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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 디젤 분진에 대한 심혈관계에 미치는 독성 영향 평가를 위해서 순환기계 동맥혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells; 이하 VSMCs)을 이용한 시험관 내 실험을 실시하여 성분과 입자 크기에 따른 세포 독성에 미치는 정도를 알아보았다. 나아가 그 결과를 바탕으로 미세디젤먼지의 건강 위해성 및 규제기준 강화를 위한 지표를 제시하고자 한다.
- , 2001).더 나아가 디젤 분진에 포함되어 있는 성분을 분석한 Topinka 등의 보고를 참조하여 디젤 분진의 분획시료들이 VSMCs에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다(Topinka 1986).세포독성이 강하게 나타난 시료들의 주요 성분을 Topinka 등이 보고한 것을 참조하면 acids와 oxy-derivatives of PAH 등의 성분들이 세포 독성에 가장 큰 영향을 주며 nitro-PAH와 PAH 등도 큰 역할을 하는 것으로 사료된다.
- 디젤 분진 포 집장치에서 입자 크기별로 흡착되어 있는 시료를 DCM으로 추출하여 얻은 crude extract를 가지고 사람 동맥평활근 세포(VSMCs)에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해서 [3H]-thymidine incorporation assay를 수행했다. 실험 결과 diesel exhaust particles (DEP)는 처리한 농도에서 유의성이 없었으나, aerodynamic diameters lower than 2.
- 이에 본 연구에서는 디젤 분진에 대한 심혈관계에 미치는 독성 영향 평가를 위해서 순환기계 동맥혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells; 이하 VSMCs)을 이용한 시험관 내 실험을 실시하여 성분과 입자 크기에 따른 세포 독성에 미치는 정도를 알아보았다. 나아가 그 결과를 바탕으로 미세디젤먼지의 건강 위해성 및 규제기준 강화를 위한 지표를 제시하고자 한다.
제안 방법
- 05 ㎍/mL에서 50 ㎍/mL까지 다양한 농도로 시료를 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 VSMCs의 mitochondrial dehydrogenases에 의해 형성된 formazan 염료를 측정하는 MTT 측정 방법으로 세포독성을 관찰하였다. Fig.
- 30분 후 DCM을 separatory funnel에 옮기고 다시 DCM20mL에 재현탁시켜 30분간 sonication을 반복하였다. 2번 반복 추출한 시료를 모아 감압증발 장치에 의해 증발시켜 최종 농도가 미세 먼지(PM2.5)량으로 100㎎/mL가 되도록 DMSO에 녹인 후 0.22 ㎛ syringe filter로 여과하여 실험에 사용하였다. 분진의 수용성 물질은 0.
- VSMCs를 12-well culture plate에 seeding하고 70% confluence를 이루면 medium을 serum-free medium으로 바꾸어주고 각 농도별로 chemical을 처리하였다. Chemical 처리 후 24시간 뒤에 위상차현미경 (1×70, Olympus, Japan)을 이용하여 100배 율 하에서 대조군과 실험군의 형태학적 변화를 관찰하였다.
- Cell viability of human aortic vascular smooth muscle cells by diesel exhaust particles. Human aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) viability after 24 hr of continuous exposure to different concentrations was measured with a colorimetric assay based on the ability of mitochondria in viable cells to reduce the MTT. The percentage of cell viability was calculated as the absorbance of treated cells/ control cells × 100%.
- Morphology of human aortic vascular smooth muscle cells after treatment with diesel exhaust particles. Human aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) were precultured in serum-free medium in the presence of DEP and PM2.5 for 24 hr and then photographed. Magnification 100 ×.
- PM2.5가 VSMCs에 미치는 세포독성을 알아보기 위하여 0.05 ㎍/mL에서 50 ㎍/mL까지 다양한 농도로 시료를 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 VSMCs의 mitochondrial dehydrogenases에 의해 형성된 formazan 염료를 측정하는 MTT 측정 방법으로 세포독성을 관찰하였다.
- 이 결과를 기초로 하여 VSMCs의 독성을 규명하는 실험으로 형태학적 변화와 MTTassay를 수행하였다. PM2.5가 노출된 동맥혈관 평활근 세포의 증식억제 이유가 세포 사멸에서 기인하는 것인지를 알아보기 위하여, 동맥혈관 평활근 세포에 PM25를 5, 20 및 50 ㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 위상차현미경을 통하여 PM15에 노출된 VSMCs 세포들의 외부 형태적인 특징을 관찰한 결과, 5 ㎍/mL의 낮은 농도 처리군에서는 대조군과 비교하여 세포의 모양과 수에 큰 변화를 관찰할 수 없었으나, 농도가 높아질수록 세포사멸의 특징인 세포막 외부융기의 돌출 현상을 볼 수 있었다.
- VSMCs를 12-well culture plate에 seeding하고 70% confluence를 이루면 medium을 serum-free medium으로 바꾸어주고 각 농도별로 chemical을 처리하였다. Chemical 처리 후 24시간 뒤에 위상차현미경 (1×70, Olympus, Japan)을 이용하여 100배 율 하에서 대조군과 실험군의 형태학적 변화를 관찰하였다.
- USA)에서 배양하였다. VSMCs의 배양액은 smooth muscle medium (SmGM)에 10% fetal bovine serum (FBS) 첨가하였다. 실험에 사용한 VSMCs의 passage는 18 〜 23 이다
- 디젤 분진에 포함되어 있는 성분을 분석하기 위해 DCM으로 추출한 후 얻은 crude extract를 가지고 silicagel column을 통해 극성에 따라 분획하였다. 각각 분획된 시료에서 나올 수 있는 디젤 분진에서의 성분을 가지고 VSMCs에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해서 50㎎/mL의 농도로 [3H]- thymidine incorporation assay와 세포의 형태학적 변화를 관찰했다. 실험 결과 fraction 3 (organic bases) 과 fraction 5 (aliphatic compounds)를 제외한 모든 시료에서 세포 증식이 억제되었으며 그 중 fraction 4 (organic acids)와 fraction 8 (moderately polar compounds)이 가장 높았고 다음으-루- fraction 7 (slightly polar compounds), fraction 9 (higher polar compounds), fraction 6 (aromatic compounds) 순으로 억제 효과가 나타났다.
- 디젤 분진에 포함되어 있는 성분을 분석하기 위해 DCM으로 추출한 후 얻은 crude extract를 가지고 silicagel column을 통해 극성에 따라 분획하였다. 각각 분획된 시료에서 나올 수 있는 디젤 분진에서의 성분을 가지고 VSMCs에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해서 50㎎/mL의 농도로 [3H]- thymidine incorporation assay와 세포의 형태학적 변화를 관찰했다.
- 디젤 분진이 사람 동맥평활근 세포(VSMCs)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 VSMCs에 디젤 분진 시료를 처리하고 세포의 증식억제와 세포 생존율, 그리고 형태학적 변화를 연구했다. 실험 결과 diesel exhaust particles (DEP)는 VSMCs 증식 억제를 보이지 않았으나, aerodynamic diameters lower than 2.
- 이 결과를 기초로 하여 VSMCs의 독성을 규명하는 실험으로 형태학적 변화와 MTTassay를 수행하였다. PM2.
- 디젤 배기가스는 디젤유(SK사 제품)를 시험용 차량에 주입한 후 자동차 공회 전 속도를 2,000 rpm으 로하여 배출되는 배기가스를 포집장치(Cascade impactor, Dustorbo, Korea)를 이용하여 입자 크기별로 포집하였다. 이중 PM2.5 크기의 입자가 흡착되어 있는 teflon filter (SIBATA 8013-60280 TF FilterT60A20, 80 ㎜, PALLFLEX PRODUCTS CORP.)를 분리하여 포집된 시료의 양을 미세 저울 (AND, HM-202)로 무게를 측정한 후 teflon filter 전체를 1 ㎝ × 1 ㎝ 크기로 잘게 자른 후, 40 mL 갈색 glass vial에 넣고 유기성 물질 추출을 위해서 dichloromethane (DCM) 20 mL에 현탁시켜 30분간 sonication을 하였다. 30분 후 DCM을 separatory funnel에 옮기고 다시 DCM20mL에 재현탁시켜 30분간 sonication을 반복하였다.
대상 데이터
- Human aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs)는 미국 세포주 은행인 The American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양받아, 37℃와 5% CO2 공급 조건을 갖춘 incubator (Model 580, OPTIMA INC. USA)에서 배양하였다. VSMCs의 배양액은 smooth muscle medium (SmGM)에 10% fetal bovine serum (FBS) 첨가하였다.
- 세포배양에 사용한 material은 Gibco-BRL (Rockville, MD, USA) 회사 제품을 Fh]-thymidine은 Amersham Pharmacia Biotech (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 회사 제품을 사용하였다. 그 외의 다른 chemical reagents는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- 디젤 배기가스는 디젤유(SK사 제품)를 시험용 차량에 주입한 후 자동차 공회 전 속도를 2,000 rpm으 로하여 배출되는 배기가스를 포집장치(Cascade impactor, Dustorbo, Korea)를 이용하여 입자 크기별로 포집하였다. 이중 PM2.
- 세포배양에 사용한 material은 Gibco-BRL (Rockville, MD, USA) 회사 제품을 Fh]-thymidine은 Amersham Pharmacia Biotech (Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 회사 제품을 사용하였다. 그 외의 다른 chemical reagents는 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 본 실험실에서 얻은 측정치를 각 실험군의 평균과 표준편차로 나타내었고 대조군과의 차이에 대한 유의성은 Student's t-test를 이용하여 검정하였다.
성능/효과
- 그리고 분획된 디젤 분진 시료에 대한 세포 증식 억제 실험 결과, fraction 4 (organic acids)와 fraction 8 (moderately polar compounds)이 가장 높았고, fraction 7 (slightly polar compounds), fraction 9 (higher polar compounds), fraction 6 (aromatic compounds) 순으로 억제 효과가 나타났다 . Fraction 4와 8은 95 %의 세포 증식 억제를 나타냈고, fraction 7, fraction 9, fraction 6은 각각 85%, 66%, 53% 억제하는 것으로 나타났다. 또한 이들 분획의 VSMCs의 증식억제 형태는 세포의 형태학적 변화를 관찰하였을 때 세포독성으로 인한 것으로 관찰되었다.
- 실험 결과 fraction 3 (organic bases) 과 fraction 5 (aliphatic compounds)를 제외한 모든 시료에서 세포 증식이 억제되었으며 그 중 fraction 4 (organic acids)와 fraction 8 (moderately polar compounds)이 가장 높았고 다음으-루- fraction 7 (slightly polar compounds), fraction 9 (higher polar compounds), fraction 6 (aromatic compounds) 순으로 억제 효과가 나타났다. Fraction 4와 8은 95%의 세포 증식 억제를 나타냈으며 fraction 7은 85%, fraction 9, 6은 각각 66%, 53% 억제하는 것으로 나타났다. VSMCs의 증식억제는 세포의 형태학적 변화를 관찰하였을 때 세포 독성으로 인한 것으로 평 가되었다.
- 5)는 20㎍/mL 처리한 농도에서 37%, 50㎍/mL에서는 81%의 VSMCs 증식 억제를 보였다. PM2.5를 배지에 처리하고 24시간 동안 배양한 후 형광현미경을 통하여 PM2.5에 노출된 VSMCs 세포들의 외부 형태적인 특징을 관찰한 결과, PM2.5 20㎍/mL의 농도에서는 6시간 후에 돌출 현상이 보이기 시작했고 50㎍/mL에서는 같은 시간에 거의 모든 세포에서 세포 사멸의 특징인 세포막 외부융기의 돌출 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 PM15 20, 50㎍/mL 농도에서는 배양시간에 비례하여 세포의 생존율이 감소되었고 세포 사멸이 증가되었다.
- 그리고 MTT 측정 방법으로 세포의 독성을 관찰한 결과, DEP에 의한 세포독성은 시료를 처리한 모든 농도에서 대조군에 비해 유의할 만한 변화를 나타내지 않았으나 PM2.5는 20㎍/mL 농도에서 53%,50㎍/mL에서는 약 79%의 세포독성을 보였다. 이 결과 PM2.
- 그리고 분획된 디젤 분진 시료에 대한 세포 증식 억제 실험 결과, fraction 4 (organic acids)와 fraction 8 (moderately polar compounds)이 가장 높았고, fraction 7 (slightly polar compounds), fraction 9 (higher polar compounds), fraction 6 (aromatic compounds) 순으로 억제 효과가 나타났다 . Fraction 4와 8은 95 %의 세포 증식 억제를 나타냈고, fraction 7, fraction 9, fraction 6은 각각 85%, 66%, 53% 억제하는 것으로 나타났다.
- 디젤 분진이 사람 동맥평활근 세포(VSMCs)에 미치는 영향을 알아보기 위하여 VSMCs에 디젤 분진 시료를 처리하고 세포의 증식억제와 세포 생존율, 그리고 형태학적 변화를 연구했다. 실험 결과 diesel exhaust particles (DEP)는 VSMCs 증식 억제를 보이지 않았으나, aerodynamic diameters lower than 2.5 ㎛ (PM2.5)는 20㎍/mL 처리한 농도에서 37%, 50㎍/mL에서는 81%의 VSMCs 증식 억제를 보였다. PM2.
- H]-thymidine incorporation assay를 수행했다. 실험 결과 diesel exhaust particles (DEP)는 처리한 농도에서 유의성이 없었으나, aerodynamic diameters lower than 2.5 Hm(PM2.5)는 20㎍/mL 처리한 농도에서 37%, 50 ㎍/mL 처리한 농도에서는 81%의 VSMCs 증식 억제를 보였다.
- 각각 분획된 시료에서 나올 수 있는 디젤 분진에서의 성분을 가지고 VSMCs에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해서 50㎎/mL의 농도로 [3H]- thymidine incorporation assay와 세포의 형태학적 변화를 관찰했다. 실험 결과 fraction 3 (organic bases) 과 fraction 5 (aliphatic compounds)를 제외한 모든 시료에서 세포 증식이 억제되었으며 그 중 fraction 4 (organic acids)와 fraction 8 (moderately polar compounds)이 가장 높았고 다음으-루- fraction 7 (slightly polar compounds), fraction 9 (higher polar compounds), fraction 6 (aromatic compounds) 순으로 억제 효과가 나타났다. Fraction 4와 8은 95%의 세포 증식 억제를 나타냈으며 fraction 7은 85%, fraction 9, 6은 각각 66%, 53% 억제하는 것으로 나타났다.
- 5가 노출된 동맥혈관 평활근 세포의 증식억제 이유가 세포 사멸에서 기인하는 것인지를 알아보기 위하여, 동맥혈관 평활근 세포에 PM25를 5, 20 및 50 ㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 위상차현미경을 통하여 PM15에 노출된 VSMCs 세포들의 외부 형태적인 특징을 관찰한 결과, 5 ㎍/mL의 낮은 농도 처리군에서는 대조군과 비교하여 세포의 모양과 수에 큰 변화를 관찰할 수 없었으나, 농도가 높아질수록 세포사멸의 특징인 세포막 외부융기의 돌출 현상을 볼 수 있었다. 또한 PM2.
- 5는 20㎍/mL 농도에서 53%의 세포 독성을 보였고 50㎍/mL에서는 약 79%의 세포독성을 보였다. 이 결과 PM2.5가 대조군에 비하여 실험군의 세포수가 줄어드는 현상은 세포 사멸로 인한 세포수의 감소임을 알 수 있었다.
후속연구
- 그러므로 국내의 현실적인 대기오염 문제를 감안할 때 디젤자동차로부터 배출되는 입자상 물질 등을 규제하지 않고는 효과적인 대기오염 저감을 기대하기 어려우므로 가까운 장래에 이를 실현하기 위하여 준비하지 않으면 안 된다. 따라서 디젤 자동차로부터 배출되는 각종 오염물질을 감소시킬 수 있는 가능한 방법들을 모색해야 하고 이에 대한 각 분야에서의 연구와 검토가 이루어져야 한다. 이에 우리 연구는 아직까지 PM2.
- 세포독성이 강하게 나타난 시료들의 주요 성분을 Topinka 등이 보고한 것을 참조하면 acids와 oxy-derivatives of PAH 등의 성분들이 세포 독성에 가장 큰 영향을 주며 nitro-PAH와 PAH 등도 큰 역할을 하는 것으로 사료된다. 이는 여러 연구자들에 의해 PAH (Laurence, 2003)와 이들의 nitro체인 nitro-PAH가 강력한 발암성 및 변이원성을 나타내었다는 보고와 산성과 산화 조건들에 의한 상호작용으로 세포 사멸을 유도한다는 선행연구를 보았을 때 세포수 감소로 인한 세포증식 억제는 세포 사멸에 의한 것으로 사료되며 이에 대한 좀 더 구체적인 연구가 요구된다.
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