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문제 정의
- 본 연구는 MT가 세포분열 훅은 세포중식과 연관이 있올 것이라는 보고들을 기초로 하여, 간의 발생과정올 형태학적으로 관찰하였고, 발생중 혹은 출생후 성장중인 흰쥐 간 조지에서 MT의 분포를 세포화학적 방법올 이용하여 조사함으로써, 흰쥐 간 발생에 관련된 MT의 기능을 알아보고 이들의 상관성을 고찰하고자 하였다.
- 이에, 본 연구는 세포분열이 활발한 발생중에 있는 태아 또는 생후 흰쥐를 모델로 하여, 발생에 따론 간세포의 미세구조적 분화를 관찰하고, 이것을 기초로 하여 발생 시간 별로 간에서의 MT 분포와 발현 양상을확인하기 위하여 면역세포화학적 방법을 수행하였다 발생 초기의 간에서는 간 세포의 조상세포인 난형세포가 다수 관찰되었다. 이 난형 세포의 륵징은 핵/세포질 비 (nuclear cytoplasmic ratio)가 0; 핵이 둥글며, 인이 한 개 이상 발달하였다.
제안 방법
- 그 후 immunogold buffer코 세척하고 immunogold buffer로 회석시킨 10 nm gold — conjugated goat anti-mouse IgG를 2시간동안 처리하였다. Uranyl acetate와 lead citrate로 대조 염색하여, 투과 전자현미경 (JEM-1010 TEM)으로 관찰하였다.
- 발생과 성장시기에 따라 흰쥐 간에서 metallo-thionein (MT)에 대한 분포를 미세구조적으로 알아보기 위하여, 면역 금 입자 표지법을 이용한 세포화학적 방법으로 조사하였다. 실험 결과에 대한 대조군으로 MT 분포가 가장 많은 그굽을 선택한 두L anti-MT 항체를 제외한 모든 과정을 동일하게 처리하여 실험한 결과 어떤 세포에서도 금 입자가 관찰되지 않았옴을 확인하였다 (Fig.
- 발생중인 흰쥐 간 세포의 미세구조를 관찰하기 위하여 적출된 간 조직을 4% glutaraldehyde와 1% OsO4에 각각 고정한 후, 세 척하여 Epon 흔합액 에 포매하고, 초박절편올 제작하였다. 초박절편은 Uranyl acetate와 leadcitrate로 이중염색하여 투과 전자현미경 (JEOL-1010)으로 관찰하였다.
- 본 연구에 사용된 실험동몰은 생후 6주 이상 경과한 Sprague-Dawley 계통의 흰쥐로서, 온도와 습도가 일정하게 조절된 동몰사육실내에서 시판중인 고형사료와 물로 보름동안 기초사육하였다 오후 7시에 암, 수의 비율을 4: 1로 합사시켜 다음날 오전 9시에 질도말법으로 임신을 확인하였다. 정자가 확인된 날을 임신 0일로 정하였고, 임신한 쥐는 격리하여 사육하였다 임신 11일째부터 출생 지전까지 수일 간격으로 흰쥐를 회생시켜 자궁에서 배아룰 적출하여 해부현미경하에서 간을 분리하였고, 출생 후의 흰쥐는 육안으로 간올 분리해내었다
- 5% glutaraldehyde 용액에 2시간동안 고정한 후, sodium cacodylate buffer로 세척하고, ethanol 능도 상승순으로 탈수한 후 LR White 흔합액에 포매하여 중합시켰다, 옥을 ultramicrotome으로 초박절편한 후 nickel grid 위에 mount하여 반옹액들로 처리하였다. 우선 항체에 대한 비룩이적 반옹올 막기 위해 토끼 혈청으로 20분간 처리하고 50배 회석된 MT에 대한 1차 항체를 4, C에서 30분간 반옹시 켰다. 그 후 immunogold buffer코 세척하고 immunogold buffer로 회석시킨 10 nm gold — conjugated goat anti-mouse IgG를 2시간동안 처리하였다.
- 임신을 확인하였다. 정자가 확인된 날을 임신 0일로 정하였고, 임신한 쥐는 격리하여 사육하였다 임신 11일째부터 출생 지전까지 수일 간격으로 흰쥐를 회생시켜 자궁에서 배아룰 적출하여 해부현미경하에서 간을 분리하였고, 출생 후의 흰쥐는 육안으로 간올 분리해내었다
- 제작하였다. 초박절편은 Uranyl acetate와 leadcitrate로 이중염색하여 투과 전자현미경 (JEOL-1010)으로 관찰하였다.
- 한편, 세포 내 MT의 분포와 위치를 전자현미경으로 관찰하기 위하여 면역 금 입자를 표지하는 면역 세포 화학적 방법을 실시하였다 반옹액의 침두가 용이하도록 표본의 크기를 1mm3 이하로 세절하여 4℃에서 2% paraformaldehyde-0.5% glutaraldehyde 용액에 2시간동안 고정한 후, sodium cacodylate buffer로 세척하고, ethanol 능도 상승순으로 탈수한 후 LR White 흔합액에 포매하여 중합시켰다, 옥을 ultramicrotome으로 초박절편한 후 nickel grid 위에 mount하여 반옹액들로 처리하였다. 우선 항체에 대한 비룩이적 반옹올 막기 위해 토끼 혈청으로 20분간 처리하고 50배 회석된 MT에 대한 1차 항체를 4, C에서 30분간 반옹시 켰다.
성능/효과
- 1). Type II 간 실질세포는 type I에 비해 크기가 매우 크며, 다수의 혈구모세포 (룩히, 적혈구 모세포)들과 인접하여 조혈도 (erythropoietic island)를 형성하고 있는 것으로 관찰되었다 이 세포의 세포질에는 type I에 비해 미토콘드리아가 소수 존재 하였고 활면소포체 (smooth ER, sER)가 발달했다. 세포질은 전자밀도가 낮게 관찰되었으며, 핵은 이질 염색질 (heterochromatin)의 능도가 높게 관찰되었다 (Fig.
- 한편, 간 실질세포들은 미세구조적으로 두 가지의 유형을 보였다 Type I 간 실질세포는 미토콘드리아와 조면소포체가 발달했고 초기 담세관의 구조를 형성하는 것으로 볼 때, 출생 후 간의 담즙 분비와 같은 실질적 인 기농을 하는 세포로 분화할 것으로 사료된다. Type II 간 실질세포는 type Ⅰ 세포에 비해 세포질내 물질들의 능도가 낮은 것으로 나타났고, 이는 흰쥐 성체의 비장에서 조혈도 (erythro-poietic island)를 구성하는 세포와 유사한 미세구조를 나타내는 것으로 보아, 간에서 일어나는 조쳘작용에 실질적으로 관여하는 것으로 판단된다. 세포 내 MT의 분포 정도와 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역세포 화학적 금 입자 표지법을 이용하여 관찰한 결과, MT는 간 실질세 포들에서 주로 관찰되 었다 발생 17일 된 태아 간 세포의 세포질과 핵에서 공동적으로 MT에 대한 금 입자들의 분포가 뚜렷하게 증가하였는데, 이러한 경향은 룩히 출생후 일 된 신생 흰쥐에서 가장 높게 관찰되었다.
- 한편, 출생후 5일이 경과한 신생 흰쥐의 간 세포에서 MT의 분포는 세포질과 핵에서 크게 감소하였으며, 시간이 경과함에 따라 이러한 경향은 더옥 뚜렷하게 관찰되었다 한편 어떤 실험군에서도 미토콘드리아 막과 내부세서는 MT 반옹이 전혀 관찰되지 않았는뎨, 이는 MT가 에너지대사에 무관함을 나타내는 것 이라고 생각한다. 또한 발생과 성장에 있어서 간 세포 내 MT 분포의 변화에 대한 결과와 같은 시기에 아연과 구리의 능도에 대해 조사한 연구 결과를 비교해 보았을 때, 태아의 간에서 발현되는 MT는 발생과정 동안 모체에서 공급된 금속 이온을 간에 고농도로 저장하였다가, 태아의 발생 또는 분화에 필요한 금속 이온을 다론 조지이나 기관에 공급하는 기농을 수행하는 것으로 보인다. 또한 성장과정에서는 금속 이온의 저장은 물른 간 세포의 분열에 연관된 유전자룰 발현시키거나, 핵안으로 아연과 구리 같은 금속성 효소활성인자를 공급하여 세 포분열 또는 분화에 관련된 유전자의 발현을 유도할 것으로 사료된다 (Panemangalore et al.
- 이 난형 세포의 륵징은 핵/세포질 비 (nuclear cytoplasmic ratio)가 0; 핵이 둥글며, 인이 한 개 이상 발달하였다. 또한, 세포질 내에서는 미 토콘드리 아와 조면소포체 (rough ER, rER)를 관찰할 수 있었고 룩히 유리리보솜들은 세포질 전체에 걸쳐 조밀하게 분포하고 있었다. 이러한 미세구조적 륵징으로 볼 때, 이 난형 세포는 단백질 합성이 활발한 것으로 생각되며, 다른 세포로 분화할 수 있는 미분화세포라고 판단된다.
- 발생과 성장과정에서 흰쥐 간 세포의 미세구조적인 변화를 관찰하기 위해 투과전자현미경으로 관찰한 결과, 11일된 배아의 간에서 다수 관찰되는 난형 세포 (oval cell)는 핵/세 포질 비 (nuclear cytoplasmic ratio)가 크고, 핵 이 둥글며, 인이 1개 이상 발달하였다. 또한 세포질에는 미토콘드리 아 (mitochondria)와 조면소포체 (rough ER, rER)가 소수 존재 하였으며 , 유리리 보솜들이 매우 발달하였다.
- 17일 된 배아의 type I 간 실질세포는 이웃한 세포와 밀착결합 및 뎨스모좀으로 연결되어 있었으며, 연결부위에서 담세관 (bile canaliculus)과 유사한 세포사이 공간을 관찰할 수 있었다 19일 된 배아에서는 작은 지질 소포 (gid droplet)를 포함하는 간 실질세포 (liver parenchymal cell)가 다수 존재하였다 출생 이후 흰쥐 간 세포는 핵 이 둥글며, 지질 소포, 미토콘드리아 및 조면소포체가 발달한 세포들의 수가 증가하였다 생후 5일 된 흰쥐의 간 세포에서는 큰 지질 소포가 나타났고, 성체와 비슷한 형태의 담세관이 간 실질세포 사이 에서 관찰되었다. 생후 20일 된 흰쥐의 간 실질세포는 성체와 유사하게 핵 이 둥글며, 미토콘드리아와 조면소포체가 발달하였다 또한 담관은 배아 19일 째에 불완전한 형태로 관찰되어 성체 시기까지 계속 발달하는 양상을 보였다.
- Type II 간 실질세포는 type Ⅰ 세포에 비해 세포질내 물질들의 능도가 낮은 것으로 나타났고, 이는 흰쥐 성체의 비장에서 조혈도 (erythro-poietic island)를 구성하는 세포와 유사한 미세구조를 나타내는 것으로 보아, 간에서 일어나는 조쳘작용에 실질적으로 관여하는 것으로 판단된다. 세포 내 MT의 분포 정도와 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역세포 화학적 금 입자 표지법을 이용하여 관찰한 결과, MT는 간 실질세 포들에서 주로 관찰되 었다 발생 17일 된 태아 간 세포의 세포질과 핵에서 공동적으로 MT에 대한 금 입자들의 분포가 뚜렷하게 증가하였는데, 이러한 경향은 룩히 출생후 일 된 신생 흰쥐에서 가장 높게 관찰되었다. 한편, 출생후 5일이 경과한 신생 흰쥐의 간 세포에서 MT의 분포는 세포질과 핵에서 크게 감소하였으며, 시간이 경과함에 따라 이러한 경향은 더옥 뚜렷하게 관찰되었다 한편 어떤 실험군에서도 미토콘드리아 막과 내부세서는 MT 반옹이 전혀 관찰되지 않았는뎨, 이는 MT가 에너지대사에 무관함을 나타내는 것 이라고 생각한다.
- Type II 간 실질세포는 type I에 비해 크기가 매우 크며, 다수의 혈구모세포 (룩히, 적혈구 모세포)들과 인접하여 조혈도 (erythropoietic island)를 형성하고 있는 것으로 관찰되었다 이 세포의 세포질에는 type I에 비해 미토콘드리아가 소수 존재 하였고 활면소포체 (smooth ER, sER)가 발달했다. 세포질은 전자밀도가 낮게 관찰되었으며, 핵은 이질 염색질 (heterochromatin)의 능도가 높게 관찰되었다 (Fig. 2). 17일 된 배아의 type I 간 실질세포는 이웃한 세포와 밀착결합 및 뎨스모좀으로 연결되어 있었으며, 연결부위에서 담세관 (bile canaliculus)과 유사한 세포사이 공간을 관찰할 수 있었다 19일 된 배아에서는 작은 지질 소포 (gid droplet)를 포함하는 간 실질세포 (liver parenchymal cell)가 다수 존재하였다 출생 이후 흰쥐 간 세포는 핵 이 둥글며, 지질 소포, 미토콘드리아 및 조면소포체가 발달한 세포들의 수가 증가하였다 생후 5일 된 흰쥐의 간 세포에서는 큰 지질 소포가 나타났고, 성체와 비슷한 형태의 담세관이 간 실질세포 사이 에서 관찰되었다.
- 조사하였다. 실험 결과에 대한 대조군으로 MT 분포가 가장 많은 그굽을 선택한 두L anti-MT 항체를 제외한 모든 과정을 동일하게 처리하여 실험한 결과 어떤 세포에서도 금 입자가 관찰되지 않았옴을 확인하였다 (Fig. 3). 발생 13일 된 태아의 간 실질세포의 핵 안에서 처옴으로 금 입자들이 관찰되었다(Figs.
- 이 실험을 동해 MT에 대한 생리적 기능을 고찰한 결과, 세포질에 존재하는 MT는 필수 금속이온의 대사와 저장 기농을 수행하며, 핵질에 존재하는 MT의 기능은 세 포분열에 관여하는 유전자룰 발현시키고, 핵질에 아연과 구리를 공급하여, 핵내에 존재하는 효소들의 활성올 유도할 것으로 판단된다. 룩히 흰쥐 태아와 수유기동안 어린 흰쥐의 간 세포질내에 MT가 높은 능도로 분포하는 것은 성 장에 필요한 아연과 구리를 저장하고 다른 조지에 공급하는 기농에 따른 결과로 사료된다.
- 있었다. 즉, 핵질의 이질염색질, 인 연관 염색질 혹은 인 내부에서도 관찰되었으며, 세포질 내 조면소포체 막에도 위치하는 것으로 조사되었다. 한편, 발생 중 훅은 신생 흰쥐의 간에 존재하는 혈구모세포들의 세 포질 내에서 도 MT에 대한 반옹성 이 비교적 약하게 관찰되 었다 (Figs, 4~8).
- 7). 출생 후 5일째에서 MT와 결합한 금 입자들의 수는 크게 감소한 것으로 나타났다. 이와 같은 금 입자의 감소현상은 계속 진행되어, 생후 30일째에 이르면 성체와 비슷한 수준으로 낮게 관찰되었다 (Fig.
- 세포 내 MT의 분포 정도와 세포 내 위치를 확인하기 위하여 면역세포 화학적 금 입자 표지법을 이용하여 관찰한 결과, MT는 간 실질세 포들에서 주로 관찰되 었다 발생 17일 된 태아 간 세포의 세포질과 핵에서 공동적으로 MT에 대한 금 입자들의 분포가 뚜렷하게 증가하였는데, 이러한 경향은 룩히 출생후 일 된 신생 흰쥐에서 가장 높게 관찰되었다. 한편, 출생후 5일이 경과한 신생 흰쥐의 간 세포에서 MT의 분포는 세포질과 핵에서 크게 감소하였으며, 시간이 경과함에 따라 이러한 경향은 더옥 뚜렷하게 관찰되었다 한편 어떤 실험군에서도 미토콘드리아 막과 내부세서는 MT 반옹이 전혀 관찰되지 않았는뎨, 이는 MT가 에너지대사에 무관함을 나타내는 것 이라고 생각한다. 또한 발생과 성장에 있어서 간 세포 내 MT 분포의 변화에 대한 결과와 같은 시기에 아연과 구리의 능도에 대해 조사한 연구 결과를 비교해 보았을 때, 태아의 간에서 발현되는 MT는 발생과정 동안 모체에서 공급된 금속 이온을 간에 고농도로 저장하였다가, 태아의 발생 또는 분화에 필요한 금속 이온을 다론 조지이나 기관에 공급하는 기농을 수행하는 것으로 보인다.
후속연구
- MTF-1 을 knock out 시킨 생쥐로 발생실험을 수행한 결과, 생쥐 태아는 발생 14일 시기에 간이 되화되 어, 태아가 사망하였다. 이 실험 결과에서도 태아의 발생시기에 MT가 아연과 구리 대사기능 뿐만 아니라 세포 분열과 분화에도 중요한 기능을 수행 할 것 이라고 제 안하고 있다. (Gunes et al.
- 이상과 같이 발생중 훅은 출생 이후 성장기까지의 흰쥐 간을 실험모델로 하여, 세포의 증식과 연관이 있다고 알려진 MT의 분포와 발현 양상을 세포면역화학적 방법을 이용흐여 조사하였던 바, 출생 지후 MIR 발현이 가장 높게 나타났고, 세 포내 핵 및 세포질에 분포하는 양상을 보였다 이러한 결과는 MT가 세포 중식훅은 세 포의 분화 뿐만 아니라, 물질대사 조절에도 관여하는 것으로 판단되며, 이후 이에 대한 보다 깊이 있는 연구가 요구된다.
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