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문제 정의
- 후)염증 반응을">염증반응을 발의 부종 상태에서 두께를 측정하여 판정한다. 따라서 염증 억제 효과를 관찰하기 위한 효능검색에 있어 시료 물질 투여에 의한 부종 억제율 정도를 관찰하게 된다. 본 연구에서는 국내에서 가장 넓게 분포하며 생육하는 상록 침염수종(편백, 측백, 소나무, 젓나무 등) 중 측백나무과 편백나무속의 편백(6amaecyparis obtusaY을 선정 하고 휘발성 물질을 추출하여 편백 정유의 항균, 항산화 그리고 항염 효과에 대한 생리활성을 검토하여 기초 자료로써 결과를 보고하는 바이다.
- 3 mm 로 33%의 부종 억제율을 나타내었다. 이 결과는 편백 정유의 부종 억제율이 양성 대조군의 부종 억제율의 70%에 달하는 효과를 나타내므로 염증 유도로 인한 반응을 완화시킬 수 있는 가능성을 제시하는 것으로 사료된다. 또한 염증 반응의 중간 단계에 작용하는 hyaluronidase의 활성 저해 정도는 in vitro 실험에서 55%로 나타났다.
제안 방법
- 10 mL 액체배지에서 배양된 대수 증식기(O.D 600 = 0.5)의 활성화된 균을 연속 배지 희석법을 통한 colony count를 통하여 적절한 균액량을 결정하였다. 균액 100μL를 후)피하주사">피하 주사 한다. 2 h 후 부종 정도를 측정하여 아래의 수식에 따라 부종 억제율을 측정하여 대조군과 비교한다.
- Disc 법에서 얻어진 항세균 활성을 정량적으로 비교할 수 있는 탁도 측정법을 이용하여 피부 상재균인 그람양성균 2종과 그람음성균 2종에 대한 편백 정유의 항균 활성을 조사하였다. 각 균주에 대한 편백 정유의 MIC 측정 결과 B.
- aeruginosa) 에 대하여 편백 정유의 항균 효과를 paper disc 법, MIC (minimum inhibitory concentration) 및 ICo (fifty percent inhibition concentration)을 실시하여 그 결과를 Table 1〜3에 정리하여 나타내었다. Paper disc 법은 편백 정유의 농도를 0.0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 5.0, 10.0%로 하였으며 BP은 0.2%를 사용하여 비교하였다. 각각의 시료 농도에서 배양된 5)의 활성화된 균을 연속 배지 희석법을 통한 colony count를 통하여 적절한 균액량을 결정하였다. 균액 100μL를 고체배지에 spreader를 이용하여 균일하게 도말한 후 BP와 편백정유 각각을 멸균된 8 mm filter paper disc 에 농도별로 40 μL씩 흡수시킨 후 고체배지 위에 놓아 37°C, 24 h 동안 배양한 후 filter paper disc 주위의 clear zone의 직경크기를 측정하였다.
- 균의 생육을 억제한 최저농도 희석액을 기준으로 시료의 최소억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 를 결정하였다. 세균의 후)시료흡광도의">시료 흡광도의 감소 비율로써 나타내었다. 대조군은 BHT 를 사용하여 비교하였다.
- 시료 무처리군의 흡광도에 대비하여 50%의 생육억제를 나타내는 시료의 농도를 IC50으로 나타내었으며, 세균의 생육억제 활성은 탁도 측정법에서와 동일한 방법으로 실시하였다.
- 후)유발물질인">유발 물질인 카라게닌(carrageenan lambda Type IV, Sigma)을 1% 되도록 생리 식염수에 준비하고 양성 대조군에는 amino- pyrine (Sigma)을 증류수에 제조하여 100 mg/kg으로 경 피 투여하였다. 시험군의 항염 물질로는 편백 정유를 투 여하여 부종이 발생하는 오른쪽 뒷발의 발목 관절부위의 두께를 마이크로 캘리퍼스로 측정하였다. 편백정유와 양 성대조 표준품인 aminopyrine을 사용하여 경피 투여 경로로 투여 후 일정 시간 후 생리식염수에 녹여 제조한 1% 카라게닌을 뒷발에 0.
- 후)(SD)계랫드,">(SD)계 랫드, 5주령된 수컷을 사용하였다. 염증 유발 물질인 카라게닌(carrageenan lambda Type IV, Sigma)을 1% 되도록 생리 식염수에 준비하고 양성 대조군에는 amino- pyrine (Sigma)을 증류수에 제조하여 100 mg/kg으로 경 피 투여하였다. 시험군의 항염 물질로는 편백 정유를 투 여하여 부종이 발생하는 오른쪽 뒷발의 발목 관절부위의 두께를 마이크로 캘리퍼스로 측정하였다.
- 후)즉시 형">즉시형 알레르기에 의해서 유발되는 부종에 대한 염증반응을 발의 부종 상태에서 두께를 측정하여 판정한다. 따라서 염증 억제 효과를 관찰하기 위한 후)프리 라디칼">프리라디칼 소거능은 DPPH (l, l-diphenyl-2-picrylhy- drazyl)의 환원성을 이용하여 편백 정유의 항산화력 정도를 측정하였다. DPPH 용액(2 X 10-4)에 시료를 1: 4의 비율로 혼합하여 microplate reader (Model550, Bio-Rad, CA)의 490 nm에서 측정하였다.
- 후)프리 라디칼">프리라디칼 소거능은 DPPH의 환원성을 이용하여 편백 정유의 항산화력 정도를 측정하였다. DPPH 용액(2 X 10-4M)에 시료를 1:4의 비율로 혼합하여 microplate reader (Model550, Bio-Rad, CA)의 490 nm에서 측정하였다.
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항균 활성 측정을 위해 쓰여진 천연 원료로는 편백 정유를 사용하였으며 합성 항균제인 BP를 표준물질로 실험하여 비교하였다. 각 시료는 실험에 사용할 적정 농도로 하기 위하여
대상 데이터
- 후)합성항균제인">합성 항균제인
- 5)으로 용해하여 사용하였다. 기질로는 히야론산 인산염 (Wako, Japan, from robster comb)을 최종 농도가 0.4 mg/mL되 게 완충용액에 용해하고, 활성화제 compound 48/80 (Sigma), CaCl2, NaCl의 최종 농도가 각각 0.1 mg/mL, 2.5 mM, 0.15 M 되게 완충용액에 용해하여 사용하였다. p- dirnethlaminobenzaldehyde (p-DABA) 시약으로는 p-DABA (Wako, Japan) 10 g을 10 N HC 본 실험에 사용한 균주는 그람양성균인 B. subtilis (KCTC 1022), S. aureus (KCTC 1916)와 그람음성균인 E coli (KCTC 257D, P. aeruginosa (KCTC 2513)으로 한국 생명공학 연구원(KRIBB, Dajeon)에서 분양받은 균 주를 사용하였다.
- 부종 유발을 위한 실험 동물은 Sprague-Dawley (SD)계 랫드, 5주령된 수컷을 사용하였다. 염증 후)실험대조군는">실험 대조군는 BHT를 사용하여 비교하였으며 편백정유의 프리래디칼 소거능 IC50은 0.78%로 나타났다.
-
후)편백 정유는">편백정유는 Tween80 1% 수용액에 20%가 되도록 용해하여 시료로 사용하였다.
후)효소히야로니다제">효소 히야로니다제 용액 (hyaluronidase type IV-s, from bovine testis, Sigma)을 최종 효소활성이 400 NF units/ mL로 되게 완충용액(0.1 M 초산완충액, pH 3.5)으로 용해하여 사용하였다. 기질로는
이론/모형
- 5% 되게 접종하여 실험에 사용하였다. 균주의 성장은 UV/VIS spectrophoto meter (UV-1601 Shimadzu, JapanX 이용하여 600 nm 에서 흡광도를 측정하여 활성이 가장 우수한 시간대의 균주를 사용하여 paper disc법에 의한 항균활성 측정을 실시하였다. 탁도 측정에는 후)그람 양성균(B.">그람양성균(B. subtilis, S. aureus)과 그람음성균(E. coli,P. aeruginosa) 에 대하여 편백 정유의 항균 효과를 paper disc 법, MIC (minimum inhibitory concentration) 및 ICo (fifty percent inhibition concentration)을 실시하여 그 결과를 Table 1〜3에 정리하여 나타내었다. Paper disc 법은 편백 정유의 농도를 0.
- 후)이후">이 후
성능/효과
- 후)그람 음성균보다">그람음성균보다 크게 항균성을 나타내었다. 1% 미만의 농도에서 농도-의존적으로 항균효과가 뚜렷이 증가하는 현상은 관찰할 수 없었으나 0.4% 정 도의 농도에서 합성 항균제인 BP와 유사하거나 우세한 항균효과를 볼 수 있었다.
- 후)항균 활성이">항균활성이 더욱 뚜렷함을 관찰할 수 있었다(Table 2). B. subtilis와 P. aeruginosa는 각각 0.01%와 0.8%의 농도에서 MIC를 나타내었으며 이는 항균 대조군인 BP와 거의 유사한 농도에서 항균효과를 나타내었다. E.
- 후)항균 활성이">항균활성이 강하게 나타났다(Table 3). E. coli를 제외한 나머지 세균주는 항균 대조군인 BP와 동등한 항균력을 나타내었으며, E coli는 MIC에서 보여진 것과 같이 항균 대조군인 BP에 비해 5 배 높은 농도에서 ICso을 나타내었다.
- 위에서 얻어진 MIC 결과로부터 생육을 억제하는 농도를 세분화하여 ICa)을 결정하였다. ICso 또한 B. subtilis > S. aureus > E. coli > P. aeruginosa의 순으로 항균활성이 강하게 나타났다(Table 3). E.
- 후)그람 음성균">그람음성균 2종에 대한 편백 정유의 항균 활성을 조사하였다. 각 균주에 대한 편백 정유의 MIC 측정 결과 B. subtilis > S. aureus > E. coll > P. aeruginosa 의 순으로 그람양성균에 대해 항균활성이 더욱 뚜렷함을 관찰할 수 있었다(Table 2). B.
- 후)기염물질인">기염 물질인 카라게닌으로 유도된 부종은 대조군 및 시료 무주사의 경우 평균 12.3 mm의 부종을 유도하였으나 aminopyrine를 주사한 양성 대조군은 6.4 mm로 48%의 부종억제율을 나타내고, 편백정유의 경우 8.3 mm 로 33%의 부종 억제율을 나타내었다. 이 결과는 편백 정유의 부종 억제율이 농도가">첨가.농도가 증가함에 따라 clear zone이 커지는 것을 알 수 있으며 그람양성균이 그람음성균보다 크게 항균성을 나타내었다. 1% 미만의 농도에서 농도-의존적으로 항균효과가 뚜렷이 증가하는 현상은 관찰할 수 없었으나 0.
- 후)양성대조군의">양성 대조군의 부종 억제율의 70%에 달하는 효과를 나타내므로 염증 유도로 인한 반응을 완화시킬 수 있는 가능성을 제시하는 것으로 사료된다. 또한 염증 반응의 중간 단계에 작용하는 hyaluronidase의 활성 저해 정도는 in vitro 실험에서 55%로 나타났다. 이는 랫드 생체실험과 다소 차이가 있으나 시료가 유지 성분이므로 직접 완충액에 용해되지 않아 계면활성제인 Tween80 용액에 용해하여 사용했기 때문에 신뢰도가 떨어지는 것에 기인하는 것으로 생각한다.
- 이상 편백 정유의 항세균 활성을 종합해보면, paper disc법으로 관찰한 결과와 마찬가지로 탁도 측정법(MIC)에서도 그람양성균에 대해 훨씬 우세한 항균활성이 나타남을 볼 수 있으며, 이것은 그람양성균의 세포벽이 그람 음성균의 세포벽보다 비교적 약한 구조로 구성되어 있어 편백 정유의 성분이 그람양성균의 세포막에 높은 흡착 및 투과성을 가지고 세포를 사멸시킨 결과로 사료된다. 편백 정유는 현재 상용되고 있는 항균제가 농도 0.
- 후)그람 양성균의">그람양성균의 세포막에 높은 흡착 및 투과성을 가지고 세포를 사멸시킨 결과로 사료된다. 편백 정유는 현재 상용되고 있는 항균제가 농도 0.2~ 0.5% 범위에서 사용되는 것과 비교하면 균주에 따라서는 이보다 적은 농도에서도 우수한 항균활성을 나타내므로 천연 항균제로서의 가능성을 시사하였다.
후속연구
- 따라서 이들의 체계적인 연구는 인체에 무해한 항균저】, 천연방부제, 피부보호제, 식품 첨가물 등으로 응용될 수 있을 것으로 기대한다. 이러한 정유를 기능성 물질로 활용하기 위해서는 보다 다양한 실험체계를 이용한 생리활성의 검정이 필요하다고 하겠다.
- 후)피부보호제로써의">피부 보호제로써의 효과를 발휘할 것으로 기대한다. 따라서 편백 정유 및 편백 정유와 상승효과를 발휘할 수 있는 다른 천연물과의 혼합물의 개발로 더욱 안정된 개발의 가능성을 시사하는 것으로 사료된다. 이는 랫드 생체실험과 다소 차이가 있으나 시료가 유지 성분이므로 직접 완충액에 용해되지 않아 계면활성제인 Tween80 용액에 용해하여 사용했기 때문에 신뢰도가 떨어지는 것에 기인하는 것으로 생각한다. 따라서 향후 이와 비슷한 시료들끼리 상대 평가하는 것이 중요하며 이러한 요인을 고려한 방법적 개선도 이루어져야 하겠다.
- 그 중에서도 정유는 aroma oil 또는 essential oil로 불리며 주성분인 terpenoid류가 주요 성분을 이루고 있다. 본 연구에서 나타난 결과에 의하면 사용된 편백 정유는 항세균 효과 및 항염 효과를 기대할 수 있었으며 이는 피부 보호제로써의 효과를 발휘할 것으로 기대한다. 따라서 후)식품첨가물">식품 첨가물 등으로 응용될 수 있을 것으로 기대한다. 이러한 정유를 기능성 물질로 활용하기 위해서는 보다 다양한 실험체계를 이용한 생리활성의 검정이 필요하다고 하겠다.
- 후)것이">것 이 매우 중요하다. 이와 더불어 기존에 넓게 이용되고 있는 합성물질을 대신하여 친환경 물질 및 인체에 무독한 자연 유래물질로 대체해 나가는 데에 필요하다고 하겠다.
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