선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 VTG mRNA의 발현을 추적함으로서 VTG 항체를 이용하여 추적하는 기법 보다 좀더 신속하고도 정교하게 xenoestro- gen에 의한 VTG 유도현상을 추적 할 수 있는 연구기법은 시도되고 있지 않고 있다. 본 연구는 한국의 담수환경내에서 xenoestrogen 오염을 정밀하게 추적하기 위한 기술 개발의 일환으로 누치의 VTG cDNA 염기서열에 근거한 reverse transcription and polymerase chain reaction(RT-PCR) 시험법을 최적화하였다.
제안 방법
- coli DH5a) 에 형 질도입 하였다. Amphicilin 저항성 positive clone을 선발하여 plas-mid를 분리하고 제한효소 처리를 통해 insert의 삽입 유무를 전기영동을 통해 확인한 다음 확인된 clone의 경우 플라스미드를 자동염기서열 분석기를 이용 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with Ampli- Taq DNA polymerase법으로 염기서열을 분석하였다.
- 1 ㎍을 표준조건에서 40회 증폭하였다. VTG mRNA의 상대적 정량을 위한 RT-PCR 실험에서는 PCR 반응산물의 양을 Gel documentation system (Vilber Lourmat, France)을 이용하여 밴드의 강도를 측정한 후 PCR 반응 회수-반응량 곡선을 얻었다. 차후 정 량적 분석을 위해 PCR cycle 수의 증가에 따라 PCR 반응산물의증가가 뚜렷한 구간을 설정하였다 (Gye and Ohsako, 2003).
- 각 시료에 존재하는 cDNA의 상대적인 정량을 위해beta actin을 증폭하여 비교하였다. beta actin primer는 5'-ATGGATGATGAAATTGCCGCACTTG-3, (forward), 5'-CTGGGTCATCTTCTCCCTGTTGGC-3, (reverse) 롤사용하였다 (Lee et al, 2000).
- beta actin primer는 5'-ATGGATGATGAAATTGCCGCACTTG-3, (forward), 5'-CTGGGTCATCTTCTCCCTGTTGGC-3, (reverse) 롤사용하였다 (Lee et al, 2000). 간 cDNA로 부터 VTG 및 beta actin mRNA 발현 정량을 위한 최적 annealing 온도를 확인하기 위해 암컷 간을 이용하여 제작한 cDNA 를 이용하여 55.0~64.81의 온도 구배 조건에서 40회 PCR을 수행하였다. 최적의 PCR 반응 회수를 결정하기위해 annealing 온도 55℃에서 12~40cycle의 PCR을진행하였다.
- 최적의 PCR 반응 회수를 결정하기위해 annealing 온도 55℃에서 12~40cycle의 PCR을진행하였다. 고안한 primer에 의한 genomic DNA의 증폭을 확인하기 위해 TRIzol 용액을 사용하여 분리한 genomic DNA 0.1 ㎍을 표준조건에서 40회 증폭하였다. VTG mRNA의 상대적 정량을 위한 RT-PCR 실험에서는 PCR 반응산물의 양을 Gel documentation system (Vilber Lourmat, France)을 이용하여 밴드의 강도를 측정한 후 PCR 반응 회수-반응량 곡선을 얻었다.
- 누치 VTG의 RT-PCR에 이용할 수 있는 염기서열을확보하고자 Blast 2 program을 이용하여 잉어 (Cyprinus carpio)와 제브라피시 (Danio rerio)의 VTG cDNA 염 기서열 상동성을 비교한 후 PCR primer design program (Oligo software)를 이용하여 VTG primer는 5—TGGTA- TCTTGCCAACAGCAG-3, (forward), 5'-GGCAGAGCC- TCCA CCTTGTA-3' (reverse)를 제작하였다 (Fig. 3). 역전사 제조한 간조직의 cDNA 0.
- 누치의 두부를 타격하여 도살한 후 복강을 해부하여 암컷 및 수컷의 간 조직을 절취하였다. 분리된 간 조직은20배 부피의 TRIzol 용액 (Life Technologies, USA)에 옮긴 후 4℃에서 전동마쇄기 (Polytron, USA)를 이용하여균질화 하였다.
- VTG mRNA 발현의 분석에는 전장 300 mm 이상의 개체를 사용하였다. 수컷에서 VTG의 유도를 위해 corn oil에 희석한 17 beta estradiol 을 10 mg kg-1 체중 농도로 복강 주사하였다. 주사 2 일후 RNA 분석에 공시하였다.
- 어류 vitellogenin (VTG) cDNA의 염기서열 상동성에근거하여 고안한 RT-PCR primer를 이용하여 누치 VTG mRNA의 발현 검출에 필요한 RT-PCR 시험법을최적화하였다. 누치 암수 성어를 이용하여 조사한 결과수컷은 암컷의 2-16배에 상당하는 미량의 VTG mRNA를발현하였다.
- 1% DEPC로 처리된 증류수에 3mgmL-1 농도로용해하였다. 역전사 반응에는 murine leukemia virus [MuLV] reverse transcriptase (Applied Bioscience, USA)을 이용하였고 제조사의 용법에 따라 RNA 1 ㎍을 이용하여 20 ㎕ 부피의 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다.
- 3). 역전사 제조한 간조직의 cDNA 0.5 ㎕을 Ex Taq (Takara, Japan) PCR kit를 표준 PCR 조건 (20 mM Tris, pH 8.4, 50 mM KCl, 1.25 u i-Taq, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCb, 0.5 pM each primer, 1/20 RT reaction)에서 증폭하였다. 각 PCR 단계는 denaturation: 95℃, 30 sec; annealing: 55℃ 60 sec; extension: 72℃, 30 sec로 하였고 i-Cycler(BioRad, USA)를 이용하였다.
- 증폭산물의 염기서열을 결정을 위해 RT-PCR 반응산물은 2% agarose gel에서 전기영동한 후 ethydium bromide 염색하여 해당 밴드를 오려내어 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)로 DNA를 추출하였다. 정제한 DNA 절편은 T vector에 클로닝 하여 competent cell (E. coli DH5a) 에 형 질도입 하였다. Amphicilin 저항성 positive clone을 선발하여 plas-mid를 분리하고 제한효소 처리를 통해 insert의 삽입 유무를 전기영동을 통해 확인한 다음 확인된 clone의 경우 플라스미드를 자동염기서열 분석기를 이용 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with Ampli- Taq DNA polymerase법으로 염기서열을 분석하였다.
- 분리된 간 조직은20배 부피의 TRIzol 용액 (Life Technologies, USA)에 옮긴 후 4℃에서 전동마쇄기 (Polytron, USA)를 이용하여균질화 하였다. 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리한 후 0.1% DEPC로 처리된 증류수에 3mgmL-1 농도로용해하였다. 역전사 반응에는 murine leukemia virus [MuLV] reverse transcriptase (Applied Bioscience, USA)을 이용하였고 제조사의 용법에 따라 RNA 1 ㎍을 이용하여 20 ㎕ 부피의 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다.
- 각 PCR 단계는 denaturation: 95℃, 30 sec; annealing: 55℃ 60 sec; extension: 72℃, 30 sec로 하였고 i-Cycler(BioRad, USA)를 이용하였다. 증폭산물의 염기서열을 결정을 위해 RT-PCR 반응산물은 2% agarose gel에서 전기영동한 후 ethydium bromide 염색하여 해당 밴드를 오려내어 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)로 DNA를 추출하였다. 정제한 DNA 절편은 T vector에 클로닝 하여 competent cell (E.
- VTG mRNA의 상대적 정량을 위한 RT-PCR 실험에서는 PCR 반응산물의 양을 Gel documentation system (Vilber Lourmat, France)을 이용하여 밴드의 강도를 측정한 후 PCR 반응 회수-반응량 곡선을 얻었다. 차후 정 량적 분석을 위해 PCR cycle 수의 증가에 따라 PCR 반응산물의증가가 뚜렷한 구간을 설정하였다 (Gye and Ohsako, 2003). 확인된 누치 VTG cDNA의 부분적 염기서열을Clustal W program (GenomeNet, Kyoto, Japan)를 이용하여 잉어, 제브라피시와 염기서열 상동성을 분석하였다.
- 81의 온도 구배 조건에서 40회 PCR을 수행하였다. 최적의 PCR 반응 회수를 결정하기위해 annealing 온도 55℃에서 12~40cycle의 PCR을진행하였다. 고안한 primer에 의한 genomic DNA의 증폭을 확인하기 위해 TRIzol 용액을 사용하여 분리한 genomic DNA 0.
- 차후 정 량적 분석을 위해 PCR cycle 수의 증가에 따라 PCR 반응산물의증가가 뚜렷한 구간을 설정하였다 (Gye and Ohsako, 2003). 확인된 누치 VTG cDNA의 부분적 염기서열을Clustal W program (GenomeNet, Kyoto, Japan)를 이용하여 잉어, 제브라피시와 염기서열 상동성을 분석하였다.
대상 데이터
- 채집된 개체들은 실험실로 운반한 후 18±1℃의 수조에서 14시간 조명 하에 1주간 사육하여 적응시켰다. VTG mRNA 발현의 분석에는 전장 300 mm 이상의 개체를 사용하였다. 수컷에서 VTG의 유도를 위해 corn oil에 희석한 17 beta estradiol 을 10 mg kg-1 체중 농도로 복강 주사하였다.
- 누치 암수 성어는 2003년 하계 팔당호에서 정치망을 이용하여 채집한 개체를 사용하였다. 채집된 개체들은 실험실로 운반한 후 18±1℃의 수조에서 14시간 조명 하에 1주간 사육하여 적응시켰다.
성능/효과
- 30회 PCR 반응을 수행한 결과 암컷과 17 beta estradiol (10 mg kg-1 B.W.)을 일회 주사한 후 2일 된 수컷에서 VTG mRNA의 RT-PCR 산물이 확인되었다(Fig. 6).
- RT-PCR 결과로 나타난 334 bp amplicon의 염기서 열분석을 통해 확인된 누치 VTG cDNA의 부분적 염기서열에 대한 염기서열 상동성 분석결과 잉어와 94%, 제브라피시와 89%의 염기서열 상동성을 보였다.
- 따라서 estrogen에 대한 감수성 즉, estrogen 수용체의 발현이 일어나는 상태로 추정된다. 누치 수컷의 생식내분비학적 특징 이 암컷과 동기화되었다고 가정할 때 수컷에서 에스트로젠 또는 xenoes- trogen에 의해 VTG mRNA 유도를 확인하고자 할 때는암컷의 난황형성기로 수컷에서도 estrogen 감수성이 유지되는 늦은 동계 또는 춘계에 채집한 개체를 이용하여 VTG 발현을 검사하는 것이 적합할 것이다.
- 누치 암수 성어를 이용하여 조사한 결과수컷은 암컷의 2-16배에 상당하는 미량의 VTG mRNA를발현하였다. 17 beta estradiol (10 mg kg-1 B.
- 본 연구에서 이용한 누치는 실험실 조건 14시간 조명, 18℃ 조건에서 순치한 개체로 암컷의 해부과정에서 난자를 포함하고 있는 난소를 육안으로 확인할 수 있어 난황형성기임을 알 수 있었다. 따라서 estrogen에 대한 감수성 즉, estrogen 수용체의 발현이 일어나는 상태로 추정된다.
- 암수 간조직의 genomic DNA를 분리하여 같은 primer 로 수행한 40회의 PCR 반응 결과 약 500 bp의 증폭산물을 확인하였다 (Fig. 5).
- 최적 annealing 온도를 확인하기 위해 암컷 간을 이용하여 제작한 cDNA를 이용하여 55.0~64.8℃의 온도 구배 조건에서 40회 PCR을 수행한 결과 VTG과 beta actin 모두 55℃에서 최적화되었다 (Fig. 4A).
- 본 연구에서 시행한 것과 같은 방법으로 누치 수컷의 간에서 발현되는 VTG mRNA의 RT-PCR 반응을 수행할 경우 32 ~40 사이클에서 VTG 증폭산물이 일량하게 증가하므로이 범위 내에서 RT-PCR반응을 수행할 경우 estrogenic 활성을 갖는 다양한 xenoestrogen의 검색 뿐 아니라 특정 담수역에서 VTG mRNA 의 RT - PCR 법에 의해 xenoestrogen에 의한 오염의 추적이 가능할 것이다. 특히 genomic PCR 결과 RT-PCR 반응 산물과는 다른 크기 (500 bp)의 amplicon이 검출되므로 genomic PCR 산물과구분되었다. 따라서 고안된 primer set 사이에 적어도 1 개 이상의 intron이 위치하고 있은 것으로 추정되며 본연구에서 이용한 primer를 사용할 경우 누치 VTG mRNA의 RT-PCR 검출결과의 신뢰성을 담보할 수 있을것이다.
후속연구
- 따라서 독성학적으로 xenoestrogen에 노출된 개체를 판정하기 위한 VTG mRNA 발현량의 기본 값 설정에 신중할 필요가 있다. Xenoestrogen에 의한 오염에 대한 명확한 결론은 수컷 체내에 존재하는 생리적 농도의 estrogen에 의한 VTG mRNA의 발현정도 및 생성된 VTG 단백질의 반감기 등 체내 동태에 대한 정보에 기초하여야 할 것이다. 본 연구에서 시행한 것과 같은 방법으로 누치 수컷의 간에서 발현되는 VTG mRNA의 RT-PCR 반응을 수행할 경우 32 ~40 사이클에서 VTG 증폭산물이 일량하게 증가하므로이 범위 내에서 RT-PCR반응을 수행할 경우 estrogenic 활성을 갖는 다양한 xenoestrogen의 검색 뿐 아니라 특정 담수역에서 VTG mRNA 의 RT - PCR 법에 의해 xenoestrogen에 의한 오염의 추적이 가능할 것이다.
- , 1993).따라서 간 조직에서 estrogen 수용체를 발현할 경우 미량의 estrogen에 의해 VTG 전사가 가능하며 RT-PCR과같이 민감한 검출방법을 사용하게 되면 미량의 VTG mRNA의 존재를 확인할 수 있을 것이다.
- 특히 genomic PCR 결과 RT-PCR 반응 산물과는 다른 크기 (500 bp)의 amplicon이 검출되므로 genomic PCR 산물과구분되었다. 따라서 고안된 primer set 사이에 적어도 1 개 이상의 intron이 위치하고 있은 것으로 추정되며 본연구에서 이용한 primer를 사용할 경우 누치 VTG mRNA의 RT-PCR 검출결과의 신뢰성을 담보할 수 있을것이다. 향후 bisphenol, nonylphenol 등 이미 다양한 어류에서 VTG 발현을 유도하는 것으로 알려진 다양한 외인성 estrogen에 의한 영향을 확인하기 위해서는 물질별로 투여 농도-발현량 관계에 근거한 구체적인 기준이 설정되어야 할 것이며 누치 이외에도 다양한 담수 어류들을 대상으류 다양한 biomarker gene의 발굴과 xenoe- strogen을 포함한 내분비계 장애물질 검색을 위한 표준화 연구가 필요할 것이다.
- 누치의 경우 암컷의 난소의 발달은 동계에 서서히 발달하여 춘계에 최고조에 달하며 5 월에 산란한다. 따라서 춘계와 하계를 통해 번식 이 이뤄지는 누치의 경우 이 시기에 채집한 개체를 대상으로 VTG mRNA 분석을 할 경우 결과의 신뢰도를 높일 수 있을 것이다.
- )을 1 회주사한 수컷에서 암컷의 발현량에 해당하는 VTG mRNA 가 발현되었다. 본 시험법을 이용하여 estrogenic 활성을 갖는 어류 내분비계장애물질의 민감하고도 특이적인 검색 및 국내 대형 하천의 특정 수역에서의 xenoestrogen 노출 여부의 판정 이 가능할 것이다.
- Xenoestrogen에 의한 오염에 대한 명확한 결론은 수컷 체내에 존재하는 생리적 농도의 estrogen에 의한 VTG mRNA의 발현정도 및 생성된 VTG 단백질의 반감기 등 체내 동태에 대한 정보에 기초하여야 할 것이다. 본 연구에서 시행한 것과 같은 방법으로 누치 수컷의 간에서 발현되는 VTG mRNA의 RT-PCR 반응을 수행할 경우 32 ~40 사이클에서 VTG 증폭산물이 일량하게 증가하므로이 범위 내에서 RT-PCR반응을 수행할 경우 estrogenic 활성을 갖는 다양한 xenoestrogen의 검색 뿐 아니라 특정 담수역에서 VTG mRNA 의 RT - PCR 법에 의해 xenoestrogen에 의한 오염의 추적이 가능할 것이다. 특히 genomic PCR 결과 RT-PCR 반응 산물과는 다른 크기 (500 bp)의 amplicon이 검출되므로 genomic PCR 산물과구분되었다.
- 따라서 고안된 primer set 사이에 적어도 1 개 이상의 intron이 위치하고 있은 것으로 추정되며 본연구에서 이용한 primer를 사용할 경우 누치 VTG mRNA의 RT-PCR 검출결과의 신뢰성을 담보할 수 있을것이다. 향후 bisphenol, nonylphenol 등 이미 다양한 어류에서 VTG 발현을 유도하는 것으로 알려진 다양한 외인성 estrogen에 의한 영향을 확인하기 위해서는 물질별로 투여 농도-발현량 관계에 근거한 구체적인 기준이 설정되어야 할 것이며 누치 이외에도 다양한 담수 어류들을 대상으류 다양한 biomarker gene의 발굴과 xenoe- strogen을 포함한 내분비계 장애물질 검색을 위한 표준화 연구가 필요할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.