사람의 위암 조직을 미세구조와 metallothionein (MT)에 대한 면역 조직 및 세포화학적 방법으로 조사하였던 바, 다음과 같은 결과를 얻어냈다. 위암 세포들은 핵 세포질비가 정상세포에 비해 크고, 불규칙한 핵과 이질염색질의 분포가 증가하였으며, 세포질내에서 유리리보솜의 분포가 뚜렷이 증가하였다. 면역 조직 및 세포화학적 방법으로 MT의 발현을 조사하였던 결과, 이 단백질은 위암조직의 암세포에서 반응성이 높게 나타났으며, 주로 핵 부위에 집중되는 경향을 보였으며, 특히 이질염색질과 인 부위에서 면역 금입자들이 주로 분포하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들은 위암 세포의 미세구조가 미분화세포들이 나타내는 일반적인 특징과 비교되었으며, 위암 세포에서 MT가 증가하는 현상은 이 단백질이 세포질에서 합성되어 핵내로 수송된 후, 세포 증식을 위한 전사과정에 관여할 것임을 시사하는 것이다.
사람의 위암 조직을 미세구조와 metallothionein (MT)에 대한 면역 조직 및 세포화학적 방법으로 조사하였던 바, 다음과 같은 결과를 얻어냈다. 위암 세포들은 핵 세포질비가 정상세포에 비해 크고, 불규칙한 핵과 이질염색질의 분포가 증가하였으며, 세포질내에서 유리리보솜의 분포가 뚜렷이 증가하였다. 면역 조직 및 세포화학적 방법으로 MT의 발현을 조사하였던 결과, 이 단백질은 위암조직의 암세포에서 반응성이 높게 나타났으며, 주로 핵 부위에 집중되는 경향을 보였으며, 특히 이질염색질과 인 부위에서 면역 금입자들이 주로 분포하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들은 위암 세포의 미세구조가 미분화세포들이 나타내는 일반적인 특징과 비교되었으며, 위암 세포에서 MT가 증가하는 현상은 이 단백질이 세포질에서 합성되어 핵내로 수송된 후, 세포 증식을 위한 전사과정에 관여할 것임을 시사하는 것이다.
Metallothionein (MT) is a family of ubiquitous, low molecular weight ($6,000{\sim}7,000D$), cysteine-rich ($30{\sim}35%$) inducible protein with a high affinity to metal ions and has no aromatic amino acids and histidine. Some of the known functions of MT include detoxification...
Metallothionein (MT) is a family of ubiquitous, low molecular weight ($6,000{\sim}7,000D$), cysteine-rich ($30{\sim}35%$) inducible protein with a high affinity to metal ions and has no aromatic amino acids and histidine. Some of the known functions of MT include detoxification of heavy metals and alkylating agents and neutralization of free radicals. Also, this protein has been reported to involve in tumor pathophysiology and therapy resistance. MT expression may affect a number of cellular processes including gene expression, apoptosis, proliferation and differentiation. Many reports on the physiological and biochemical properties of MT have been published, but ultrastructural reports on the localization of MT in human gastric cancer tissues are extremely rare. The present study was undertaken to examine the ultrastructural features and the localization of MT within the gastric adenocarcinoma. Ultrastructures of gastric cancer cells were characterized by the high nuclear cytoplasmic ratio, the interdigitation between cells, the irregular nucleus containing much heterochromatin and the wide distribution of free ribosomes in the cytoplasm. Immunohistochemical reaction for MT was prominent in the gastric adenocarcinoma. And the immunogold labellings were more prominent within the nucleus than the cytoplasm. Particularly, immunogold particles were numerously seen at nulcleolus or nucleolar associated heterochromatin. These results suggest that MT expression by gastric cancer cells is associated with cell proliferative activity and is possibly synthesized in the cytoplasm, and then the protein is transported into the nucleus to participate in any transcriptional steps.
Metallothionein (MT) is a family of ubiquitous, low molecular weight ($6,000{\sim}7,000D$), cysteine-rich ($30{\sim}35%$) inducible protein with a high affinity to metal ions and has no aromatic amino acids and histidine. Some of the known functions of MT include detoxification of heavy metals and alkylating agents and neutralization of free radicals. Also, this protein has been reported to involve in tumor pathophysiology and therapy resistance. MT expression may affect a number of cellular processes including gene expression, apoptosis, proliferation and differentiation. Many reports on the physiological and biochemical properties of MT have been published, but ultrastructural reports on the localization of MT in human gastric cancer tissues are extremely rare. The present study was undertaken to examine the ultrastructural features and the localization of MT within the gastric adenocarcinoma. Ultrastructures of gastric cancer cells were characterized by the high nuclear cytoplasmic ratio, the interdigitation between cells, the irregular nucleus containing much heterochromatin and the wide distribution of free ribosomes in the cytoplasm. Immunohistochemical reaction for MT was prominent in the gastric adenocarcinoma. And the immunogold labellings were more prominent within the nucleus than the cytoplasm. Particularly, immunogold particles were numerously seen at nulcleolus or nucleolar associated heterochromatin. These results suggest that MT expression by gastric cancer cells is associated with cell proliferative activity and is possibly synthesized in the cytoplasm, and then the protein is transported into the nucleus to participate in any transcriptional steps.
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문제 정의
이 단백질은 여러 성장인자들과 같은 세포 내적 요인이나, 중금속 노출과 같은 세포 외적 요인에 의해 합성 이유도되는 것으로도 알려져 있다. 룩히, 1기는 실험동몰들의 경우, 초기 발암 과정에서 암세포의 apopto- sis를 억제하는 기능도 있는 것으로 알려져 암의 발생 이나 진행도에 대한 생물학적 지표(biological mar・ ker)로서 활용될 가능성이 있다는 보고도 있다 즉 본 연구는 MT가 여러 종류의 세포들에서 분열 훅은 중식과 연관이 있다는 보고 들을 기초로 하여, 사람의 위암 조지에서 미세 구조적 륵징과 더불어 이 단백질의 분포를 조지 화학 및 면역 세포화학적으로 조사함으로써, 위암 조지 및 세포 내 MT의 반옹성과 분포를 조사하고, 이러한 결과들이 암의 진행 혹은 악성도와 어떠한 관계가 있는지를 살펴보고자 하였다.
본 연구는 MT가 세포분열 훅은 세포 중식과 연관이 있다는 보고 들을 기초로 하여, 위암 조지에서 MT 의 분포를 미세 구조적 륵징과 더불어 조지 화학 및 면역세포화학적으로 조사함으로써, 위암 조지 및 세포 내 MT의 반옹 정도와 localization을 추적하고, 이러한 결과들을 MT 의 기능과 연관지어 고찰하고자 하였다
제안 방법
즉, 적출된 조직을 4% glutaraldehyde와 1% 0$。4에 고정한 후, 세척 하여 Epon 흔합액에 포매하고, 초박절 편을 제작 하였다. Uranyl acetate와 lead citrate코 전자염색하여 투과전자현미경 (JEOL-1010)으로 관찰하였다.
세포 내 MT의 분포와 위치를 전자현미경으로 관찰하기 위하여 면역-금입자를 표지하는 면역세포화 학적 방법을 실시하였다 반옹액의 침투가 용이하도록 표본의 크기를 1mm?이하로 세절하여 4°C에서 2% paraformaldehyde-0.5% glutaraldehyde 용액에 2시 간 동안 고정한 후, sodium cacodylate buffer코 세척 하고, ethanol 능도 상승 순으로 탈수한 후 LR White 흔합액에 포매하여 중합시켰다, 블록을 LKB ultrami- crotome으로 초박절 편한 후 nickel grid 위에 mount하 여 반옹액들로 처리하였다.
5% glutaraldehyde 용액에 2시 간 동안 고정한 후, sodium cacodylate buffer코 세척 하고, ethanol 능도 상승 순으로 탈수한 후 LR White 흔합액에 포매하여 중합시켰다, 블록을 LKB ultrami- crotome으로 초박절 편한 후 nickel grid 위에 mount하 여 반옹액들로 처리하였다. 우선 항체에 대한 비룩이 적 반응을 막기 위해 토끼혈청으로 20분간 처리하고, 50배 회석된 MT®] 대한 1차 항체를 4°C에서 30분간 반옹시켰다 그 후 immunogold buffer코 세척하고, immunogold buffer로 회석시킨 1 0 nm gold-con- jugated goat anti-mouse IgG를 2시간 동안 처리하였다 Uranyl acetate와 lead citrate로 대조 염색 하여, 투과 전자현미경(JEM-1010 TEM)으로 관찰하였다
위암 세포의 미세 구조를 관찰하기 위하여 릉상적인 투과 전자현미경 표본을 제작하였다. 즉, 적출된 조직을 4% glutaraldehyde와 1% 0$。4에 고정한 후, 세척 하여 Epon 흔합액에 포매하고, 초박절 편을 제작 하였다.
세포 내 MT의 분포와 위치를 전자현미경으로 관찰하기 위하여 면역-금입자를 표지하는 면역세포화 학적 방법을 실시하였다 반옹액의 침투가 용이하도록 표본의 크기를 1mm?이하로 세절하여 4°C에서 2% paraformaldehyde-0.5% glutaraldehyde 용액에 2시 간 동안 고정한 후, sodium cacodylate buffer코 세척 하고, ethanol 능도 상승 순으로 탈수한 후 LR White 흔합액에 포매하여 중합시켰다, 블록을 LKB ultrami- crotome으로 초박절 편한 후 nickel grid 위에 mount하 여 반옹액들로 처리하였다. 우선 항체에 대한 비룩이 적 반응을 막기 위해 토끼혈청으로 20분간 처리하고, 50배 회석된 MT®] 대한 1차 항체를 4°C에서 30분간 반옹시켰다 그 후 immunogold buffer코 세척하고, immunogold buffer로 회석시킨 1 0 nm gold-con- jugated goat anti-mouse IgG를 2시간 동안 처리하였다 Uranyl acetate와 lead citrate로 대조 염색 하여, 투과 전자현미경(JEM-1010 TEM)으로 관찰하였다
대상 데이터
본 연구의 재료로 사용된 위조지은 순천향대학교 천안병원에서 위암으로 판정되어 수슽받은 환자들로부터 얻어냈다
이론/모형
통상적인 광학현미경 표본제작 과정에 의해 만들어진 표본에서 파라핀을 제거하고, 1차 항체로서는 mouse monoclonal IgG antibody E9 (DAK0사)를 사용하여, ABC (Avidin-biotin peroxidase complex) 법으로 면역조지화학 염색을 실시하였다.
성능/효과
; 2000). 또한, immunogold labelling을 이용한 면역세포화학적 방법으로 MT의 localization ■>] 세포 내 어떤 소기관에 집중되어 있으며, 어느 정도의 density (gold particles 의 수)를 나타내는 지에 관해서도 조사하고자 하였다 세포면역화학적 관찰 결과, MT의 존재부위를 나타내는 금입자들은 정상 세포들에서는 그 수가 매우 적었고, 핵과 세포질에서 비슷한 비율을 하는 것으로 관찰되 었다 위암 세포들을 대상으로 관찰한 결과 MI®] 대한 금 입자의 분포는 크게 증가하였으며 핵 과 세 포질에서 모두 존재하였으나, 입 자의 밀도는 핵 에서 더욱 뚜렷한 것으로 관찰되었다 룩히 핵 내에서 금입자들은 주로 인에 집중되어 분포하는 경우가 많았으며, 핵막의 내부 핵층판 부위 혹은 이 질염색 부위에 다수 존재하는 경향을 보였다 이러한 결과들은 MT가 세포질에서 합성되어, 핵내로 수송된 후 세포 증식 단계의 전사 과정에 관여하기 때문인 것으로 생각된다, 본 연구자들이 수행하였던 연구에서 재생중인 간 조지에서 MT mKNA의 발현은 MT 단백질의 능도가 중가하는 시기보다 12시간 정도 선행되어 일어남을 관찰할 수 있었는 뎨, 이러한 사실로 미루어 암 조지에서도 MT 유전자의 발현은 발암 초기에 일어날 것으로 생각된다 (Saika, 1992; Miyazaki et al.; 1998; Xu et al.: 2000; Kuroda et al.: 2002).
한편, MT에 대한 면역조지화학 및 세포 화학적 실험에 사용한 mouse monoclonal IgG antibody E9는 사람, 흰쥐 및 말에서 MT isoform I과 II에 대해 공동적인 epitope을 지니는 것으로 알려져 있다 본 실험에서 면역반옹에 대한 확인은 1차 항체를 사용하지 않은 실험대조군을 설정하여 조사하였는 뎨 이 대 조군 에서는 어떠한 반옹성도 나타나지 않았다 위암 조지 내의 MT의 분포(localization)와 반옹성(reactivity)을 알아보기 위하여 면역조지화학적 방법으로 표본을 제작하여 관찰하였던 바, 정상위 조지 내의 상피층의 일부 세포들과 모세혈관 내피세포들에서 항-MI®] 의 한 양성반 옹을 볼 수 있었으며, 다론 부위들에서도 반옹이 나타나기 는 하였으나, 그 정도가 비교적 약한 것으로 조사되었다. 위암 조지 내에서는 룩히 상피층에서 MT에 대한 양성반옹이 뚜렷이 증가하여 있었으며, MT의 반옹 성은 주로 핵에 집중되어 뚜렷이 관찰되었는뎨, 이러한 결과는 다론암 조지들을 관찰하였던 다론연구 결과들과 비교될 수 있는 것으로 판 단된다(Kuroda et al.
후속연구
MT가 위암 세포에서 중가하는 것으로 조사된 본 연구는 앞으로 MT의 세포 증식과 연관된 기농을 규명하기 위한 기초연구로서, 이후 여러 유형의 암 조지 에서 암의 진행 정도 및 세포유형에 따른 이 단백질의 발현 정도와 분포 위치 동을 연구할 필요성이 있는 것으로 사료된다.
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