[논문]들깨잎 폴리페놀 산화효소의 pH 및 온도에 의한 영향

김유경; 김안근

제안 방법

보관하여 시간에 따른 활성을 비교하였다. 30℃에서 보관하였을 때 즉시, 1, 5, 10시간, 1, 2, 4, 5일 경과 후, 4℃에 보관한 경우에는 즉시, 1, 2, 4, 10, 20일 경과 후 효소활성 측정하였다. 동일한 온도 조건에서 보관한 효소액을 즉시 1, 2, 4, 30, 40, 50일 경과 후 SDS-PAGE를 이용하여 10mM t-butylcatechol을 기질로 효소의 활성단백질 띠를 확인하여 활성을 나타내는 띠의 변화를 관찰하였다.
Triton X-114를 첨가한 완충액으로 추출한 효소에 대하여 t-butylcatechol, 4-methylcatechol, chlorogenic acid, caffeic acid, pyrocatechol을 기질로 하여 pH를 변화시키면서 효소 반응액을 만들고, Table Ⅱ의 조건으로 분석하여 효소와 기질과의 반응산물의 양과 반응산물의 양상을 비교하였다. 그리고 동일조건으로 처리한 효소 반응액에 대해 흡광도를 측정하여 기질에 따른 활성을 비교하였다.
양과 반응산물의 양상을 비교하였다. 그리고 동일조건으로 처리한 효소 반응액에 대해 흡광도를 측정하여 기질에 따른 활성을 비교하였다.
30℃에서 보관하였을 때 즉시, 1, 5, 10시간, 1, 2, 4, 5일 경과 후, 4℃에 보관한 경우에는 즉시, 1, 2, 4, 10, 20일 경과 후 효소활성 측정하였다. 동일한 온도 조건에서 보관한 효소액을 즉시 1, 2, 4, 30, 40, 50일 경과 후 SDS-PAGE를 이용하여 10mM t-butylcatechol을 기질로 효소의 활성단백질 띠를 확인하여 활성을 나타내는 띠의 변화를 관찰하였다.
두 효소에 대하여 추출한 효소의 용량을 측정하고, 효소 활성과 단백질 양을 측정하여 총활성 및 비활성을 비교하여 추출 방법에 따른 수득율과 정제도를 구하였다. 효소 활성 측정방법은 spectrophotometer로 400 nm에서 홉광도를 측정하였으며, 5 mM t-butylcatechol를 포함하는 50 mM phosphate buffer(pH 6.
본 실험에서는 들깨잎을 재료로 하여 식물에 광범위하게 분포되어 있는 갈변효소인 PPOt triton X-114를 포함하는 buffer로 추출하여 부분정제한 효소를 사용하여 pH에 따른 영향을 알아보고 완충액으로만 추출한 효소와 triton X-114로 처리한 효소에 대하여 온도에 따른 영향을 검토하였다.
부분정제한 효소에 대하여 pH에 의한 영향을 기질을 달리하여 UV(290nm)와 400 nm 두 파장에서 고속액체크로마토: 그래프를 이용하여 검토하였다. 일반적으로 황색을 흡수하는 400 nm에서 측정된 기질산화물의 양은 4-methylcatechol의 경우에는 pH 5, caffeic acid, pyrocatechol, chlorogenic acid을 기질로 하였을 때는 pH 6에서 가장 많고 pH 7 이후 급격하게 감소하는 경향을 보인 반면, 사)utylcatechol의 경우에는 pH 5~7에서 기질산화물의 양이 크게 나타났다.
완충액으로 추출한 효소(b-PPO)와 triton X-114를 첨가한 완충액으로 추출한 부분정제효소(t-PPO)에 대하여 서로 다른 온도에서 보관하여 시간에 따른 활성을 비교하였다. 30℃에서 보관하였을 때 즉시, 1, 5, 10시간, 1, 2, 4, 5일 경과 후, 4℃에 보관한 경우에는 즉시, 1, 2, 4, 10, 20일 경과 후 효소활성 측정하였다.
이 논문에서는 들깨잎 PPO를 triton X-114를 첨가한 추출액으로 부분 정제하여 여러 기질에서 pH에 의한 영향을 검토하고, 부분 정제 효소와 조효소를 사용하여 보존기간과 온도에 따른 PPO 활성의 변화를 관찰하였다.
따른 수득율과 정제도를 구하였다. 효소 활성 측정방법은 spectrophotometer로 400 nm에서 홉광도를 측정하였으며, 5 mM t-butylcatechol를 포함하는 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 0.95ml와 효소액 50μl를 30℃에서 10분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid 0.2 ml를 가하여 반응을 정지시킨 후 기질산화에 따른 흡광도의 변화를 측정하였다. 효소활성 1단위는 400 nm에서 분당 흡광도 0.

대상 데이터

3% Triton X-114를 포함하는 50 mM 인산완충액(pH 6.0)을 사용하여 가용성 효소와 막결합 효소를 동시에 주줄하여 온도에 따른 분배로 부분정제한 효소(t-PPO)와 완충액으로만 추출한 조효소(b-PPO)를 실험에 사용하였다. Table Ⅲ에서 보는 바와 같이 triton X-114를 포함하는 완충액으로 추출한 효소는 완충액으로만 추출한 효소에 비하여 26% 정도 추출액의 양이 감소하였으며 , 효소활성은 5배 정도 증가하여 총활성을 비교하였을 때 수득율은 1.
기기로는 초저온냉동고는 Revco-70(USA) 제품을, 자외부-가시부 분광광도계는 Bechman DU-650(Germany) 제품을. 전기영동장치는 Novex Xcell II mini-cell(USA) 제품을, 고속액체크로마토그래프는 Waters(USA) 제품을 사용하였다.
시약은 ascorbic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, pyro-catechol, acrylamide, ammonium persulfate, N,N'-methylene bisacrylamide는 Sigma 제품을 사용하였으며 t-butylcatechol, 4-methylcatechol, triton X-114는 특급을 사용하였다.
실험에 사용한 들깨잎은 동절기에 서울 근교에서 재배된 잎 중 일반적으로 식용으로 사용하는 부위를 -70℃에서 냉동시켜 보관하여 실험에 사용하였다.
전기영동장치는 Novex Xcell II mini-cell(USA) 제품을, 고속액체크로마토그래프는 Waters(USA) 제품을 사용하였다.

이론/모형

001 을 변화시키는 광학밀도로 정하였다. 단백질양은 bovine serum Mbumin을 표준품으로 하여 TCA-Lowery법15)으로 측정하였다.

성능/효과

¹⁰⁾ 시금치의 thylakoid 에 존재하는 Protease의 경우 전구체의 분자량은 60kDa이고, 이를 4℃에 보관할 때 39kDa와 21kDa로 분해된다고 하였다.19) 들깨잎 PPO의 경우에도 48kDa가 우선적으로 검출되고 단백질 분해에 의해 42, 39 및 37kDa의 작은 분자량의 조각으로 분해되는데, 그 중 37kDa는 장기간 활성이 유지되는 것으로 보아 상당히 안정한 분해산물인 것으로 생각된다.
고속액체크로마토그래프법로 기질산화물을 측정한 결과와 동일파장에서 흡광도를 측정한 결과는 최적 pH에서는 일치한 결과를 보였으나, 흡광도를 측정하였을 때 pH가 높아짐에 따라 비교적 높은 수치를 유지하는 것은 PPO에 의한 기질의 산화로 인해 형성된 o-quinone이 pH의 증가와 더불어 감소하고 황색을 나타내는 다른 물질이 생성되는 것과 관련이 있는 것으로 생각된다. 4-Methylcatechol을 기질로 400nm에서 측정한 경우 pH 4일 때 retention time 2.5분에서 기질산화물이 확인, pH 5 에서 가장 크고 pH 6 이후 감소하면서 retention time 3.1 분에서 새로 갈변물질이 생성되었으며, 흡광도에서도 pH 6~7에서 비교적 크게 나타난 결과를 보였다. UV(290nm)에서 측정한 경우 400nm에서 분석한 결과에서 기질산화물이 1~3개 정도 나타난 것에 비해서, pH가 낮은 쪽에서는 검출되나 pH가 증가하면 감소하거나 소멸되는 물질, pH의 증가에 따라 증가하는 물질 등 다양한 양상으로 다수의 무색생성물이 검출되었다(Fig.
7) 또한 기질에 대한 PPO의 작용은 pH의 영향을 많이 받으며, pH 4 이하의 낮은 pH에서는 일반적으로 효소는 기질과 반응하여 무색의 생성물을 형성하고 280nm에서 검출이 가능하며, 높은 pH에서는 385~415 nm에서 황색을 띤 물질이 많이 생성된다고 한다.⁸⁾식물 중의 PPOfe 쉽게 분해된다고 알려져 있으며, 특히 정제 후에는 분해가 더욱 잘 일어난다고 한다. 이 효소에 염화나트륨, tween 20, 에칠렌글리콜 등의 안정화제를 첨가함으로써 분해를 억제하는 효과를 나타내고 안정화제가 제거되면 자체적으로 천천히 분해한다고 한다.
이 효소에 염화나트륨, tween 20, 에칠렌글리콜 등의 안정화제를 첨가함으로써 분해를 억제하는 효과를 나타내고 안정화제가 제거되면 자체적으로 천천히 분해한다고 한다.⁹⁾ Protease inhibitor를 사용하여 당근 중의 PPO를 정제한 경우 정제된 효소는 59,000의 분자량을 나타내었으나, 저해제가 없는 경우 더 작은 분자량의 형태로 전환되었다.¹⁰⁾
0)을 사용하여 가용성 효소와 막결합 효소를 동시에 주줄하여 온도에 따른 분배로 부분정제한 효소(t-PPO)와 완충액으로만 추출한 조효소(b-PPO)를 실험에 사용하였다. Table Ⅲ에서 보는 바와 같이 triton X-114를 포함하는 완충액으로 추출한 효소는 완충액으로만 추출한 효소에 비하여 26% 정도 추출액의 양이 감소하였으며 , 효소활성은 5배 정도 증가하여 총활성을 비교하였을 때 수득율은 1.3배 정도 커졌으며, 정제도는 약 6배 증가하였다.
Triton X-114를 포함하는 phosphate buffer로 추출한 부분정제효소 (t-PPO)와 buffer로만 추출한 조효소 (b-PPO)를 사용하여 시간경과와 온도에 따른 활성의 변화를 비교한 결과, 부분정제효소의 경우 4℃에서는 시간에 따른 활성의 변화가 거의 없었으며 30℃에서 incubation한 경우 4일 만에 활성이 소실되었고, buffer만으로 추출한 효소는 4℃와 30℃에서 5일 이내에 활성이 모두 소실되었다(Fig. 5).
pH에 의한 영향은 PPg 의한 기질산화물을 액체크로마토그래프로 분석한 결과 기질의 종류와 pH에 따라 기질산화물은 다소 차이를 보여서 4-methyl catechol에서는 pH 5, caffeic acid와 pyrocatechol, chlorogenic acid에서는 pH 6에서 가장 크고 pH 7 이후 급격히 감소한 반면, t-butylcatechol의 경우 pH 5~7에서 크게 나타났다. 흡광도로 PPO의 활성을 측정한 경우도 거의 비슷한 결과를 보였으나 pH가 높아지면서 기질생성물에 비해 다소 높은 값을 유지호}는 것은 크로마토그램에서 보는 바와 같이 생성된 0-quinone이 pH의 증가에 따라 원래의 기질생성물이 감소하고 다른 물질이 생성되는 것과 관련이 있는 것으로 보인다.
3). 고속액체크로마토그래프법로 기질산화물을 측정한 결과와 동일파장에서 흡광도를 측정한 결과는 최적 pH에서는 일치한 결과를 보였으나, 흡광도를 측정하였을 때 pH가 높아짐에 따라 비교적 높은 수치를 유지하는 것은 PPO에 의한 기질의 산화로 인해 형성된 o-quinone이 pH의 증가와 더불어 감소하고 황색을 나타내는 다른 물질이 생성되는 것과 관련이 있는 것으로 생각된다. 4-Methylcatechol을 기질로 400nm에서 측정한 경우 pH 4일 때 retention time 2.
일반적으로 황색을 흡수하는 400 nm에서 측정된 기질산화물의 양은 4-methylcatechol의 경우에는 pH 5, caffeic acid, pyrocatechol, chlorogenic acid을 기질로 하였을 때는 pH 6에서 가장 많고 pH 7 이후 급격하게 감소하는 경향을 보인 반면, 사)utylcatechol의 경우에는 pH 5~7에서 기질산화물의 양이 크게 나타났다. 동일한 조건에서 흡광도를 측정한 결과, t-butylcatechol, chlorogenic acid에서는 pH 전반에 걸쳐 활성이 유지되었고, pH 7 이후에도 비교적 높은 활성을 보였다 (Fig. 3). 고속액체크로마토그래프법로 기질산화물을 측정한 결과와 동일파장에서 흡광도를 측정한 결과는 최적 pH에서는 일치한 결과를 보였으나, 흡광도를 측정하였을 때 pH가 높아짐에 따라 비교적 높은 수치를 유지하는 것은 PPO에 의한 기질의 산화로 인해 형성된 o-quinone이 pH의 증가와 더불어 감소하고 황색을 나타내는 다른 물질이 생성되는 것과 관련이 있는 것으로 생각된다.
보존기간과 온도에 따른 활성의 변화를 관찰한 결과 triton X-114를 첨가한 완충액으로 추출한 PPO를 냉장에서 보관하였을 때 활성이 오래 유지되는 것을 확인하였다. 시간별로 전기영동하여 활성 띠의 변화를 살펴본 결과 처음에는 48kDa에서만 활성을 나타내었고, 이후 48kDa와 37kDa에서 활성을 유지하다가, 이후 37kDa에서 활성이 오래 지속되는 것으로 보아 48kDa의 활성을 나타내는 단백질이 mature PPO로 생각되며, 37kDa의 단백질은 상당히 안정적인 분해산물로 여겨진다.
활성이 오래 유지되는 것을 확인하였다. 시간별로 전기영동하여 활성 띠의 변화를 살펴본 결과 처음에는 48kDa에서만 활성을 나타내었고, 이후 48kDa와 37kDa에서 활성을 유지하다가, 이후 37kDa에서 활성이 오래 지속되는 것으로 보아 48kDa의 활성을 나타내는 단백질이 mature PPO로 생각되며, 37kDa의 단백질은 상당히 안정적인 분해산물로 여겨진다.
효소작용이 정지되는 온도인 4℃에 보관했을 때 전기영동 결과(Table Ⅳ)는 부분정제효소는 초기에는 48kDa에서만 활성이 나타나고 점차 42, 39, 37kDa에서 활성을 보이고, 기간이 더 경과하면 48kDa와 37℃kDa에서만 활성이 나타나고 이후에는 37 kDa 에서만 활성이 나타났다. 30℃에서는 48kDa의 활성단백질이 분자량이 작은 단백질로 분해되면서 2일까지는 상당히 높은 활성을 유지하다가 이후 급격히 활성이 소실되고 활성 띠도 나타나지 않았다.

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들깨잎 폴리페놀 산화효소의 pH 및 온도에 의한 영향
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