[논문]디젤분진의 수용성 추출물에 의한 메탈로치오닌 유전자 발현

박광식; 문창규

디젤분진의 수용성 추출물에 의한 메탈로치오닌 유전자 발현
Expression of Metallothionein mRNA in Diesel Exhaust Particles Treated A549 Cell 원문보기

환경독성학회지 = Journal of environmental toxicology, v.19 no.1, 2004년, pp.59 - 64

Abstract ▼ AI-Helper

Metallothionein gene expression of diesel exhaust particles (DEP) was investigated in human lung epithelial cell line. DEP was collected from diesel motor bus and soluble fraction in water was obtained. Cells, grown to near confluence, were exposed to 5-50 ppm DEP for 6 hours. Regarding the metallothionein gene expressions, MT-1 and MT-2 were induced in the DEP-treated cell by using RT-PCR and real-time PCR. However, MT-3 which is known to be brain specific, and another isoform MT-4 were not expressed in cadmium-treated groups as well as control group. Heavy metal of DEP was also analyzed and Zn was found as the major component of heavy metals in DEP used in this study.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구는 디젤 분진을 포집하고 수용성분획을 추출하여 인간 폐포 세포에서의 MT 유전자 발현 패턴을 파악함으로써 향후 중금속을 함유한 복합물질의 위해성 평가에 활용될 기초자료를 생산하고자 수행되었다.
본 연구는 중금속 노줄에 대한 분자생물학적 지표인 메탈로치오닌 유전자 발현에 미치는 디젤분진 의 영향을 조사한 것으로서 분자생물학적 지표를 이용한 위해성 평가 방법론 확립의 기초자료로 활용하고자 하였다 (박광식 등, 2003). 디젤분진과 메탈로치오닌 유전자 발현과의 관계를 조사한 연구는 아직까지 찾아보기 어려울 만큼 그 사례가 극히 드물었다.
5의 미세먼지 관리에 있어서 중요한 대상으로 인식되고 있다. 본 연구는 호흡경로로 노출될 경우 발암 및 활성산소를 생성하는 것으로 알려진 디젤 분진에 대한 특정 인구 집단의 노출 수준을 평가할 수 있는 분자생물학적 지표를 탐색하고자 시도되었으며 그 가운데 우선, 디젤 분진에 함유되어 있을 가능성이 높은 중금속류에 의한 영향을 평가할 수 있는 지표를 찾는 것을 목표로 수행되었다(Amakawa ef al., 2003; Wang et al., 2002; Ishihara et al., 2002).
디젤분진은 그 시료의 종류나 형태 즉, 발생원에 따라 그 함유성분 및 독성 발현이 매우 다양하다고 알려져 있다. 본 연구에서는 버스의 디젤 분진과는 별도로 소형 자동차의 디젤 분진 시료를 포집하여 수용성분획 및 유기성분획으로 분리하고 각 분획에 대한 메탈로치오닌 유전자 발현을 조사하였다. 그러나디젤분진 유기성분획은 메탈로치오닌 유전자를 발현시키지 못하였을 뿐만 아니라 수용성 분획도 버스 디젤 분진와는 다르게 메탈로 치오닌 유전자를 거의 발현시키지 않는 것으로 추정되었으며 (데이타미제시) 따라서 디젤분 진은 그 배출원에 따라 매우 다른 성질을 가질 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

제안 방법

5|1L 에 대해 실시하였으며 G3PDH를 대조 유전자로 사용하였다. MTT, MT_2에 대해 PG-RealCyber (PharmacoGenenchips Inc, Korea)를 형광물질로 사용하고, ABI prism 7000 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 유전자를 증폭시켰으며 MT-1 및 MT-2의 프라이머는 Table 1에 제시된 것과 동일한 프라이머를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간씩 총 40 cycle을 설정하고 Ct (Threshold Cycle) 값을 산출하 였다(Jiang et al.
8 이상이었다. PCR에 사용한 메탈로치오닌의 isoform MT-1, MT-2, MT-3, MT-4에 해당하는 프라이머는 기존의 문헌과 미국 국립의학도서관에서 제공하는 GenBank 데이 테베이스에서 제공한 사람의 메탈로 치오닌 유전자 cDNA 염기서열을 기초로 하여 제작하였으며, 각각의 염기서열은 Tableg] 나타내었다.
사용한 디젤 분진의 최고 농도에서 배양기간 동안 세포의 형태학적 변화나 괴사는 나타나지 않았다. 각 디젤 분진은 동일 농도에 대해 공히 3개씩 처리하였으며 양성대조군으로서 카드뮴 0.1 ppm 농도를 동일 시간 동안 처리하였다.
본 연구에서는 디젤버스 엔진으로부터 포집한 분진을 탈이 온수 로 추출한 것을 사용하였다. 디젤 분진의 노출은 세포의 형태학적 변화를 일으키지 않는 저농도 수준에서의 영향을 평가하였으며 사용한 디젤분진 5, 10, 50 ppm 농도로 6시간 동안 배양한 세포는 어떠한 형태학적 변화도 관찰되지 않았다. 세포가 손상될 경우 membrane bubble 이나, 세포의 위축, 배양용기로부터의 이탈, 세포질의응축 등 여러 부정적인 소견이 나타나는데 본 실험에서 사용한 농도의 범위 내에서는 세포손상과 관련된 특이적인 현상을 관찰할 수 없었다.
역전사 반응 (RT-PCR)은 RNA 주형 1 µg에 oligo dT primer, reverse transcriptase 및 각 nucleotide가 함유된 반응액 20µL에 대해 42℃로 60분간 실시한 후 94℃에서 5분간 가열함으로써 반응을 종료하였다. 생성된 각 MT isoform의 유전자 증폭(PCR) 은 RT-PCR에서 얻은 반응 생성물 2eL와 위에서 기술한 각 프라이머 쌍, Taq polimerase 및 각 nucleotide가 함유된 BioneerTM Kit를 사용하여 총 20µL의 반응액을 만든 후 95℃에서 1분 55℃에서 1분 72℃에서 1분간씩 조절되도록 하여 25회 반응시켰다. 마지막 25회 반응 이후에는 최종적으로 72℃에서 15분간 더 증폭시켰다.
1에 나타내었다. 실험은 정상 대조군과 카드뮴처리 양성대 조군으로 나누어 실시하였으며 카드뮴처리군은 0.1ppm의 카드뮴을 디젤 분진과 마찬가지로 6시간 동안 처리하였다. MT-l, MT-2의 경우 예상 크기의 DNA단.
디젤 분진의 세포 노출은 아래와 같이 실시하였다. 즉, 배양용기의 바닥을 거의 채울 정도의 일정 세포수가 되면 혈청을 넣지 않은 RPMI-1640 배지로 세척한 후 무혈청 배지 에 디젤분진농도가 5, 10, 50 ppm 되도록 가하고 6시간 동안 배양하였다. 사용한 디젤 분진의 최고 농도에서 배양기간 동안 세포의 형태학적 변화나 괴사는 나타나지 않았다.

대상 데이터

와 충분한 습도가 유지되는 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 모든 실험은 세포계대 배양 중 성장기의 세포를 사용하였으며 세포는 25 cm² 크기의 bottle type 배양용기 또는 직경 6 cm의 dish type 배양용기를 사용하였다.
, 2003).본 연구에서는 디젤버스 엔진으로부터 포집한 분진을 탈이 온수 로 추출한 것을 사용하였다. 디젤 분진의 노출은 세포의 형태학적 변화를 일으키지 않는 저농도 수준에서의 영향을 평가하였으며 사용한 디젤분진 5, 10, 50 ppm 농도로 6시간 동안 배양한 세포는 어떠한 형태학적 변화도 관찰되지 않았다.
인간 폐포의 상피세포에서 유래된 A549는 KCLB (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였으며 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 배지를 사용하여 5% CO₂와 충분한 습도가 유지되는 37℃ 세포배양기에서 배양하였다. 모든 실험은 세포계대 배양 중 성장기의 세포를 사용하였으며 세포는 25 cm² 크기의 bottle type 배양용기 또는 직경 6 cm의 dish type 배양용기를 사용하였다.

성능/효과

3). Real-time PCR에 의한 결과에 의하면 MT-1과 MT-2에 대한 Ct 값(Threshold cycle)이대조군에 비해 디젤분진 (10ppm) 및 카드뮴(0.1 ppm)을 처리한 경우가 대조군에 비해 낮아진 것으로 나타나 메탈로 치오닌 유전자 발현에 대한 RT- PCR결과를 보다 정량적으로 확인할 수 있었다 (Table 2).본 연구에서의 real-time PCR 결과는 향후 보다 다양한 농도에 대해 체계적으로 수행함으로써 정량성을 확보하기 위한 예비자료로 활용될 수 있을 것이다.
MT-3의 증폭산물의 예상 크기는 107bp였으며 MT-4의 경우는 108 bp였다. β-actin의 경우 정상 대조군이나 카드뮴처리 양성대 조군이나 관계없이 239 bp 크기의 밴드가 일정하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. Fig.
디젤 분진의 중금속 측정 결과는 Table 3에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이 비소(As) 및 수은(Hg)이 ppb 수준에서 검출되었으며 메탈로치오닌 유도에 대해 가장 민감한 작용을 나타내는 것으로 알려진 아연(Zn)이 151 ppm으로 가장 높게 나타났다. 크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 납(Pb)은 검출한계 이하의 농도로 나타났다.
본 연구에서는 버스의 디젤 분진과는 별도로 소형 자동차의 디젤 분진 시료를 포집하여 수용성분획 및 유기성분획으로 분리하고 각 분획에 대한 메탈로치오닌 유전자 발현을 조사하였다. 그러나디젤분진 유기성분획은 메탈로치오닌 유전자를 발현시키지 못하였을 뿐만 아니라 수용성 분획도 버스 디젤 분진와는 다르게 메탈로 치오닌 유전자를 거의 발현시키지 않는 것으로 추정되었으며 (데이타미제시) 따라서 디젤분 진은 그 배출원에 따라 매우 다른 성질을 가질 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 향후 버스, 트럭, 승용차 등 차종에 대한 디젤 분진과 같은 차종이라 하더라도 내구연한이나 엔진의 가속 정도 등에 따른 각종 디젤 분진을 포집하고 이들의 유해 특성에 관한 연구가 필요할 것으로 판단된다.
2는 A549세포에 디젤분 진을 5, 10, 50ppm으로 6시간 처리한 경우의 MT- 1 유전자 발현을 나타낸 것이다. 그림에서 나타난 바와 같이 디젤 분진의 처리 농도가 높아질수록 MT-1의 유전자 발현은 증가하는 것을 볼 수 있었다. 본 실험에서 처리된 카드뮴 0.
크롬(Cr), 카드뮴(Cd), 납(Pb)은 검출한계 이하의 농도로 나타났다. 본 연구에서 사용한 디젤 분진 시료의 메탈로치오닌 유전자 발현과 관련하여서는 아연이 가장 높은 기여도를 가질 것으로 판단되었다. 그러나 Fig.
MT-l, MT-2의 경우 예상 크기의 DNA단. 편 340 bp 및 186 bp가 증폭되는 것을 확인할 수 있었으며 정상 대조군에 비해 이들은 카드뮴처리 양성대 조군에서 유전자 발현이 증가되는 것으로 보아 본 산물은 메탈로치오닌 유전자가 증폭된 것으로 인정되었다. 그러나 뇌조직에 특이적으로 존재하는 것으로 알려진 MT-3와 메탈로치오닌의 또 다른 isoform인 MT-4의 경우에는 대조군과 카드뮴처리군에서 모두 유전자 증폭산물을 확인할 수 없었다.

후속연구

1 ppm)을 처리한 경우가 대조군에 비해 낮아진 것으로 나타나 메탈로 치오닌 유전자 발현에 대한 RT- PCR결과를 보다 정량적으로 확인할 수 있었다 (Table 2).본 연구에서의 real-time PCR 결과는 향후 보다 다양한 농도에 대해 체계적으로 수행함으로써 정량성을 확보하기 위한 예비자료로 활용될 수 있을 것이다.디젤분진은 그 시료의 종류나 형태 즉, 발생원에 따라 그 함유성분 및 독성 발현이 매우 다양하다고 알려져 있다.
MT는 중금속에 의해 유도되는 단백질이면서도 중금속과 결합하여 본질적으로 중금속의 독성을 완화하는 기능을 갖고 있으므로 MT자체가 생체내 기능에 어떤 부정적인 작용를 갖거나 나타낼 것으로는 사료되지 않는다. 지금까지의 연구결과로 보아 중금속에 노출되지 않은 세포에 비해 중금속 노줄 세포에선 MT가 신속하게 유도되므로 MT의 발현 정도를 보아 디젤 분진의 중금속의 노출 지표로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 중금속 단일 물질의 노출 형태보다는 다매체에 의한 중금속 노출의 현황을 생체 내에서 파악하거나 기기분석적 수단으로 측정하기 어려운 극미량 농도 수준에서 장기간 만성적으로 노출될 경우 나타날 수 있는 생물학적 영향을 판정하는 데 매우 유용할 것으로 판단된다.
지금까지의 연구결과로 보아 중금속에 노출되지 않은 세포에 비해 중금속 노줄 세포에선 MT가 신속하게 유도되므로 MT의 발현 정도를 보아 디젤 분진의 중금속의 노출 지표로 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 특히, 중금속 단일 물질의 노출 형태보다는 다매체에 의한 중금속 노출의 현황을 생체 내에서 파악하거나 기기분석적 수단으로 측정하기 어려운 극미량 농도 수준에서 장기간 만성적으로 노출될 경우 나타날 수 있는 생물학적 영향을 판정하는 데 매우 유용할 것으로 판단된다.
디젤분진과 메탈로치오닌 유전자 발현과의 관계를 조사한 연구는 아직까지 찾아보기 어려울 만큼 그 사례가 극히 드물었다. 향후 in vitro에서 노출된 디젤 분진의 양과 대기 중 디젤 분진의 양을 환산하는 방법의 도입, 개별 중금속에 대한 A549세포에서의 메탈로 치 오닌 유전자 발현 능력의 비교, 혼합 중금속의 영향(상승 또는 상가 작용) 및 디젤 분진의 중금속 함량과의 관계 등보다 다양한 연구를 통해 대기유해 물질인 디젤 분진이 인체에 미치는 위해성을 예측하고 판단하는데 기여할 수 있으리라 생각된다.
그러나디젤분진 유기성분획은 메탈로치오닌 유전자를 발현시키지 못하였을 뿐만 아니라 수용성 분획도 버스 디젤 분진와는 다르게 메탈로 치오닌 유전자를 거의 발현시키지 않는 것으로 추정되었으며 (데이타미제시) 따라서 디젤분 진은 그 배출원에 따라 매우 다른 성질을 가질 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 향후 버스, 트럭, 승용차 등 차종에 대한 디젤 분진과 같은 차종이라 하더라도 내구연한이나 엔진의 가속 정도 등에 따른 각종 디젤 분진을 포집하고 이들의 유해 특성에 관한 연구가 필요할 것으로 판단된다.

참고문헌 (24)

박광식, 구자민. 인간폐포세포 유래 A549세포주에서의Cadmium 처리에 의한 메탈로치오닌 유전자 발현, 환경독성학회지 2003; 18(1): 15-19

원문보기 상세보기
Amakawa K, Terashima T, Matsuzaki T, Matsumaru A,Sagai M and Yamaguchi K. Suppressive effects of diesel exhaust particles on cytokine release from human and murine alveolar macrophages. Exp. Lung Res. 2003; 29(3): 149-64

상세보기
Bunger J, Muller MM, Krahl J, Baum K, Weigel A, Hallier E and Schulz TG. Mutagenecity of diesel exhaust particles from two fossil and two plant oil fuels. Mutagenesis 2000; 15(5): 391-397

상세보기
Carero A, Hoet PH, Cerschaee L, Schoeters G and Nemery B. Genotoxic effects of carbon black particles, diesel exhaust particles , and urban air particulates and their extracts on a human alveolar epithelial cell line (A549) and a human monocytic cell line (THP-1). Environ Mol. Mutagen, 2001; 37(2): 155-63

상세보기
Coyle P, Philcox JC, Carey LC and Rofe AM. Metalloth-ionein: The multipurpose protein. Cellular and Mole-cular Life Science 2002; 59: 627-647

상세보기
Hiura TS, Li N, Kaplan R, Horwitz M, Seagrave JC and Nel AE. The role of a mitochondrial pathway in the induc-tion of apoptosis by chemicals extracted from diesel exhaust particles. J. Immunol. 2000; 165(5): 2703-2711

상세보기
Hiura TS, Kaszubowski MP, Li N and Nel AE. Chemicals in diesel exhaust particles generate reactive oxygen radi-cals and induce apoptosis in macrophages. J. Immunol. 1999; 163(10): 5582-5591

상세보기
Ishihara Y and Kagawa J. Dose-response assessment and effect of particles in guinea pigs exposed chronically to diesel exhaust; analysis of various biological markers in pulmonary alveolar lavage fluid and circulating blood. Inhal. Toxicol. 2002; 14(10): 1049-1067

상세보기
Jiang SS, Chen TC, Yang JY, Hsiung CA, Su IJ, Liu YL, Chen PC and Juang JL. Sensitive and quantitative detec-tion of severe acute respiratory syndrome coronavirus infection by real-time nested polymerase chain reaction. Clin. Infect. Dis. 2004; 38(2): 293-296

상세보기
Kagawa J. Health effects of diesel exhaust emissions; a mix-ture of air pollutants of worldwide concern. Toxicology 2003; 181-182, 349-353
Kodavanti UP, Moyer CF, Ledbetter AD, Schladweiler MC, Costa DL, Hauser R, Christiani DC and Nyska A. Inhal-ed environmental combustion particles cause myocardial injury in the Wistar Kyoto rat. Toxicol. Sci. 2003; 71(2):237-245

상세보기
Lambert E, Kille P and Swaminathan R. Cloning and sequ-encing a novel metallothionein I isoform expressed in human reticulocytes. FEBS Letters 1996; 389: 210-212

상세보기
Lee C, Jeon SH, Na JG and Park K. Sequence analysis of choriogenin H gene of medaka (Oryzias latipes) and mRNA expression. Environ. Toxicol. Chem. 2002; 21 (8): 1709-1714

상세보기
Madden MC, Dailey LA, Stonehuerner JG and Harris BD Responses of cultured human airway epithelial cells treated with diesel exhaust extracts will vary with the engine load. J. Toxicol. Environ. Health A 2003; 66(24): 2282-2297
Marano F, Boland S, Bonvallot V, Baulig A and Baeza-Squiban A. Human airway epithelial cells in culture for studying the molecular mechanisms of the inflammatory response triggered by diesel exhaust particles. Cell Biol. Toxicol. 2002; 18(5): 315-320
Nemmar A, Hoet PH, Dinsdale D, Vermylen J, Hoylaerts MF and Memery B. Diesel exhaust particles in lung acutely enhance experimental peripheral thrombosis. Circulation. 2003; 107(8): 1202-1208

상세보기
Palmiter RD, Findley SD, Whitmore TE and Dumam DM MT-III, a brainspecific member of the metallothionein gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 6333-6337

상세보기
Pfaffl MW, Gerstmayer B, Bosio A and Windisch W. Effect of zinc deficiency on the mRNA expression pattern in liver and jejunum of adult rats; monitoring gene expres-sion using cDNA microarrays combined with real-time RT-PCR. J. Nutr. Biochem. 2003; 14(12): 691-702

상세보기
Pohjola SK, Lappi M, Honkanen M and Savela K, Compari-son of mutagenicity and calf thymus DNA adducts formed by the paniculate and semivolatile fractions of vehicle exhausts. Environ. Mol. Mutagen. 2003; 42(1): 26-36

상세보기
Salvi S, Blomberg A, Rudell B, Kelly F, Sandstrom T, Holgate ST and Frew A. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am. J. Respir. Crit. Care Med, 1999; 153(3): 702-709
Scheepers PT and Bos RP. Combustion of diesel fuel from a toxicological perspective II. Toxicity. Int. Arch. Occup. Environ. Health. 1992; 64(3): 163-177

상세보기
Schmidt CJ, Jubier MF and Harmer DH. Structure and expression of two human metallothionein-I isoform genes and a related pseudogene. J. Biol. Chem. 1985; 260(12): 7731-7737
Wang HW, Chen FW, and Ueng TH. Induction of cytochro-mes P-450 1A1 and 1B1 by motorcycle exhaust parti-culate in human breast cancer MCF-7 cells. J. Toxicol. Environ. Health A 2002; 65(19): 1401-1417

상세보기
Watanabe N and Oonuki Y, Inhalation of diesel engine exhaust affects spermatogenesis in growing male rats. Environ. Health Perspect. 1999; 107(7): 539-544

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증