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문제 정의
- 본 연구는 장성 지역 편백나무 잎 추출물의 성분분석 및 생리 활성 탐색을 통해 향후 기능성 화장품, 연고 등의 산업화에 적용 가능성이 있음을 알아보고자 진행하였다.
- 본 연구는 전라도 장성지역의 편백나무 잎 추출물을 사용하여 in vitro에서 항염증 및 항알레르기 효과를 보고자 연구를 진행하였다. Lee 등[20]의 선행연구에서는 에틸아세테이트 분획을 당 제거한 아글리콘 분획의 HPLC 정량분석 결과 quercetin 성분이 83.
제안 방법
- ABTS radical cation 소거활성은 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS)와 potassium persulfate와의 반응으로 ABTS+ radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한녹색으로 decolorization되는 것을 측정하는 방법으로 hydrogen donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정 할 수 있는 방식을 이용하였다[16].
- 0에 가까운 양호한 직선성을 나타내었다. 검액에서의 피크 확인은 표준물질의 피크 머무름 시간을 비교하여 확인하였다. α-Terpinene, α-Terpineol, limonene, borneol, myrcene 및 sabinene 6종의 성분은 5.
- 분석 컬럼은 길이 30 m, 내경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 μm을 사용하였으며, 이동상 가스는 헬륨, 유속은 2.0 mL/min, 시료량은 비분할 주입법으로 8μL을 주입하였으며, 주입구 온도는 280°C 조건으로 진행하였다.
- 5 mg/mL)을 각 well에 25 μL씩 첨가하여 3시간 배양한 다음, 상층액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan 결정을 DMSO로 용해시켜 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 무처리군의 생존율을 기준으로 각 처리군의 상대적인 세포생존율(cellviability)을 평가하여 계산하였다.
- 세포독성을 평가하기 위해 세포를 1×104 cells/well의 밀도로 48-well plate에 분주하고 24시간 배양 후, 각 농도별 편백나무잎 추출물을 24시간 처리하였다.
- 세포배양 상등액 100 μL와 griess시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine in 25% phosphoric acid) 100 μL를 혼합하여 96 well plates에서 10분간 반응시킨 후 biotek microplate spectrophotometer를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 이후 incubation buffer (119mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 40 mM NaOH, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)와 시료 각각 0, 100, 200, 400, 800 μg/mL를 순차적으로 10분간 전 처리한 후 1 μg/mL의 DNP-bovine serum albumin(DNP-BSA)과 1시간 배양하여 세포를 활성화시켰다.
- 총폴리페놀 함량 분석방법으로 널리 사용되고 있는Folin-Denis법[15]을 응용하여 측정하였다. 즉 적절히 희석한 각 추출물 시료 용액에 2배로 희석한 Folin 시약을 동량 첨가하고 잘 혼합하여 3분간 방치한 후 시료와 동량의 10% Na2CO3를 서서히 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 방치한 후 UV/visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Augsburg,Germany)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 편백나무 잎 추출물의 ABTS radical cation 소거활성은RC50와 trolox의 활성과 비교하여 trolox 당량값으로 나타내었다. 그 결과 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 4.
- 편백나무 잎 추출물의 H2O2에 대한 저해활성은 RC50와 trolox의 활성과 비교하여 trolox 당량값(trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC)으로 나타내었다. 그 결과 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 5.
- 편백나무 잎 추출물의 총 폴리페놀의 함량을 gallic acid를 기준물질로 하여 측정하였다(Table 2). Gallic acid로 환산한 편백나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 25.
대상 데이터
- NO2− 표준곡선은 NaNO2를 농도별로 조제하여 사용하였다.
- RBL-2H3 세포는 10% FBS와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 37°C,5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 편백나무 잎 추출물(C&B Cosmetic, Choongnam, Korea)는 장성지역의 편백나무 잎(Chamaecyparisobtusa Leaf) 20 kg과 정제수 80 kg을 혼합교반, 밀봉상태 105°C에서 20분간 처리, 멸균하여 진공상태 60°C에서 72시간 가온하여 추출 및 응축수 처리하여 제균 여과(0.2 μM)후 냉장보관 사용하였다.
- 시판되는 원액으로 구입한 편백나무 잎 추출물은 50°C에서 감압 건조하여 사용하였다.
- 인간 유래의 섬유아세포인 CCD-986sk 세포는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 분양 받아 사용하였으며, 세포는 10% FBS와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 함유하는IMDM 배지를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 또한, 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan's multiple range test 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다. 두 그룹 사이의 비교에는 t-test를 사용하였으며, 유의확률이 p값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
- 또한, 그룹 간의 유의성 차이 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하였으며, Duncan's multiple range test 방법을 통한 사후 검증을 시행하였다.
- 모든 데이터는 최소 3번 반복하여 평균과 표준오차(mean±SEM)로 나타내었으며, 통계 분석에는 SPSS statistics 22 (Version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)가 사용되었다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거 활성은 ABTS+･cation decolorization assay 방법[16]에 따라 시행하였다. 7 mM ABTS와 2.
- Obtusa leaf extracts in CCD-986sk cells. Cell viability was measured by MTT assay. Abbreviation: CO, Chamaecyparis obtusa.
- Lee 등[17]의 방법에 따라 96 well micro plate에 PBS 100μL와 물에 녹인 시료 20 μL를 넣고 1 mM H2O2를 가하여 5분 방치한 다음, 1.25 mM ABTS 30 μL와 PBS에 녹인 1 U/mL peroxidase 30 μL를 첨가하여 37°C에서 10분간 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- RAW 264.7 세포로부터 생성되는 활성질소 종인 nitricoxide (NO)의 양은 Green 등[18]의 방법을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2− 형태를 griess reagent와 반응시켜 측정하였다.
- 성분분석은 Bose 등[9]의 크로마토그래피 방법을 이용하여 Shimadzu사의 GCMS-QP2010 Plus 시리즈 GC-MS (Shimadzu,Corp., Kyoto, Japan)로 분석하였다. 분석 컬럼은 길이 30 m, 내경 0.
- 총폴리페놀 함량 분석방법으로 널리 사용되고 있는Folin-Denis법[15]을 응용하여 측정하였다. 즉 적절히 희석한 각 추출물 시료 용액에 2배로 희석한 Folin 시약을 동량 첨가하고 잘 혼합하여 3분간 방치한 후 시료와 동량의 10% Na2CO3를 서서히 가하였다.
성능/효과
- CCD-986sk 세포에 편백나무 잎 추출물을 24시간 처리하여 세포생존율을 확인한 결과, 편백나무 잎 추출물(100∼800μg/mL)은 CCD-986sk 세포에 대해 유의적인 세포독성을 나타내지 않았다(Figure 2).
- Gallic acid로 환산한 편백나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 25.89±0.31 mg GAE/g로 범위로 나타났다.
- RAW 264.7 세포에 LPS 100 ng/mL을 처리한 군에서 NO 생성이 28±0.38 μM까지 증가하였으나 편백나무 잎 추출물 100μg/mL 처리 군에서 NO 생성은 18.34±0.67 μM, 편백나무 잎 추출물 200 μg/mL 처리 군에서 NO 생성은 11.45±0.57 μM로 농도 의존적, 유의적으로 감소하였다(Figure 3A).
- 그 결과 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 4.00±0.01 mg/mL과 5.21±0.05 mg TE/g로 나타났다(Table 4).
- 그 결과 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 5.47±0.13 mg/mL과 1.35±0.11 mg TE/g로 나타났다(Table 3).
- 38 μM까지 증가하여 편백나무 잎 추출물 150 μg/mL의 농도에서 처리에서 IC50으로 감소할 것으로 추정된다. 따라서 본 연구결과는 편백나무 잎 추출물이 항염증 작용이 있음을 시사한다. Kim 등[23]의 선행 연구에서 따르면 기도에 염증을 유발한 Murine 천식모델에서 편백나무 잎에서 추출한 에센셜오일이 과민반응을 감소시킨다고 보고되었다.
- 또한 마우스 유래의 대식세포 주인 RAW 264.7 세포에서 LPS 100 ng/mL을 처리를 통한 염증 유도 군에서 주요 인자인 NO 생성이 28±0.38 μM까지 증가하였으나 편백나무 잎 추출물 150 μg/mL 처리 농도에서 IC50 으로 감소할 것으로 추정되므로, 편백나무 잎 추출물이 항염증 작용이 있음을 시사한다.
- 본 연구결과 β-hexosaminidase는 편백나무 잎 추출물의 농도 의존적으로 감소되어 항알레르기 효능이 있음을 알 수 있었으며, RBL-2H3세포에 대한 세포독성 실험결과 5시간까지는 독성이 없는 것으로 나타났다(data not shown).
- 본 연구결과 CCD-986sk 세포에서 편백나무 잎 추출물의 농도 800 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 감소되지 않았다.
- 본 연구에서는 α-Terpinene 보다 졸음방지에 생리활성이 있는 borneol 성분이 가장 많았다.
- 본 연구에서는 H2O2에 대한 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 5.47±0.13mg/mL과 1.35±0.11 mg TE/g로 나타났다.
- 본 연구에서는 마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 LPS 100 ng/mL을 처리한 군에서 NO 생성이 28±0.38 μM까지 증가하여 편백나무 잎 추출물 150 μg/mL의 농도에서 처리에서 IC50으로 감소할 것으로 추정된다.
- 본 연구에서는 편백나무 잎을 열수 추출한 편백나무 잎 추출물의 폴리페놀 함량농도를 높이기 위해 50°C에서 감압 건조하여 실험에 사용한 결과 총 폴리페놀 함량이 25.89±0.31 mg GAE/g로 나타났다.
- 설정된 GC-MS 분석법으로 편백나무 잎 추출물의 6종 성분에 대한 함량 분석을 실시한 결과, α-Terpinene 3.03 mg/g, α-Terpineol 9.48 mg/g, limonene 5.96 mg/g, borneol 59.78 mg/g, myrcene 4.85 mg/g, sabinene 11.31 mg/g로 나타났다(Table 1).
- 설정된 GC-MS 분석법으로 편백나무잎 추출물의 6종 성분에 대한 함량 분석을 실시한 결과, α-Terpinene 3.03 mg/g, α-Terpineol 9.48 mg/g, limonene 5.96mg/g, borneol 59.78 mg/g, myrcene 4.85 mg/g, sabinene11.31 mg/g로 borneol이 가장 많은 것으로 나타났다.
- 알레르기 주요 인자인 β-hexosaminidase 의 경우 처리한 편백나무 잎 추출물의 농도 의존적으로 감소되어 항알레르기 효능이 있음을 알 수 있었으며, 인간 유래 섬유아 세포인 CCD-986sk 세포에 대해 편백나무 잎 추출물의 농도 100∼800 μg/mL 범위에서 세포독성을 전혀 보이지 않았다.
- 연구 결과 편백나무 잎 추출물의 RC50과 TEAC는 각각 4.00±0.01 mg/mL과 5.21±0.05 mgTE/g로 나타났다.
- 본 연구결과 CCD-986sk 세포에서 편백나무 잎 추출물의 농도 800 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 감소되지 않았다. 이 결과에서 편백나무 잎 추출물은 세포독성이 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 편백나무 잎 추출물은 향 후 기능성 화장품, 연고 등의 산업화에 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 편백나무 잎 추출물은 50°C에서 감압 건조하여 실험에 사용하였으며, 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 25.89±0.31mg GAE/g로 나타났다.
- 편백나무 잎 추출물의 주요성분에 대한 함량분석을 위한 검량선은 상관계수(r)를 구하여 직선성을 판단하였으며, 6종 성분에 대한 검량선 작성 결과 상관 계수(r) 값이 0.9997 이상으로 1.0에 가까운 양호한 직선성을 나타내었다. 검액에서의 피크 확인은 표준물질의 피크 머무름 시간을 비교하여 확인하였다.
- 편백나무 잎 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, H2O2와 ABTS+라디칼에 대한 추출물의 RC50이 각각 5.47±0.13 mg/mL와 4.00±0.01 mg/mL로 나타났다.
후속연구
- 알레르기 주요 인자인 β-hexosaminidase 의 경우 처리한 편백나무 잎 추출물의 농도 의존적으로 감소되어 항알레르기 효능이 있음을 알 수 있었으며, 인간 유래 섬유아 세포인 CCD-986sk 세포에 대해 편백나무 잎 추출물의 농도 100∼800 μg/mL 범위에서 세포독성을 전혀 보이지 않았다. 따라서 편백나무 잎 추출물이 향후 기능성 화장품, 연고 등의 산업화에 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이 결과에서 편백나무 잎 추출물은 세포독성이 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 편백나무 잎 추출물은 향 후 기능성 화장품, 연고 등의 산업화에 광범위하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 31 mg GAE/g로 나타났다. 추출용매에 따른 총 폴리페놀 함량에 관한 비교 자료가 미비하여, 편백나무의 지역별, 부위별 연구가 더 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 α-Terpinene 보다 졸음방지에 생리활성이 있는 borneol 성분이 가장 많았다.
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