뇌에서 혈액뇌장벽을 형성하는 내피세포는 치밀이음부를 통해 뇌의 항상성을 유지하고 있다. 치밀이음부의 단백질 중의 하나인 occludin은 뇌혈관장벽(BBB)의 기능을 유지하는 중요한 단백질로 인식되고 있다. 본 실험에서는 소의 뇌에서 배양된 BBB 내피세포에서 활성산소종의 하나인 $H_2O_2$에 의해 일어나는 occludin 단백질의 변화를 관찰하였다. $H_2O_2$에 의해 TEER가 감소하는 것은 occludin의 재분포에 의한 것이었다. 세포독성은 4시간내에서는 1mM $H_2O_2$ 이하에서는 나타나지 않았다. Confocal laser microscope으로 관찰한 결과, $H_2O_2$에 의해 occludin은 치밀이음부에서 중간중간이 사라져 감소해 있었고, 이러한 양상은 $H_2O_2$의 용량과 노출시간에 비례하였다. 그러나 Western blot 결과, occludin의 총량은 증가하였다. 투과전자현미경 관찰을 통해 $H_2O_2$가 세포사이의 결합의 구조에 뚜렷한 변화를 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 $H_2O_2$에 의한 BBB 기능소실은 occludin이 치밀이음부에서 부분적으로 사라지는 것에 의하지만, 세포는 기능손상을 복구하기위한 방편으로 이 단백질의 생산을 더욱 증가시키는 것으로 생각된다.
뇌에서 혈액뇌장벽을 형성하는 내피세포는 치밀이음부를 통해 뇌의 항상성을 유지하고 있다. 치밀이음부의 단백질 중의 하나인 occludin은 뇌혈관장벽(BBB)의 기능을 유지하는 중요한 단백질로 인식되고 있다. 본 실험에서는 소의 뇌에서 배양된 BBB 내피세포에서 활성산소종의 하나인 $H_2O_2$에 의해 일어나는 occludin 단백질의 변화를 관찰하였다. $H_2O_2$에 의해 TEER가 감소하는 것은 occludin의 재분포에 의한 것이었다. 세포독성은 4시간내에서는 1mM $H_2O_2$ 이하에서는 나타나지 않았다. Confocal laser microscope으로 관찰한 결과, $H_2O_2$에 의해 occludin은 치밀이음부에서 중간중간이 사라져 감소해 있었고, 이러한 양상은 $H_2O_2$의 용량과 노출시간에 비례하였다. 그러나 Western blot 결과, occludin의 총량은 증가하였다. 투과전자현미경 관찰을 통해 $H_2O_2$가 세포사이의 결합의 구조에 뚜렷한 변화를 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 $H_2O_2$에 의한 BBB 기능소실은 occludin이 치밀이음부에서 부분적으로 사라지는 것에 의하지만, 세포는 기능손상을 복구하기위한 방편으로 이 단백질의 생산을 더욱 증가시키는 것으로 생각된다.
Cerebral microvessel endothelial cells that form blood-brain barrier (BBB) have tight junction for maintaining brain homeostasis. Occludin, one of tight junction protein, is crucial for BBB function. $H_2O_2$ induced occludin changes and effects in bovine brain BBB endothelial cells were ...
Cerebral microvessel endothelial cells that form blood-brain barrier (BBB) have tight junction for maintaining brain homeostasis. Occludin, one of tight junction protein, is crucial for BBB function. $H_2O_2$ induced occludin changes and effects in bovine brain BBB endothelial cells were examined in this study. The decrease of transendothelial electrical resistance (TEER) by $H_2O_2$ was due to disruption of occludin localization. Cytotoxicity test revealed that $H_2O_2$ did not cause cell death below 1 mM $H_2O_2$ within 4 hr. $H_2O_2$ caused intermittent disruption and loss of occludin at tight junctions and occludin disappeared with dose dependent manner from tight junction in confocal laser microscopy. But Western blot revealed that the total amounts of occludin increased by $H_2O_2$ administration. Transmission electron microscopy revealed that the ultrastructure of tight junction was not changed by $H_2O_2$. These data suggest that functional disruption of BBB by $H_2O_2$ was due to the localized loss of occludin in tight junction, but the expression of occludin increased in order to compensate the disrupted function in BBB.
Cerebral microvessel endothelial cells that form blood-brain barrier (BBB) have tight junction for maintaining brain homeostasis. Occludin, one of tight junction protein, is crucial for BBB function. $H_2O_2$ induced occludin changes and effects in bovine brain BBB endothelial cells were examined in this study. The decrease of transendothelial electrical resistance (TEER) by $H_2O_2$ was due to disruption of occludin localization. Cytotoxicity test revealed that $H_2O_2$ did not cause cell death below 1 mM $H_2O_2$ within 4 hr. $H_2O_2$ caused intermittent disruption and loss of occludin at tight junctions and occludin disappeared with dose dependent manner from tight junction in confocal laser microscopy. But Western blot revealed that the total amounts of occludin increased by $H_2O_2$ administration. Transmission electron microscopy revealed that the ultrastructure of tight junction was not changed by $H_2O_2$. These data suggest that functional disruption of BBB by $H_2O_2$ was due to the localized loss of occludin in tight junction, but the expression of occludin increased in order to compensate the disrupted function in BBB.
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가설 설정
면역형광염색을 동해 관찰하였다. :BBMEC에서 TJ 를 구성하는 occludine 에 의해 용량의존적으로 TJ에서 감소되어 있었다. 감소되는 양상을 보면, 정상적으로 세 포사이에 나타나는 면 역반옹이 H2O2에 의해 그 연속성 이 파괴되어 있었다 그러나 occludine 세포 사이에서 전체적으로 소실되지 않고 남아 있었다.
제안 방법
10 µM, 100 µM, 1 mM의 H2O2에 30분 노출시키고한 시간 반 후에 나타나는 occludin 양을 western blot 으로 확인하였다 occludine H2O2 10 µM에서는 유의한 변화가 없었지만 100 µM, 1mM 에서는 대조군에 비해 단백질의 양이 중가되어 있는 것을 Densitome- tric analysis에서 관찰하였다(Fig. 3).
10μM부터 5mM 에 이르는 H2O2의 루여에 따른 BBMEC의 TEER의 변화를 EV0M으로 관찰하였다 (Fig. 1). 5mM의 H2O2로 의해 TEER는 한 시간 후에 급속하게 감소하여 두 시간 경에는 기저 수준에 도달하였고 이후에는 오히려 기저수준보다 더 낮은 값을보였다 1 mM에서는 점진적으로 TEER가 감소하는 양상으로 보였으며 한 시간 후에 기저수준에 도달하였고 이후에는 역시 기저수준보다 더 낮은 값을 보였다 100μM에서는 TEER가 점진적으로 감소하는 양상을 보이고 있었다.
30분간 1 mM H2O2에 노출시키고 한시간 반 후에 세포사이의 치밀이옴부를 구성하는 occludin의 변화를 관찰하였다 BBMEC가 밀접 하게 접촉을 이루고 있는 대조군(Fig. 5a)에서 치밀이옴부의 occludine 세포들의 접촉 경 계부를 따라 치밀하게 분포되어 있었다 간혹 끊김이 있지만 occludin 이 세포사이를 채우며 연속적인 그물의 형태를 나타내고 있는 것이 매우 특징적이었다 H2O2 처치에 의해 나타나는 occludin 면역반옹의 분포는 대조군에 비교할 때 그물의 형태가 파괴되어 있었다. 세포사이에서 관찰되는 occludine 연속적으로 이어져 있지 못하고 중간중간이 끊어져 세포사이에 톰이 형성되었다 높은 능도인 1mM H2O2에 의해 occludin의 분포의 변화는 더옥 뚜렷하게 나타났다 (Fig.
H2O2 투여 후 30분 간격으로 두 시간 동안 EV0M (Precisoin)으로 transendothelial electrical resistance (TEER)를 측정하였다.
H2O2를 처리한 후의 BBMECs의 생존률은 Ala- marBlue assay (Serotec)-l- 이용하여 확인흐F였다, H2O2 로 30분간 처리하고 10% AlamarBhie를 포함한 changing media로 바꿔 준 후 4시간 동안 배 양하면서 cell viability를 측정하였다. Spectra MAX 340 (Molecu- lar Devices)를 이용하여 570 nm에서 측정한 absor- bance에서Background absorbance (600nm에서 측정) 빼었으며 생존흍은 대조군 대비 %로 표현하였다(n =3).
MicroBCA kit (Pierce)를 이용하여 단백 질의 능도를정 량하고 10% SDS polyacryamide gel로 전기 영 동 (4 g protein/lane)을 하였다. 젤은 PVDF membrane에 전기 이적 한 후 blocking solution (5% milk; TBST)에서 한 시간 처리하였다.
젤은 PVDF membrane에 전기 이적 한 후 blocking solution (5% milk; TBST)에서 한 시간 처리하였다. Mouse anti-occludin antibody (1 : 5000)로 1시간 반옹시킨 후 TBST로 5분간 3번 세척하였다, HRP conjugated go at an ti-mouse IgG an ti- body로 1시간 반옹시킨 후, 다시 TBST로 5분 간 3번 세척한 후, ECL pluskit(Amersham)를 이용하여 반응시킨 후 gel documentation system 을 이용해 반응을 관찰하였다
Sorvall Mt 5000으로 0.1 ~0.5 ㎛ 두께의 준초박절편을 제작하고 Richardson염색을 하여 광학현미경으로 관찰한 후 다시 50nm 두께의 초박절편을 제작하고 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색을 실시하여 JEOL 200 CX 투과전자현미경으로 100KeV 하에서 관찰하였다
viability를 측정하였다. Spectra MAX 340 (Molecu- lar Devices)를 이용하여 570 nm에서 측정한 absor- bance에서Background absorbance (600nm에서 측정) 빼었으며 생존흍은 대조군 대비 %로 표현하였다(n =3).
실험재료로 삼았다. 무균장치내에서 뇌겉질을 1 ~2 mm, 의 크기로 세절한 후, 뇌 겉질에 dispase 와 collagenase/dispase 로 5시간 배양하고 50% percoll을 이용하여 최종적으로 를 구성하는 미세혈관 내피세포 (bovine brain microvessel endothelial cells, BBMECs)를 분리 하였다. 실험 목적에 따라 cover glass, 12 well plate 또는 Transwell (Corning)에 내피세포를 배양하였다 배양액은 3일째 바꾸어 주고 이후로는 이틀마다 바꿔주었다 실험 일에 H2O2 lgM, 100 ㎛, 1 mM, 5mM을 루여 하였다 실험은 4회를 실시하였다.
무균장치내에서 뇌겉질을 1 ~2 mm, 의 크기로 세절한 후, 뇌 겉질에 dispase 와 collagenase/dispase 로 5시간 배양하고 50% percoll을 이용하여 최종적으로 를 구성하는 미세혈관 내피세포 (bovine brain microvessel endothelial cells, BBMECs)를 분리 하였다. 실험 목적에 따라 cover glass, 12 well plate 또는 Transwell (Corning)에 내피세포를 배양하였다 배양액은 3일째 바꾸어 주고 이후로는 이틀마다 바꿔주었다 실험 일에 H2O2 lgM, 100 ㎛, 1 mM, 5mM을 루여 하였다 실험은 4회를 실시하였다.
위에서 제시된 여러 연구결과를 바탕으로 볼 때, BBB에서 내피세포의 역할은 매우 중요하며, 특히 치밀이음부가 중추적인 역할을 하는 것이 분명하다 이 실험에서는 소의 뇌에서 배양된 BBB 내피세포에서 ROS의 일종인 H2O2에 의해 일어나는 기능 및 occlu-din 단백질의 변화를 관찰하였다
그러나 세포의 생존률은 5mM의 H2O2로 처치한 결과는 세포의 생존률이 대조군의 약 30% 정도로 크게 감소하였다. 이것으로 보아 H2O2의 능도가 1 mM 이하에서 나타나는 TEER의 감소는 cell death를유발하지 않은, 단순한 기능의 변화라고 생각되었다그러나 5mM의 H2O2를 투여한 경우 cell death가 크게 증가되어 나타나 이후 계속되는 실험에서는 1 mM 이하의 능도에서 실험을 진행하였다
이러한 배경을 근거로 본 실험에서는 H2O2를 투여하여 나타나는 TJ의 단백질인 occludin의 분포의 변화를 면역형광염색을 동해 관찰하였다. :BBMEC에서 TJ 를 구성하는 occludine 에 의해 용량의존적으로 TJ에서 감소되어 있었다.
대상 데이터
만들었다. Dispase와 collagenase/dispase 등의 시약들은 Sigma와 Loche 에서 구입하였다 이중구조배양관(0.4㎛ 구멍, 12-well Transwell®)은 Corning costar corporation(USA)의 것을 사용하였다
Slide chamber(Nunk)에서 배양한 내피세포는 3% paraformaldeyde (0.01 M PBS, 4℃)로 고정하고 면역 형광현미경 관찰을 위해 일차항체는 mouse monoclonal anti-occludin antibody를 사용하였다. 대조군에서는 일차항체 대신 PBS를 사용하였다, 이차항체는 HTC conjugated anti-mouse antibody (Zymed)를 사용하였다 Slide chamber에서 배 양한 내피세포는 3% paraformaldehyde(0.
도살장에서 갓 도살한 신선한 소의 뇌를 구입하여 ice-cold MNM(pH 74)에 넣어 실험실로 운반하여 뇌수막과 뇌표면의 미세한 혈관들을 제거한 후, 대뇌겉질만을 실험재료로 삼았다. 무균장치내에서 뇌겉질을 1 ~2 mm, 의 크기로 세절한 후, 뇌 겉질에 dispase 와 collagenase/dispase 로 5시간 배양하고 50% percoll을 이용하여 최종적으로 를 구성하는 미세혈관 내피세포 (bovine brain microvessel endothelial cells, BBMECs)를 분리 하였다.
데이터처리
자료는 평균±표준편차로 나타내 었 으며, 동계 처리는 Student's t test로 유의성을 검정하였으며 유의수준은 5%로 하였다.
이론/모형
Percentage of viability of BBMECs after H2O2 treatment. The cell viability was assessed using AlamarBlue assay. Treatment of 5mM H2O2 showed significant decrease in viability.
성능/효과
1 mN의 H2O2에 30분 노출시키고 한 시간 반 후에 투과 전자 현미 경 으로 관찰한 결과, 치밀이음부의 형태학적 변화는 관찰되지 않았다 대조군에서 세포 사이에 나타나는 세포사이결합은 세포의 긴 면에 대해 거의 수직 이나(Fig. 5a) 비스듬하게 (Fig. 5b) 형성되어 있었다 H2O2 1 mM을 루여한 경우 나타나는 세포사이의결합은 대조군에 비해 뚜렷한 차이는 없었다. 세포사이 결합에 나타난 큰 공간(Fig.
1). 5mM의 H2O2로 의해 TEER는 한 시간 후에 급속하게 감소하여 두 시간 경에는 기저 수준에 도달하였고 이후에는 오히려 기저수준보다 더 낮은 값을보였다 1 mM에서는 점진적으로 TEER가 감소하는 양상으로 보였으며 한 시간 후에 기저수준에 도달하였고 이후에는 역시 기저수준보다 더 낮은 값을 보였다 100μM에서는 TEER가 점진적으로 감소하는 양상을 보이고 있었다. 이 결과로 볼 때 대체로 H2O2 1mM의 능도까지는 용량에 의존하여 TEER가 감소하는 양상을 보였다.
2). 그러나 세포의 생존률은 5mM의 H2O2로 처치한 결과는 세포의 생존률이 대조군의 약 30% 정도로 크게 감소하였다. 이것으로 보아 H2O2의 능도가 1 mM 이하에서 나타나는 TEER의 감소는 cell death를유발하지 않은, 단순한 기능의 변화라고 생각되었다그러나 5mM의 H2O2를 투여한 경우 cell death가 크게 증가되어 나타나 이후 계속되는 실험에서는 1 mM 이하의 능도에서 실험을 진행하였다
본 면역형광염색의 결과를 근거로 보면, occludine은H2O2에 의해 TJ에서 부분적으로 사라졌으며, 이 단백질이 사라진 세포사이는 바로 TJ의 기능이 소실된 부위에 해당한다고 볼 수 있었다. 바로 이 부위의 세포사이에 동로가 형성되고, 이 곳으로 용질의 자유로운 이동이 일어나 TEER가 감소하고 또한 투과성 이 증가하는 것으로 생각할 수 있다.
본 실험의 결과 H2O2에 의해 TEER가 용량 의존적으로 감소하는 양상을 관찰할 수 있었다 세포를 H2O2 (250~1000㎛)에 노출시켜 산화스트레스를 유발하면 내피세포에 손상이 초래되지만(Shimizu et al, 1994), 적은 능도(121 ㎛)에서는 섬유아세포의 증식 (Burdon & Gill, 1990)과 내피세포의 혈관형성 (Yasuda et al.: 1999) 이 촉진된다. 이와 같은 자료를 배경으로 실험에서는 낮은 능도(10 ㎛, 100 ㎛) 및 늪은 농도(1mM, 5 mM)에서 모두 TEER가 감소하는 것으로 나타났으며, 다론 부위의 내피세포에서 나타나는 변화와 유사하였다(Lum et al.
5a)에서 치밀이옴부의 occludine 세포들의 접촉 경 계부를 따라 치밀하게 분포되어 있었다 간혹 끊김이 있지만 occludin 이 세포사이를 채우며 연속적인 그물의 형태를 나타내고 있는 것이 매우 특징적이었다 H2O2 처치에 의해 나타나는 occludin 면역반옹의 분포는 대조군에 비교할 때 그물의 형태가 파괴되어 있었다. 세포사이에서 관찰되는 occludine 연속적으로 이어져 있지 못하고 중간중간이 끊어져 세포사이에 톰이 형성되었다 높은 능도인 1mM H2O2에 의해 occludin의 분포의 변화는 더옥 뚜렷하게 나타났다 (Fig. 5b). 많은 부위의 세 포사이 에서 면역 반옹이 사라져 occludin의 소실이 매우 광범위하였다
5mM의 H2O2로 의해 TEER는 한 시간 후에 급속하게 감소하여 두 시간 경에는 기저 수준에 도달하였고 이후에는 오히려 기저수준보다 더 낮은 값을보였다 1 mM에서는 점진적으로 TEER가 감소하는 양상으로 보였으며 한 시간 후에 기저수준에 도달하였고 이후에는 역시 기저수준보다 더 낮은 값을 보였다 100μM에서는 TEER가 점진적으로 감소하는 양상을 보이고 있었다. 이 결과로 볼 때 대체로 H2O2 1mM의 능도까지는 용량에 의존하여 TEER가 감소하는 양상을 보였다.
이와 같은 결과들을 종합해 볼 때 H2O2에 의해 occludin에 변화가 일어나 투과성이 증가한다고 생각된다. 그러나 이는 occludin의 파괴나 세포에서의 소실에 의한 것이 아니고 TJ에서 occludin이 다른 부위로 이동하는 재분포에 의한 것으로 생각된다.
후속연구
또한 ROS에 의한 MAPK activity 조절은 MAPK family member나 cell type에 따라 다르다. 그러므로 앞으로 BBB 내 피세포에서 MAPK signal transductoin 기 전, ROS에 반옹하는 signaling cascade, 그리고 ROS의 지접적인 target molecule을 밝혀내야 할 것이다
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