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문제 정의
- 본 연구는 pFF, cysteine, [J-mercaptoethanol, 성선자극호르몬 등 여러가지 체외성숙 촉진 물질이 첨가된 성숙배양액에 EGF 첨가가 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙에 효과적인지 또한 그 효과는 배양소적당 COC의 수에 영향을 받는지를 구명하고자 EGF의 첨가 유무와 배 양소적 당 COC수 (50개 또는 15개)를 조합한 2x2 요인시험을 실시했다. 도축 돼지의 난소에서 채취한 COCs 를 각 처리별로 mNCSU-23 에서 성숙배양하고 mTBM에서 운동 정자의 최종동도가 1x105 sperm/mL의 농도로 체외수정한 다음 NCSU-23에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다.
제안 방법
- 체외성숙용 배양액은 NCSU-23(Petters와 Wells, 1993)에서 0.4% BSA 대신 10% pFF를 넣고, 0.6 mM cysteine, 50 "M f-mercaptoethanol, 그리고 1mM dbcAMP를 첨가하여 사용했고, 호르몬은 10 IU/mL PMSG와 10IU/mL hCG를 첨가했다.
- 도축 돼지의 난소에서 채취한 COCs 를 각 처리별로 mNCSU-23 에서 성숙배양하고 mTBM에서 운동 정자의 최종동도가 1x105 sperm/mL의 농도로 체외수정한 다음 NCSU-23에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다.
- 미성숙 난포란의 체외성숙배양시 EGF 첨가와 배양소적당 COC의 수가 체외성숙, 체외수정 및 체외발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 10 ng/mL EGF 첨가 유무 및 배양소적 당 COC 수를 15개(150 uL) 및 50개(500 uL)로 조합한 2x2 요인시험을수행했다. 해당 처리에서 체외성숙을 유도한 다음, 정해진 절차와 방법으로 체외수정과 체외발달 배양을 실시하여 각 단계별로 각 처리의 영향을 조사하였다.
- C0 배양기에서의 배양조건은 배양 전기간 39℃, 5% CO2 및 포화 습도였다. 세정된 COCs는 실험목적에 따라 각 well당 4 0~50개(4-well dish) 또는 15개 내외(Repro C-1 plate)씩 넣어 호르몬과 dbcAMP가 첨가된 배양액에서 20~22시간 배 양한 다음, 호르몬과 db cAMP가 첨가되지 않은 배양액에서 22~24시간 배양하여 총 44~46시간 동안 배양함으로써 체외성숙을 유도했다.
- 부유된 정 자들을 회수하여 Makler counting chambereSefi-Medical Instruments, Israel)로 운동정자수를 계산한 다음, 운동정자의 최종동도가 1x10° sperm/mL가 되도록 체외수정용 배양액으로 다시 희석했다. 이 정액을 난자가 들어있는 90 uL 소적에 10 uL씩 주입하거나 45 uL 소적에 5 uL씩 주입한 다음, 39℃, 5% CO2 및 포화습도의 CO2 배양기 내에서 5~6시간 동안 난자와 함께 배양하는 방법으로 체외수정을 실시했다.
- 계속해서 Guinea pig complement 가 1:10으로 희석된 TL-Hepes-PVA 액에 두 가지 형광염 색 제 즉, bis- benzimide(Hoechst 33342)와 propi- dium iodide를 각각 10 ug/mL 씩 함께 용해시 켜 염색액을 준비하고, 여기에 앞서 처리된 배반포를 1 시간 정치한 다음, TL-Hepes- PVA 액으로 다시 가볍게 세척했다. 이렇게 형광염색된 배 반포를, slide glass 위의 3 uL 내외의 mounting 소적에 넣어 cover slip으로 덮고 매니큐어로 봉입한 다음, 형광현미경(200x)하에서 관찰했으며, 청색 형광을 내는 것은 ICM 세포로, 그리고 밝은 적색 또는 핑크색형광을 내는 것은 TE 세포로 판정했다(Fig. 1).
- 체 외 수정 이 종료된 추정 수정 란(putative embryos)을 반복당 9개씩 취하여 잔류 난구세 포와 투명대 에 부착된 정자를 제거하고 체외발달 배양액에 옮겨 10시간 동안 추가로 배양한 다음, Byun 등(1991)의 방법에 따라 난자급속염색법으로 염색하고 위상차현미경(Olympus AX70, 400x)하에서 정자의 침입,다정자수정, 웅성전핵 형성 등 수정 여부를 확인했다.
- 체외 성 숙배 양을 위해서는 4-well dish(Nunc, Denmark) 또는 Repro C-l plate (IFP, Japan)를 사용하여각 well당 500 fiL 또는 150 의 성숙용 배양액을 넣고 mineral oil로 덮은 다음 2시간 이상 전배 양을 실시 했다. 공시 된 COCs는 TL- Hepes-PVA와 성숙용 배양액으로 각각 3회 세정하여 미리 준비된 성숙배양액으로 옮겼다.
- 체외수정이 완료된 추정 수정란은 체외발달배양액으로 3회 세척한 다음, 500 pL 또는 150 uL의 배양액을 넣은 각 well에 추정 수정란을 well 당 30~40개씩 (4-well dish) 또는 15개 내외씩(Repro C-l plate) 넣고 39℃, 5% CO2 및포화습도의 배양기 내에서 배양하여 체외발달시켰다. 체외배양 개시후 약 44시간에 난할율과 약 144 시간에 배반포 발달율을 조사했다.
- 체외수정용 배양액은 2.0 mM caffeine sodium benzoate와 0.1% BSA(Sigma, Fraction V)를 첨 가한 mTBM(Abeydeem와 Day, 1997)을 사용했으며, 체외수정에 사용하기 전 48시간 이상 전배양을 실시하여 안정화시킨 다음 이용했다.
- 4% BSA(Sigma, Fraction V)가 함유된 NCSU-23(Petters and Wells, 1993)을 사용했다. 체외수정이 완료된 추정 수정란은 체외발달배양액으로 3회 세척한 다음, 500 pL 또는 150 uL의 배양액을 넣은 각 well에 추정 수정란을 well 당 30~40개씩 (4-well dish) 또는 15개 내외씩(Repro C-l plate) 넣고 39℃, 5% CO2 및포화습도의 배양기 내에서 배양하여 체외발달시켰다. 체외배양 개시후 약 44시간에 난할율과 약 144 시간에 배반포 발달율을 조사했다.
- 및 50개(500 uL)로 조합한 2x2 요인시험을수행했다. 해당 처리에서 체외성숙을 유도한 다음, 정해진 절차와 방법으로 체외수정과 체외발달 배양을 실시하여 각 단계별로 각 처리의 영향을 조사하였다.
대상 데이터
- 한편, Prochazka 등(1997) 은 6-7 mm의 난포에서 채취한 COCs만이 EGF에 의한 팽화율이 높았다고 하였고, Kolena 등(2001)도 5~8 mm의 난포에서 유래한 COCs를 이용했을 때, 약 71%가 팽화되었다고 하여 본 시험과 다소 다른 결과를 보고했다. 그러나 그들 실험에 사용된 배양액이 모두 10% FBS가 첨가된 TCM-199였던데 비해 본 실험에서는 10% pFF가 첨가된 mNCSU-23을사용했다. pFF가 난구세포의 팽화율을 증가시킨다는 것은 이미 Yoshida 등(1990)과 Abeydeera 등 (1998)의 보고로 밝혀진 바 있다.
- 도축장에서 체중 HO kg 전후의 미경산돈 난소를 도축 직후 회수하여 35~38℃의 멸균 생리식염수(0.9% NaCl)로 2회 세척한 다음, 같은 액으로 채운 보온병에 침지하여 60분 이내에 실험실로 운반하였고 실험실에서 신선한 생리식염수로 다시 2~ 3회 난소를 세척한 다음 COCs를 채취했다. COCs 는 직경이 3~6 mm의 포상난포로부터 19 게이지 주사침이 장착된 10 mL 주사기로 난포액과 함께 흡인한 다음, 37℃의 가온 블록에 미리 준비해둔 15 mL 원심분리관(Coming, USA)으로 옮겼다.
- 돼지난포액(pFF)은 COCs 채취시와 같은 방법으로 회수하여 실험실로 운반한 돼지 난소의 3~6 mm 포상난포에서 채취하여 4℃의 냉수에 미리 준비해둔 15 mL 원심분리관에 옮겼다. 이어서 4℃, 3, 000 rpm에서 30분간 원심분리한 다음 상징액만을 분리하여 2.
- 이 원심 분리 관을 10분간 정치시켜 침전된 pellet을 회수하고 35x10 mm petri-dish(FALCON, USA)에서 mTL- Hepes-PVA(Long 등, 1999)로 희석하였다. 실체현미경(Olympus SZH- 10, Japan)하에서 난구세포가 2~3층 이상 치 밀하게 붙고 난자의 세포질이 균일한 COCs만을 선별하여 실험에 공시했다.
데이터처리
- 본 연구에서는 각 실험별로 처리당 4회 이상 반복 시험을 수행했으며, 조사된 성적은 실험계획에 따라t-검정 또는 분산분석(ANOVA)을 실시한 다음, 유의성이 인정된 것에 대해서는 LSD에 의하여 처리 간 차이를 구분했다.
이론/모형
- 성숙배 양이 끝난 난자의 일부(반복당 6개 또는 9 개)를 Byun 등(1991)의 방법에 따라 난자 급속염색법으로 염색하고 위상차현미경 (Olympus AX70, 400~800)하에서 Hunter와 Polge(1966)의 방법에 준하여 핵성숙 단계를 판정했다.
- 성숙배양이 끝난 COCs를 실체현미경하에서 Abeydeera 등(2000)의 기준에 의거하여 팽화 정도에 따라 다음과 같이 5 가지로 분류하여 판정했다. 즉 C0는 가시적인 확장이 거의 없거나 전혀 없는 것, C1 은 난구세포층의 약 25% 정도가 팽화된 것, C2는 약 50% 정도가 팽화된 것, C3는 약 75% 정도가 팽화된 것, C4는 거의 100% 팽화된 것 등이다.
- 확장 배반포의 ICM 세포수와 TE 세포수를 조사하기 위해서 Machaty 등(1998)의 방법에 준하여 이 중 형광염색을 실시하였다. 발달배양 개시후 약 144 시 간부터 168시간 사이에 충분히 확장된 배 반포의 투명 대를 0.
성능/효과
- 1. 대조구와 EGF 첨가구에서 C4군의 COC 비율이 각각 41%와 82%로써 EGF 첨 가가 난구 세포의 팽화 정도를 크게 향상시키는 것으로 나타났으나, 난핵포 붕괴율과 핵성숙율에서는 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC수에 따른 차이가 나타나지 않았고 두 요인간 상호작용도 없었다.
- 2. 정자 침투율, 웅성전핵 형성율 및 다정자수정발생율에서도 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC수에 따른 차이가 유의적인 것이 아니었고, 두 요인간 상호작용 역시 유의적이지 않았다.
- 3. 난분할율에서는 처리간에 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 배반포 발달율, 배반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총세포수에서는 EGF 첨가구가 모두 유의적으로 높았다(p< 0.01). COC수에 따른 차이 나 두 요인간 상호작용에서는 유의성이 인정되지 않았다.
- COCs의 난구세포간에 그리고 난구세포와 난자 사이에 존재하는 광범 위한 세극결합(gap junction)을 통해서 난자는 성장과 성숙분열 억제를 조절하는 여러가지 인자에 노출될 수 있는 것으로 알려졌다. Chen 등(1994a)은 성선자극호르몬에 의해 세극결합의 대부분이 없어지면 난자는 그동안 억제되어 있던 성숙분열을 재개하게 되고, 난구세포 사이에는 점성 기질이 침적되는더], 그 결과 난구 세포 덩어리의 부피가 20~40배 증가함으로써 난구 세포가 팽화된다고 보고했다.
- 결과적으로 돼지 미성숙 난포란을 mNCSU-23에서 성숙배양할 때 io ng/mL EGF 첨가는 성숙배양단계에서 난구세포의 팽화를 더욱 심화시키고, 발달 배 양단계 에서 배 반포의 세 포수와 배 반포발달율을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 3%로 EGF 첨가구가 다소 높았으나 유의적인 차이는 아니었고, COC 수 사이에서는 서로 비슷한 결과를 나타냈다. 그러나 추정수정란대 및 분할란대 배반포발달율, 배반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총 세포 수는 EGF 첨가구가 각각 18.4%, 31.3%, 4.7개, 36.0개, 40.7개로 대조구의 21.3%, 10.7%, 3.7개, 27.7개, 31.4개보다 유의적(P<0.01)으로 높았다. 한편 COC 수 사이에는 어느 것에서도 유의적인 차이를 나타내지 않았고, EGF와 COC 수의 상호작용 역시 모든 조사항목에서 인정되지 않았다.
- 난핵포붕괴율은 87.3-91.5%, 핵성숙율은 77.2-84.1% 로 나타남으로써 EGF 첨 가 여부나 COC 수에 따른 차이를 보이지 않았고 EGF와 COC 수의 상호작용도 없었다.
- 대조구와 EGF 첨가구에서 C3 이상의 COCs가 각각 85%와 96%, C4의 COCs가 각각 4]%와 82% 로써 EGF 첨가에 의해 C4의 COCs가 크게 증가하였다.
- pFF가 난구세포의 팽화율을 증가시킨다는 것은 이미 Yoshida 등(1990)과 Abeydeera 등 (1998)의 보고로 밝혀진 바 있다. 또 본 실험에서는 성숙배양 초기 약 20~22시간 동안 PMSG를 첨가시켰기 때문에 EGF를 첨가하지 않은 대조 구에서도 비교적 높은 팽화율(C3 이상 85%)을 나타냈다. 이러한 결과는 성선자극호르몬 첨가시 COCs의팽화율은 100%였다는 Ding과 Foxcroft(1994)의 보고, FSH에 의한 3~6 mm 난포 유래 COCs의 팽화율이 약 93%였다는 Prochazka 등(1997)의 보고, eCG가 첨가된 성숙배지에서 3~6 mm 난포 유래 COCs의 팽화율은 85.
- 본 실험에서는 대조구와 EGF처리구에 모두 성선자극호르몬과 난포 액을 첨가했으므로, 이러한 결과는, FSH나 EGF가 각각 난자의 핵성숙과 세포질 성숙에 효과적이지만 FSH와 EGF를 동시에 첨가할 때 상승효과는 없었다는 Sommer 등(1992)과 Singh 등(1993, 1997)의 보고나 난포액이 들어있는 배양액에서 FSH가 핵성숙, 웅성전핵 형성 및 난분할율을 증가시키는 효과가 더 커진다는 많은 보고(Naito 등, 1988; Yoshida 등, 1992; Rath 등, 1995; Tao 등, 1995; Wang과 Niwa, 1995)와 일치하는 것이었다. 또한 체외발달 배양한 결과, 난분할율에서는 유의 적 인 차이를 보이지 않았지 만 EGF 첨 가가 체외발달을 확실히 개선시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 EGF의 첨가로 난분할율과 배반포발달율이 각각 52%에서 60%, 22%에서 37%로 높아졌으며 배반포의 세포수도 25.
- 본 실험의 결과에서 핵성숙율, 정자침투율, 웅성전핵형성율 등에서 EGF 첨가효과가 인정되지 않았다. 이러한 결과는 성선자극호르몬 존재시 EGF 첨가가 핵성숙에 영향을 주지 않았다는 Coskun과Lin(1994) 및 Ding과 Foxcroft(1994)의 보고와 일치하는 것이었다.
- Table 3과 같다. 정자침투율은 EGF 첨가 구에서 88.9%, 대조구에서 78.8%로 EGF 첨가구에서 다소 높았으나 유의적인 차이는 아니었으며, 배양소적당 COC 50개구에서 85.6%, 15개구에서 77.1%로 50개구가 다소 높았으나 이것 역시 유의적인 차이는 아니었다. 또 웅성전핵 형성율과 다정자수정발생율도 각각 80.
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