해 다소 높은 shoot 유도율을 나타내었을 뿐만 아니라 shoot이 먼저 유도되는 경향을 보였다.
- PCR로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체를 품종별로 2개체씩 무작위로 선발하여 SWPA2 특이 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시하였다. 그 결과 형질전환 식물체내로 pSSA-K가 도입되었음을 확인할 수 있었다 (Figure 3). 그러나 형질전환 시키지 않은 대조구 식물체에서는 어떤 밴드도 나타나지 않았다.
- 1%로 줄기조직에 비해 낮은 shoot 유도율을 나타내었다. 따라서 대서가 수미에 비해 다소 높은 shoot 유도율을 나타내었을 뿐만 아니라 shoot이 먼저 유도되는 경향을 보였다. 잎이 1-2 장 정도 나왔을 때 뿌리 유도 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였다.
- 비형질전환 식물체(NT)와 pCAMBIA2300 벡터만을 도입한 식물체(C)의 잎은 형질전환 식물체 잎에 비해 심한 손상을 받았다. 반면 형질전환 식물체의 경우 MV에 대한 손상 정도는 형질전환 개체마다 각기 다른 반응을 나타내었지만 실험에 이용한 개체의 50% 이상이 MV에 대해 내성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이는 엽록체에서 항산화기구에서 일차적으로 활성산소종을 제거하는 SOD와 APX가 과발현되어 MV에 대해 강한 내성을 나타내었을 것이라 생각된다.
- 특이 primer를 사용하여 PCR을 수행하여 일차적인 선별을 실시하였다. 이때 SWPA2 primer를 사용하였으며 PCR 결과 593 bp의 DNA 단편이 합성되었다(결과 미제시). PCR로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체를 품종별로 2개체씩 무작위로 선발하여 SWPA2 특이 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시하였다.
- 그러나 형질전환 시키지 않은 대조구 식물체에서는 어떤 밴드도 나타나지 않았다. 이로써 복수 copy의 외래 유전자가 안정적 도입된 형질전환 감자 식물체를 개발하였으며, 이 형질전환 식물체를 SSA식물체라 명명하였다.
- 이상의 결과로부터 SOD와 APX 유전자가 안정적으로 도입되어 엽록체에서 동시에 발현된 형질전환 감자 식물체는 MV에 의해 발생되는 산화스트레스에 내성이 있음이 확인되었다. 특히 고구마 배양세포에서 분리된 SWPA2 프로모터가 감자에서도 유전자의 발현을 정상적으로 유도하는 것이 확인되었다.
- 특히 고구마 배양세포에서 분리된 SWPA2 프로모터가 감자에서도 유전자의 발현을 정상적으로 유도하는 것이 확인되었다. 따라서 최근 들어 심각하게 나빠지는 환경에 대비하여 고염, 건조, 고온, 저온 스트레스 등의 복합스트레스에 저항성을 가지는 감자 품종이 개발될 수 있을 것이다.
- pSSA-K 도입된 형질전환체는 형질전환시키지 않은 식물체와 비교하여 외형적인 차이를 나타내지 않았다. 하지만 형질전환 재료로 사용한 줄기조직에서는 잎에 비해 많은 수의 shoot(2-4개)이 유도되었지만 대부분이 PCR 결과 형질전환되지 않은 것으로 판명되었다 (결과 미제시). 이는 줄기 조직에서 측아에 가까운 부분의 분열 능력이 높은 세포들로부터 chimera shoot 또는 비형질전환 shoot들이 많이 유도되었기 때문인 것으로 생각된다.
후속연구
- 형질전환 식물체가 MW에 대해 내성을 갖는 것은 MW에 의해 유도되는 산화스트레스에 의해 SWPA2 프로모터가 SOD와 APX의 발현을 강하게 유도한 결과라 판단된다. 따라서 MV에 대해 강한 내성을 나타낸 형질전환체를 대상으로 도입유전자의 northern blot 및 Western blot 분석을 수행하여발현 패턴과의 관련 여부를 추후 확인할 필요가 있겠다.
- 기관이다. 따라서 스트레스 조건에서 엽록체의 산화스트레스를 극복할 수 있도록 항산화기구를 효율적으로 조절할 수 있으면 식물의 생산성 즉 광합성 효율을 유지시키거나 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다. 엽록체의 항산화기구를 설명하는 Water-Water cycle (Asada 1999)에는 SOD, ascorbate peroxidase (APX), monodehydroascorbate reductase (MDHAR), dehydroascorbate reductase (DHAR), glutathionereductase (GR) 등이 관여하여 효율적으로 ROS를 제거할 수 있음이 제시되고 있다.
- 이와 같이 식물체 종류에 따라, 도입한 유전자의 특성에 따라 MV로부터 유도된 산화스트레스에 대한 저항성 정도가 조금씩 다르게 나타날 수 있다. 추후 nucleoside diphosphate kinase2와 같은 복합재해 관련 유전자를 형질전환 감자식물체 개발에 활용해 볼 만한 가치가 있다. 이 유전자를 과발현시킨 애기장대가 여러가지 스트레스에 대해 내성이 있음이 보고된 바 있다.
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