돼지를 이용한 이종간 장기 이식은 차세대 장기 공급 부족 문제를 해결해 줄 수 있는 가능성을 제공해준다. 그러나 돼지 장기를 이용한 이종간 장기 이식은 면역학적인 문제 외에도 가축 유래 전염성 병원균에 대한 안전성 문제가 심각하게 고려되어지고 있다. 대부분의 외인성 병원균은 무균 사육환경을 통해 제어되는 반면 내인성레트로 바이러스(Endogenous Retrovirus, PERVs)는 germ line을 통해 전파됨으로 사육 조건으로 해결할 수는 없다. 본 연구는 이종간 장기 이식용 무균 돼지 생산시 가장 문제가 되는 PERVs에 대한 분포를 알아보고자 국내 돼지(Landrace, Berkshire, Yorkshire, Duroc)의 genome 내 PERVs 분포와 유전자 염기 서열을 비교하였다. 모든 공시 돼지(20두)의 genomic DNA로부터 PCR을 이용하여 PERV A/B/C와 PERV-E의 존재를 확인하였다. pol 유전자 일부 염기 서열 분석 결과 같은 품종내 개체간 또는 품종간 상동성이 99.1과 98.8%로 매우 높게 나왔다. 본 연구의 결과 모든 국내 돼지 유전자내에 PERV A/B/C와 PERV E가 provirus 형태로 많이 존재하며 바이러스간의 높은 상동성은 바이러스 제어에 많은 잇점으로 작용하리라 사료되며 아직 밝혀지지 않은 내인성바이러스에 대한 연구가 요구되어진다. 그러므로 본 연구의 자료는 이종간 장기 이식용 무균돼지 생산 시 PERVs 를 제어하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
돼지를 이용한 이종간 장기 이식은 차세대 장기 공급 부족 문제를 해결해 줄 수 있는 가능성을 제공해준다. 그러나 돼지 장기를 이용한 이종간 장기 이식은 면역학적인 문제 외에도 가축 유래 전염성 병원균에 대한 안전성 문제가 심각하게 고려되어지고 있다. 대부분의 외인성 병원균은 무균 사육환경을 통해 제어되는 반면 내인성 레트로 바이러스(Endogenous Retrovirus, PERVs)는 germ line을 통해 전파됨으로 사육 조건으로 해결할 수는 없다. 본 연구는 이종간 장기 이식용 무균 돼지 생산시 가장 문제가 되는 PERVs에 대한 분포를 알아보고자 국내 돼지(Landrace, Berkshire, Yorkshire, Duroc)의 genome 내 PERVs 분포와 유전자 염기 서열을 비교하였다. 모든 공시 돼지(20두)의 genomic DNA로부터 PCR을 이용하여 PERV A/B/C와 PERV-E의 존재를 확인하였다. pol 유전자 일부 염기 서열 분석 결과 같은 품종내 개체간 또는 품종간 상동성이 99.1과 98.8%로 매우 높게 나왔다. 본 연구의 결과 모든 국내 돼지 유전자내에 PERV A/B/C와 PERV E가 provirus 형태로 많이 존재하며 바이러스간의 높은 상동성은 바이러스 제어에 많은 잇점으로 작용하리라 사료되며 아직 밝혀지지 않은 내인성바이러스에 대한 연구가 요구되어진다. 그러므로 본 연구의 자료는 이종간 장기 이식용 무균돼지 생산 시 PERVs 를 제어하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
Xenotransplantation of porcine organs has the potential to overcome the severe. shortage of human tissues and organs available for human transplantation. The swine represents an ideal source of such organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities...
Xenotransplantation of porcine organs has the potential to overcome the severe. shortage of human tissues and organs available for human transplantation. The swine represents an ideal source of such organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities to the human. However, this procedure also carries with a number of safety issues relating to the zoonotic infections. Porcine endogenous retrovinJses(PERVs), \Wich are germ line transmitted and persist without symptoms in the pigs, are most concerning zoonotic viroses. In order to analyze the prevalence of PERV in domestic pigs, four kinds of pigs'(Landrace, Berkshire, Yorkshire, and Duroc) genomic DNA were isolated from their hair follicles. PCR analysis was carried out for detection of PERVs using subgroup A/B/C and E pol sequence primers. All pigs (20 heads) tested had high copy number of PERVs within genomes. Subgroup A/B/C and E pol gene sequences from 20 isolates were determined by direct sequencing. Sequence analysis showed pol sequences are highly conserved among intra- and inter-subspecies(99.l and 98.8%, respectively). As a first report of PERV prevalence in Korea pigs, our data would be the basic concepts of PERV transmission study in xenotransplantation.
Xenotransplantation of porcine organs has the potential to overcome the severe. shortage of human tissues and organs available for human transplantation. The swine represents an ideal source of such organs because of their plentiful supply and their numerous anatomical and physiological similarities to the human. However, this procedure also carries with a number of safety issues relating to the zoonotic infections. Porcine endogenous retrovinJses(PERVs), \Wich are germ line transmitted and persist without symptoms in the pigs, are most concerning zoonotic viroses. In order to analyze the prevalence of PERV in domestic pigs, four kinds of pigs'(Landrace, Berkshire, Yorkshire, and Duroc) genomic DNA were isolated from their hair follicles. PCR analysis was carried out for detection of PERVs using subgroup A/B/C and E pol sequence primers. All pigs (20 heads) tested had high copy number of PERVs within genomes. Subgroup A/B/C and E pol gene sequences from 20 isolates were determined by direct sequencing. Sequence analysis showed pol sequences are highly conserved among intra- and inter-subspecies(99.l and 98.8%, respectively). As a first report of PERV prevalence in Korea pigs, our data would be the basic concepts of PERV transmission study in xenotransplantation.
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문제 정의
본연구는이종간장기이식용무균돼지개발에서 가장 문제되는 PERVs 제어에 대한 기초 자료로 국내 돼지의 PERVs 분포를 조사하였다 . 즉 , 국내 주요 대표적인 네 종류의 돼지를선정하여각종돈별 5 마리의돼지모근으로부터 추출한 genomic DNA 를 사용하여 유전자증폭을통해 PERVs 의분포및유전자염기서열비교하였다.
제안 방법
RT 효소는한가닥의 RNA 를 genome 으로 지닌 모든 레트로바이러스에 존재하며 초기 감염 후 RNA를 tem plate 로 ds DNA 를 만든 후 숙주의 chromo- somal DNA 에 들어가는 것으로 바이러스의 생존에 제일 중요한 효소이다 (Coffin 등 , 1997). Fig. 1 에서와 같이 각각 약 450 bp 와 650 bp PCR 산물을 겔에서 분리 정제 후 클로닝과정없이염기서열을분석하였다 . 450 bp PCR 산물은 PERVs 의 pol 유전자 4047 에서 4520 위치 (GeneBank Accession No.
PCR 반응을 위한 reaction mix는 10×buffer 와 1.5mM MgCl2, dNTPs 1mM, primer는 각각 10pM, Taq2.5unit 로조성되었으며 , PCR 조건은 GeneAmp PCR system 9700(Perkin-Elmer Cetus, Foster City, California) 를 이용하여 94 30 초간 denaturation 반응을 시킨 후 , 50 1 분간의 annealing 반응 , 그리고 2 분간의 extension 반응을 35cycle 실시하고 , 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한후 증폭산물을 확인하였다.
data-checked="false">그러나도살장이아닌일반농장에서여러종의돼 지로부터 혈액을 채혈하는 경우 안전사고 data-checked="false">및기술적인문제가동반되기때문에모근을채취 하여 모근으로부터 gDNA 를 추출하였다 . 평균 12 개의 모발에 붙어있는 모근으로부터 분리된 gDN는 약 0.
각 종돈의 모근으로부터 분리된 염기서열들은 Genbank 에등록되어있는 PERVs pol을 ref- erence strain 으로 MegAlign(DNASTARInc. USA)을 이용하여 alignment 를 실시하여 국내 돼지종돈별 , 종내 개체별 PERV pol gene 염기서열을 상호비교를 하였다.
1 은 subgroupA 와 B, C 의 pol 지역을 인지하는 primers 를사용하여약 450bp 의 subgroups A/B/C pol 유전자와 subgroup E 의 pol 지역을 인지하는 primers 를 사용하여 650 bp 의 sub- group E pol 유전자 일부를 증폭하였다 . 같은 반응 tube 에 4개의 primers 를동시에넣어반응함으로 subgroup E 와 ABC 간의 상대적 copy 수를 비교할 수 있게 하였다 . Subgroup E는 hu- manendogenous retrovirusEtype 와유사한바이러스로 Mang 등 (2001) 에의해 PERV-E 로명 명된것으로 분석된 네 품종(Landrace, Yorkshire, Berkshire, Duroc) 의 모든 검체( 각 5 두) 로부터분리되었다 .
선정된 공시동물에서 모발을 채취하여 4 icebox 에 실험실로 운송 한 후 QIAamp Mini Kit(Qiagen , Valencia, CA) 를 이용하여 gDNA 를 추출하였으며 , PCR 실험시까지 25 에보관하였다 .
. 즉 , 국내 주요 대표적인 네 종류의 돼지를선정하여각종돈별 5 마리의돼지모근으로부터 추출한 genomic DNA 를 사용하여 유전자증폭을통해 PERVs 의분포및유전자염기서열비교하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 공시재로는 경기도 K 종돈 농장에서 사육되고 있는 Yorkshire 종 5 두와 Landrace 종 5 두 그리고 , 충남 C 종돈장에서 사육하고 있는 Duroc 종 5 두그리고 Berkshire 종 5 두 총 20 두를 공시동물로 선정하였다 . 선정된 공시동물에서 모발을 채취하여 4 icebox 에 실험실로 운송 한 후 QIAamp Mini Kit(Qiagen , Valencia, CA) 를 이용하여 gDNA 를 추출하였으며 , PCR 실험시까지 25 에보관하였다 .
이론/모형
정제된 PCR 산물은 클로닝 과정을 거치지 않고 각각의 PCR 에 사용된 primers 를 이용하여 direct sequencing 방법으로 염기 서열을 확인하였다 (ABI sequencer).
성능/효과
PERVs 의 pol 유전자 염기 서열은 유전자가코딩하는부분이 RT 효소이기에염기서열상동성이높은것으로보고되었다 .RT 효소는한가닥의 RNA 를 genome 으로 지닌 모든 레트로바이러스에 존재하며 초기 감염 후 RNA를 tem plate 로 ds DNA 를 만든 후 숙주의 chromo- somal DNA 에 들어가는 것으로 바이러스의 생존에 제일 중요한 효소이다 (Coffin 등 , 1997).
Lane 1과 10 은 각각 positive 와 nega tive control 로 돼지 세포주 YK-1과 사람 세포주 Hela 세포의 gDNA 를 사용한 결과이다 . 본 결과를 통해 사람에는 존재하지 않은 PERVs 가 품종과 개체에 관계없이 모든 돼지의 genome 안에 여러 copy 로 존재함을 알 수 있었고 이종간 장기 이식시 고려되어져야 할중요한 zoonotic virus 임을알수있었다 . 각 품종별 PERV copy 수 측정은 southern blot hybridization 과 realtimePCR 을통해정량적으로분석이 가능하다 .
data-checked="false">그러나도살장이아닌일반농장에서여러종의돼 지로부터 혈액을 채혈하는 경우 안전사고 data-checked="false">및기술적인문제가동반되기때문에모근을채취 하여 모근으로부터 gDNA 를 추출하였다 . 평균 12 개의 모발에 붙어있는 모근으로부터 분리된 gDN는 약 0.5 ug 으로 PCR 을 수행하는데 충분한 양으로 존재하였다 . 이러한 방법은 이미돼지의 PSS 유전자 측정에 사용된 바 data-checked="false">있으며돼지뿐만아니라여러가축으로부터유전자증 폭용 검체를 회수하여 유전자 검사를 data-checked="false">요하는시험에적절히이용되어질수있으리라사료된 다.
후속연구
그러나 PERV-E 를 기준으로 A/B/C 의 양이 3 배 수준으로 증폭됨을 통해 품종별 copy 수의 차이는 거의 없는 것으로 추정된다 . 돼지의유전자에존재하는 PERVs 의 정확한 copy 수측정외에도 PERV 의안 전성을 위해서는 아직까지 보고된 바 없는 새로운 종의 PERVs 에 대한 연구도 필수적으로 수행되어야 할 것으로 사료된다.
본연구는국내주요돼지를대상으로PERVs 의분포와일부유전자를분석한것으로본자 료는 이종간 장기 이식용 무균돼지 생산 시 PERVs 를 제어하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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