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문제 정의
- 본 연구에서는 금속들의 서로 다른 독성을 시험하기 위하여 대장균의 AGB 를 이용하여 농도에 따른 독성을 시험하여 금속의 독성을 정도를 비교하고자 하였으며 다양한 금속에 대한 금속독성을 시험하고자 하였다. 또한 이들의 독성에 대한 풀빅산의 영향을 알아보기로 한다.
- 본 연구에서는 금속들의 서로 다른 독성을 시험하기 위하여 대장균의 AGB 를 이용하여 농도에 따른 독성을 시험하여 금속의 독성을 정도를 비교하고자 하였으며 다양한 금속에 대한 금속독성을 시험하고자 하였다. 또한 이들의 독성에 대한 풀빅산의 영향을 알아보기로 한다.
제안 방법
- Control, cell blank 및 금속시료를 3개 이상 시험하였으며 cell blank를 제외하고 각각의 시험 관속에 O.lmL의 resuspended cell을 첨가하였다. 또한 각각의 control 시험관에 는 0.
- FA를 첨가하지 않았을 경우에는 방정식들이상 관계수(r) 값이 매우 크게 나타나 일차 직선에 가까뭤으나 FA를 첨가했을 경우에는 상대적으로 Γ값이 작아지는 현상을 관찰하였다. 이는 FA에 의한 착화반응의 결과로 나타나는 분석오차, 중금속과 FA와의 결합 등의 물리화학적이 인자들의 반응으로 인하여 나타나는 반응성의 결과로 예측된다.
- 각 그래프에서는 AGB에 대하여 금속을 투여하지 않았을 때, 즉 금속의 독성이 작용하지 않았을 때의 수치를 100%로 계산하였다.
- 냉동의 Bacillus licheniformis stock 용액에서 50 |1L를 덱스트로스가 들어있지 않은 TSB(trypticase soy broth)를 넣은 5-mL 시험관에 옮긴 다음 교반 기속(30 ℃)에서 24시간 동안 배양하였으며 24시간 후에 Ryan 배양 플라스크 속에 넣은 새로 만든 45 mL의 TSB 배양물에 넣은 다음 24시간 동안 같은 조건하에서 배양을 하였다. 배양 후의 배양물은 흡광도계 를 사용하여 550nm에서 OD (optical densi- ty)를 측정하였다. 그리고 나서 fresh media를 사용하여 배양물의 흡광도를 다시 0.
- 배양액이 정체단계로 들어서면서 AG는 세포외액속 으로 들어간다(Thirunavukkarasu and Ptiest, 1983). 정체단계가 형성되면서 지시약을 넣어주면 색원체 인 p-nitrophenyl-alpha-D-glucoside에서 alpha 1-4 결합이 끊어지면서 노란색으로 변화하며 p- nitrophenol이 방출되면서 생성되는 노란색의 흡광 도 차이를 흡광도계를 이용하여 측정한다.
- 8사이로 올라가도록 배양을 시켰다. 흡광도는 30분마다 측정하여 배양물이 지수적 변화상 (exponential phase)을 만드는지를 확인하였다. 이 배양물은 멸균된 원심분리 튜브 속에 옮겨져 4℃에서 20분 동안 8000 rpm의 속도로 원심분리하였다.
대상 데이터
- (USA)으로부터 구입하였으며 필요에 따라 표준용액을 희석시켜 사용하였다. FA (fulvic acid)는 Mycsa AG Company (Tlalnepantla, Mex. Mexico 54050)의 제품을 사용하였으며 buffer 및 나머지 모든 시약들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MD, USA)에서 구입하였다.
- 각 금속원소에 대한 표준용액은 Aldrich Chem- ical Co. (USA)으로부터 구입하였으며 필요에 따라 표준용액을 희석시켜 사용하였다. FA (fulvic acid)는 Mycsa AG Company (Tlalnepantla, Mex.
데이터처리
- 실험결과는 표 1에 나타나 있으며 위의 실험 데이타를 이용하여 금속의 농도에 대한 AGB의 저해 율을 선형회귀방정식으로 나타내었으며 IC50 값을 계산하였다.
- 실험결과의 통계처리는 각 농도지점에서 측정된 3개의 값을 이용하였으며 control에 대한 각각의 중금속의 저해율의 유의성 정도를 구하기 위하여 ANCOVA test를 수행하였다. 통계분석을 위한 프 로그램은 SPSS 소프트웨어 (version 9.
성능/효과
- (1) 박테리아(E. coli)의 AGB (alpha-glucosidase biosynthesis)에 대한 구리, 납, 카드뮴, 알미늄 및 수은에 의한 억제효과를 관찰하였으며 본 실험에서는 금속과 FA의 결합에 의한 금속의 독성을 제거하는 작용임을 증명하고 있다. 또한 각각의 FA의 적용시 및 비적용 시에 독성의 감소 효과는 중금속의 농도가 증가함에 따라 크게 나타나고 있다.
- (2) FA를 첨가하지 않았을 때의 각 중금속의 IC50는 Hg (2.0)>Pb(1.9), Zn(1.9)>Cd(1.4)>Cu (1.3)의 순서로 감소되어 독성의 세기는 Hg<Pb< Zn<Cd<Cu의 순서로 증가된 것으로 나타났다. FA의 첨가에 의한 금속의 독성억제효과의 크기는 Zn > Cu > Hg > Pb > Cd 등의 순서로 증가되었다.
- (3) FA를 첨가하여 나타난 IC50 값의 차이는 Cd (3.8)>Cu (2.4)>Pb(2.0)>Hg(l.9)>Zn(l.6)의 순서로 감소하였으므로 FA 첨가 후, IC50 값의 차이에 의한 FA에 의한 독성의 증감효과는 Cd<Cu< Pb<Hg<Zn의 순서로 증가하는 것을 알 수 있다.
- (5) FA를 적용했을 경우에 독성의 저해율은 특정한 중금속에 관계없이 전체적으로 현저히 줄어들었으나 IC50의 값이 차이가 없어 독성에 대한 순서를 정하기가 어려웠다. 이는 중금속들 사이에 독성이 원래 차이가 없거나, 혹은 본 실험에서 적용 된 중금속의 농도가 상대적으로 작거나 혹은 큰 것으로 판단되며 또한 미래의 실험에서는 효모나 다른 생물들을 이용하여 수행하는 연구가 필요하다고 사료된다.
- 99로 직선에 매우 가까운 것으로 나타났다. 1C50 값은 첨가시와 비첨가시에 각각 3.9와 2.0으로 FA를 첨가시에는 Pb에 의한 AGB 생합성의 저해율이 2배 정도 감소되어 독성이 급격히 감소되었다.
- Hg, Pb 및 Zn 등의 IC50 순위를 정할 정도로 값들의 차이가 크지 않았다. FA의 첨가 후에 각 중금속의 IC50는 Cd (5.2) > Pb (3.9), Hg (3.9) > Cu (3.7) > Zn (3.5)의 순서로 감소하였으며 독성의 세기는 Zn>Cu>Hg >Pb>Cd의 순서로 감소함을 알 수 있다. FA의 적용 시에 Cd의 IC50 값이 다른 중금속의 값보다 훨씬 높았으나 나머지 중금속 간의 IC50 값은 큰 차이가 없었다.
- (그림 3). HA의 첨가 시에 첨가하지 않은 실험결과와 비교할 때 Cu(구리)에 의한 억제 효과는 농도가 1 ppm 이후부터 두 직선의 저해율의 차이가 크게 증가하였다.
- 97로 상관성이 매우 높은 것으로 나타났다. IC50 값은 첨가시와 비첨가 시에 각각 3.7과 1.3으로 FA를 첨가시에는 Pb 에 의한 AGB 생합성의 저해율(독성)이 약 3배 정도 감소되었다.
- 박테 리 아시험 법의 가장 중요한 점 은 소수성 성질을 가지고 있는 유기화합물같은 환경 독성물질의 세포에 대한 투과성이다. 대장균의 외 세포벽에 대한 물리적, 화학적 그리고 유전적 변화는 유기화합물에 대한 시험방법의 민감도에 영향을 주는 것으로 알려졌다. 여러 가지의 생물독성 시험법들이 이미 시중에 상용화가 되어있으며 Microtox (bioluminescence) (Nalecz-Jawecki et al.
- 통계분석 (ANCOVA test) 결과에 의하면 각 중금속의 control에 대한 저해율. 및 FA의 첨가시와 비첨가시의 저해율에 대한 그래프들은 모두 P<0.01 범위에서 통계학적으로 유의적인 차이가 있었다.
- , 1990) 혹은 alpha-glucosidase (Bitton and Koopman, 1992)과 같은 효소의 합성억제현상을 독성시험방법의 기초로 많이 연구되고 있다. 효소합성은 효소활동도보다 유기화합물에 보다 더 민감한 것으로 나타났다. 반면에 효모의 beta-galactosidase에 대한 중금속의 독성은 유기화합물에 대한 독성보다 민감도가 더 좋은 것으로 나타났다 (Apartin and Ronco, 2001).
후속연구
- 의 값이 차이가 없어 독성에 대한 순서를 정하기가 어려웠다. 이는 중금속들 사이에 독성이 원래 차이가 없거나, 혹은 본 실험에서 적용 된 중금속의 농도가 상대적으로 작거나 혹은 큰 것으로 판단되며 또한 미래의 실험에서는 효모나 다른 생물들을 이용하여 수행하는 연구가 필요하다고 사료된다.
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