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문제 정의
- EXT1, p!6, PTEN, DPC4 (deleted in pancreatic carcinoma-4) 및 FHIT (fragile histidine triad gene) 에서 이형접합성의 상실, 증폭 및 불안정을 포합하는 유전자의 변이를 알아보고 이들 유전자의 변이와 임상양상의 연관성을 확인함으로서 두경부 편평상피세포암의 발암기전에 있어 중요한 종양억제유전자를 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 이미 알려진 종양억제유전자들을 대상으로 두경부 편평상피세포암에서 이형접합성 상실(LOH), 증폭, 및 microsatellite instability를 포함하는 유전자의 이상을 분석하여 종양억제 유전자의 이상과 임상양상과의 연관성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 두가지의 DNA는 모두 분광측광법을 이용하여 농도를 보정하였다. Microsatellite marker들은 r -32p로 표식을 하였으며 이를 polyacrylamide gel에 전기영동을 하여 확인하였다. 두경부 편평상피세포암 조직에서 추출한 DNA를 종양측으로 말초혈액 림프구에서 추출한 DNA를 정상대조군으로 그리고 microsat- ellite marker들을 primer로 하여 DNA-PCR을 시행하였다.
- Microsatellite marker들은 r -32p로 표식을 하였으며 이를 polyacrylamide gel에 전기영동을 하여 확인하였다. 두경부 편평상피세포암 조직에서 추출한 DNA를 종양측으로 말초혈액 림프구에서 추출한 DNA를 정상대조군으로 그리고 microsat- ellite marker들을 primer로 하여 DNA-PCR을 시행하였다.
- PCR을 위한 반응혼합액은 표식된 microsatellite marker 1 ㎕(순방향 및 역방향 배열), 표식되지 않은 microsatellite marker 1㎕(순방향 및 역방향 배열), WxTaq DNA 중합효소 완충액 5㎕, Taq DNA 중합효소 1 unit (0.5 ㎕), 각 100μM의 2' -deoxyguanosine-5, -triphosphate(dGTP), 2, -deoxyadenosine- 5' -triphosphate(dATP), 2' -deoxythymidine-5' -triphosphate(dTTP) 및 2'— deoxy cytosine - 5' -triphosphate (dCTP) (이하 dNTPs 로 약함) 및 증류수 25.5㎕로 구성되었으며 여기에 각 조직 혹은 백혈구로부터 분리된 DNA 용액 5 ㎕를 각각 가하여 최종 용적이 50㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 변성 (denaturation), 결합(annealing) 및 중합(polymerization) 의 3 단계로 구성되어 30주기를 반복하였는데 변성반응은 95 ℃ 에서 1분, 결합반응은 60℃에서 1분, 그리고 중합반응은 72 ℃ 에서 30초간 반응시켰다.
- PCR 반응은 변성 (denaturation), 결합(annealing) 및 중합(polymerization) 의 3 단계로 구성되어 30주기를 반복하였는데 변성반응은 95 ℃ 에서 1분, 결합반응은 60℃에서 1분, 그리고 중합반응은 72 ℃ 에서 30초간 반응시켰다. PCR 산물을 요소를 포함하는 6% sequencing gel에 각 6㎕씩 부하하여 1시간 동안 전기영동한 후 X-ray film에 약 3일간 노출시켰다. PCR에 이용된 각 종양억제유전자들의 microsatellite marker의 염기배열은 다음과 같다 (Table 1).
- Film을 현상한 후 림프구에서 추출한 DNA의 띠 (band) 를 기준으로 이에 비해 종양측에서 하나 이상의 대립인자의 신호가 50% 이하로 의미있게 감소한 경우를 LOH호 판단하였으며, 림프구측에 비해 차이는 있으나 신호의 차이가 크지 않은 경우 또는 차이가 없는 경우를 저류(retention)으로 판단하였다. 또한 림프구측에 비해 신호가 증가한 경우를 증폭(amplification) 으로 판단하였으며, 림프구측에 존재하지 않는 띠가 나타나는 경우를 microsatellite instability로 판단하였다.
- 원격전이는 2예 모두 폐로의 전이였다. 11예의 두경부 편평상피세포암 조직에서 여섯 가지의 종양억제유전자들의 miscrosatellite marker 에 대한 LOH가 발견되는지를 DNA-PCR로 관찰하였다. 본 연구의 결과를 각 유전자별과 원발부위별로 나누면 다음과 같았다.
- 없었다. 이상의 결과를 도식화하여 나타내었다(Table 3, Fig. 3).
- 말초혈액 림프구에서는 bead-beating 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 두가지의 DNA는 모두 분광측광법을 이용하여 농도를 보정하였다. Microsatellite marker들은 r -32p로 표식을 하였으며 이를 polyacrylamide gel에 전기영동을 하여 확인하였다.
대상 데이터
- 영남대학교 의과대학 이비인후과학교 실에서 조직검사 상편평상피세포암으로 진단된 파라핀에 포매된 두경부 편평상피세포암 조직 11예와 동일 환자의 혈액에서 채취한 말초혈액 림프구 11예를 대상으로 하였다. .
- .유전자의 변이를 조사하기 위한 종양억제유전자로는 APC, EXT1, pl6, PTEN, DPC4, 및 FHIT 유전자 등을 이용하였으며, 이들 중 APC(D5S299, D5S82), EXT1 (D8S200, D8S85), PTEN (AFMa086Wg9, WI10275), 및 DPC4 유전자(D18S363, D18S46) 등에서는 두 가지의 microsatellite marker를 이용하였으며 pl6(D9SIFNA)과 FHIT 유전자(D3S1312)에서는 한 가지의 microsatellite marker를 이용하였다.
- 판명되었다. 이 중 4예에서는 한 가지 유전자의 microsatellite marker에 대해서만 LOH를 가지고 있었으며, 2 예는 2가지, 그리고 ENT 2에서는 APC(D5S299), EXT1(D8S200, D8S85), 그리고 DPC4(D18S46) 등 3가지 종양억제유전자의 4종류의 microsatellite marker의 LOH를 보였다. 종양억제유전자 중에서는 DPC4가 7예 중 4예 (57.
- Do 등(4)은 pl6과 진행된 암의 병기와 연관성이 있으며 후두암에서는 예후와 연관성이 있을 것이라 보고하였다. 본 연구에서는 8예 중 3예(37.5%)에서 LOH를 발견할 수 있었으며 1예(12.5%)에서 microsatellite instability 가 발견되어 총 4예(50.0%) 에서 이상을 발견할 수 있었으며 부위별로는 후두암이 3예 구인두암이 1예였다.
- 11예 중 후두암이 7예였으며, 전례에서 하나 이상의 유전자의 microsatellite marker에 대한 LOH를 가지고 있는 것으로 판명되었다. 이 중 4예에서는 한 가지 유전자의 microsatellite marker에 대해서만 LOH를 가지고 있었으며, 2 예는 2가지, 그리고 ENT 2에서는 APC(D5S299), EXT1(D8S200, D8S85), 그리고 DPC4(D18S46) 등 3가지 종양억제유전자의 4종류의 microsatellite marker의 LOH를 보였다.
이론/모형
- Xylene을 이용하여 파라핀에 포매된 두경부 편평상피세포암 조직으로부터 탈파라핀화 후 proteinase K 방법으로 DNA를 추출하였다. 말초혈액 림프구에서는 bead-beating 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.
성능/효과
- 판단하였다. 또한 림프구측에 비해 신호가 증가한 경우를 증폭(amplification) 으로 판단하였으며, 림프구측에 존재하지 않는 띠가 나타나는 경우를 microsatellite instability로 판단하였다. 한편 림프구측에서 띠가 나타나지 않는 경우에는 심험상의 오류로 판단(not informative) 하여 결과판정에서 제외하였다(Fig.
- 병리학적으로는 전례에서 편평 상피세 포암이었고, 분화정도는 6예에서 분화가 잘되어 있었고, 4예에서 중등도로 분화가 되어 있었으며 1예는 분화가 불량하였다.
- 전례에서 흡연의 과거력이 있었으며, 평균 흡연량은 39.1갑/일ㆍ년이었다. 음주 역시 1예를 제외한 10예가 음주자였다.
- 추적관찰은 최단 24개월에서 최장 96개월까지 시행되었으며 평균 추적관찰기간은 42개월이었다. 치료시행 후 3년의 시점에서 6예가 무병생존해 있었으며, 1예는 생존해 있으나 폐전이가 있는 상태였고, 나머지 4예는 병의 재발로 인해 사망하였다. 재발의 부위는 원발병소가 2예, 경부 림프절이 1예, 그리고 원격전이가 2예였다(Table 2).
- 2). 이 중 하인두암 환자인 ENT 7 에서는 두 개의 microsatellite marker 모두에서 LOH가 발견되었다 두 가지의 microsateUite marker를 모두 고려하면 11예 중 5예 (45.5%) 에서 최소한 하나의 APC gene의 microsatellite marker에서 LOH가 발견되었다. APC 유전자의 이상과 임상병기와의 상관관계를 보면 3기가 2예, 4기가 3예로 이상이 나타난 5예 모두가 진행된 병기였고 이러한 진행된 병기는 원발부위와의 연관성보다는 경부전이와 연관성이 있어 5예 중 4예(80.
- 5%) 에서 최소한 하나의 APC gene의 microsatellite marker에서 LOH가 발견되었다. APC 유전자의 이상과 임상병기와의 상관관계를 보면 3기가 2예, 4기가 3예로 이상이 나타난 5예 모두가 진행된 병기였고 이러한 진행된 병기는 원발부위와의 연관성보다는 경부전이와 연관성이 있어 5예 중 4예(80.0%)에서 경부림프절 전이가 있었다. 세포의 분화도와의 연관성은 알 수가 없었으며 5예 중 3예 (60.
- 이 중 후두암 환자인 ENT 2에서는 두 개의 microsatellite marker 모두에서 L0H가 발견되었다. 두 가지의 microsatellite marker를 모두 고려하면 11예 중 4예(36.4%)에서 최소한 하나의 EXT1 gene의 microsatellite marker에서 유전자의 이상이 발견되었다. EXT1 유전자의 이상과 임상양상과의 연관성을 찾기는 어려웠으나 4예 중 2예(50.
- DPC4 gene의 경우 중복되어 microsatellite marker의 이상이 나타난 경우는 없었다. 따라서 두 가지의 microsatellite marker를 모두 고려하면 11예 중 6예 (54.5%)에서 최소한 하나의 microsatellite marker에서 유전자의 이상이 발견되었다. DPC4 유전자와 임상양상과는 어떤 연관성을 찾기는 어려웠으나 6예 중 3예(50.
- 종양억제유전자와들 사이의 연관성을 보면 APC 유전자의 이상이 있는 5예 중 3예에서 EXT1 유전자의 이상이 발견되었으며, DPC4 유전자도 5예 중 2예에서 이상을 나타내었는데 2예 모두 EXT1 유전자에도 이상이 있는 경우였다. DPC4 유전자의 이상이 있는 경우에는 P16과도 2예에서 같이 발견되었으며 APC와는 무관하게 EXT1과 같이 나타난 경우도 1예가 있었다 총11예 중 7예에서 두 가지 이상의 유전자에 대해 동시에 이상을 나타내었다.
- 이 중 4예에서는 한 가지 유전자의 microsatellite marker에 대해서만 LOH를 가지고 있었으며, 2 예는 2가지, 그리고 ENT 2에서는 APC(D5S299), EXT1(D8S200, D8S85), 그리고 DPC4(D18S46) 등 3가지 종양억제유전자의 4종류의 microsatellite marker의 LOH를 보였다. 종양억제유전자 중에서는 DPC4가 7예 중 4예 (57.1%)에서 이상이 나타나 가장 높은 빈도를 보였으며 그 외에 pl6 도 6예 중 3예(50.0%)에서 이상이 있었으며 APC는 7예 중 2예(28.6%)에서 이상이 나타났다.
- 11예 중 하인두암은 2예였으며 2예 모두에서 둘 이상의 microsatellite marker에 대한 유전자적 이상을 가지고 있는 것으로 판명되었다. ENT 4에서는 informative한 4 종류의 microsatellite marker 중 2종류에서 L0H를 나타내었고, 한 종류에서는 증폭을 나타내어 총 3종류의 microsatellite mar- ker에서 이상을 보였다.
- 5)였다. 모든 microsatellite marker에서 informative하게 나타났으며 이 중 pTEN gene의 microsatellite marker인 AFMa086wg9 한가지에서만 LOH를 보였다.
- 8%에서 APC 유전자의 LOH가 있음이 보고되었다9). 본 연구에서는 11예 중 5예(45.4%)에서 최소한 한가지 이상의 microsatellite marker에 LOH가 나타났으며 후두암이 2예 하인두암이 2예 그리고 구인두암이 1예였다. 이상의 결과로 다양한 부위의 두경부암에서 APC 유전자의 이상이 있음을 알 수 있었다.
- 4%)에서 최소한 한가지 이상의 microsatellite marker에 LOH가 나타났으며 후두암이 2예 하인두암이 2예 그리고 구인두암이 1예였다. 이상의 결과로 다양한 부위의 두경부암에서 APC 유전자의 이상이 있음을 알 수 있었다. 임상양상과의 상관관계에서는 원 발병소의 병기와는 연관성이 없으나 5예 중 4 예(80.
- 1(EXT 1), Hpl3(EXT 2), 그리고 19q(EXT 3)등 세 개의 유전자위 (gene locus)를 가지고 있다11) 다른 종류의 종양에 대한 결과를 보면 대장 및 직장암 등12)에 관한 연구가 보고된 바 있다. 본 연구에서는 11예 중 3예 (27.3%)에서 최소한 한 가지 이상의 microsatellite marker에 LOH 를 나타내었고 유전자의 이상을 모두 고려하면 11예 중 4예(36.4%)에서 유전자의 이상 소견을 나타내었으며 이들은 후두암과 하인두암이 각 2예씩이었다.
- DPC4는 1996년 췌장암의 3분의 1에서 결손되어 있다고 해서 그 이름을 얻게 되었으며, 유전자에 대한 연구결과 tumor growth factor(TGF)—β의 signalling homologue인 Drosopila melanogastere의 mothers against dpp (MAD)단백질 및 Caenorhabditis elegans MAD homologue 인 sma-2, sma-3, sma-4와 동일한 염기서열을 가지고 있음이 밝혀졌다18). 이러한 결과로 DPC4가 종양억제유전자의 역할을 하면서 TGF-B signalling과 포유류의 성장에 중요한 역할을 할 것이라는 것이 밝혀졌다. 즉 DPC4 단백은 DNA의 특정 염기서열부위에 부착하여 TGF-B의 자극에 의한 유전자의 전사를 매개하는 역할을 하는 것이다.
- 국외적으로 두경부 편평상피세포암에 대한 연구가 어느 정도는 이루어져 있는 상태이지만19) 국내에서는 보고된 바가 없다. 본 실험에서는 11예 중 6예(54.5%)에서 최소한 하나의 microsatellite marker에서 유전자의 이상이 발견되었는데 이 중 후두암이 4예로 가장 많았으며 하인두암과 구인두암이 각 1예씩이었다.
- 또한 DPC4와 pl6도 서로 상관관계가 있을 수 있을 것으로 예상된다. 후두암 1예와 하인두암 1예 등 모두 2예에서는 APC 유전자와 EXT1 유전자 그리고 DPC4 유전자가 모두 이상이 있는 경우였다. 따라서 APC 유전자와 EXT1 유전자 그리고 DPC4 유전자가 상호 관련성을 가질 수 있을 것으로 사료된다.
- 후두암 1예와 하인두암 1예 등 모두 2예에서는 APC 유전자와 EXT1 유전자 그리고 DPC4 유전자가 모두 이상이 있는 경우였다. 따라서 APC 유전자와 EXT1 유전자 그리고 DPC4 유전자가 상호 관련성을 가질 수 있을 것으로 사료된다. 그 외에 구인두암 1예에서는 APC 유전자와 pl6 유전자 그리고 DPC4 유전자가 동시에 이상이 있는 경우였다.
- 그 외에 구인두암 1예에서는 APC 유전자와 pl6 유전자 그리고 DPC4 유전자가 동시에 이상이 있는 경우였다. 또한 FHIT를 제외한 5가지의 종양억제유전자 중 한 유전자의 이상이 있을 경우 많은 예에서 다른 유전자의 이상을 동반하는 것으로 보아 두경부 편평상피세포암의 발생에는 하나의 유전자만이 관련이 되는 것이 아니라 여러 가지의 유전자가 동시에 변이를 일으켜 암이 발생하는 것으로 생각된다. 또한 유전자의 중복이상과 임상양상과의 연관성은 찾을 수 없었지만 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 저자들이 분석한 6가지의 종양억제유전자 중 APC 유전자, P16 유전자 그리고 DPC4 유전자 등의 이상이 두경부 편평상피세포암에서 높은 빈도로 관찰되었다. 아울러 APC 유전자와 EXT1 유전자의 이상은 전이 및 재발과 연관이 있는 것으로 나타났고 또한 서로 동반되어 나타나 이들 종양억제유전자의 이상 분석은 두경부 편평상피세포암의 발암기전 연구뿐만 아니라 예후추정에도 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 종양억제유전자들 중 APC 유전자(45.4%), EXT1 유전자 (36.4%), DPC4 유전자(54.5%) 및 pl6 유전자(50.0%)에서는 이형접합성의 상실을 포함하는 유전자 이상이 비교적 높은 빈도로 관찰되었으나 PTEN 유전자는 낮은 빈도(22.2%)로 관찰되었고 FHIT 유전자에서는 이상을 발견할 수 없었다. 이 중 APC 유전자의 이상은 임상양상 중 경부림프절 전이 및 재발과 연관성이 높아 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다.
- 2%)로 관찰되었고 FHIT 유전자에서는 이상을 발견할 수 없었다. 이 중 APC 유전자의 이상은 임상양상 중 경부림프절 전이 및 재발과 연관성이 높아 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다. 그러나, 다른 유전자의 이상과 임상양상과의 연관성은 찾을 수 없었다.
- 또한 다른 종양억제유전자와의 연관성에 대한 결과를 보았을 때 APC 유전자와 EXT1 유전자 그리고 EXT1 유전자와 DPC4 유전자가 서로 상관관계가 있을 확률이 높다. 또한 FHIT와 PTEN을 제외한 4가지의 종양억제유전자 중 한 유전자의 이상이 있을 경우 많은 경우에서 다른 유전자의 이상을 동반하였지만 이러한 유전자의 중복이상과 임상양상과의 연관성은 찾을 수 없었다.
- 이상의 결과로 볼 때 APC, EXT1, pl6, 및 DPC4 유전자는 두경 부 편평 상피세포암의 발생에 종양억제유전자로서의 역할을 할 것으로 사료되며, 특히 APC 유전자는 경부 림프절 전이 및 예후와 연관성이 높을 것으로 사료된다. 또한 두경부 편평상피세포암의 발생에는 하나의 유전자만이 관련이 되는 것이 아니라 여러 가지의 유전자가 동시에 변이를 일으켜 암이 발생하는 것으로 생각된다.
- 없었다. 추적관찰은 최단 24개월에서 최장 96개월까지 시행되었으며 평균 추적관찰기간은 42개월이었다. 치료시행 후 3년의 시점에서 6예가 무병생존해 있었으며, 1예는 생존해 있으나 폐전이가 있는 상태였고, 나머지 4예는 병의 재발로 인해 사망하였다.
후속연구
- EXT1 유전자, pl6 유전자, PTEN 유전자, 그리고 DPC4 유전자의 이상과 임상양상과의 연관성은 찾을 수 없었으나 대상 환자의 수가 너무 작으므로 대상을 늘린 후 추가적인 분석이 필요할 것으로 사료된다.
- 본 실험에서는 FHIT 유전자의 이상을 발견할 수 없었다. 그렇지만 하나의 microsatellite marker에 대한 연구이므로 다른 microsatellite marker들을 더 많이 이용하여 실험을 진행한 후 결론을 내려야만 할 것으로 사료된다.
- 또한 FHIT를 제외한 5가지의 종양억제유전자 중 한 유전자의 이상이 있을 경우 많은 예에서 다른 유전자의 이상을 동반하는 것으로 보아 두경부 편평상피세포암의 발생에는 하나의 유전자만이 관련이 되는 것이 아니라 여러 가지의 유전자가 동시에 변이를 일으켜 암이 발생하는 것으로 생각된다. 또한 유전자의 중복이상과 임상양상과의 연관성은 찾을 수 없었지만 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 높은 빈도로 관찰되었다. 아울러 APC 유전자와 EXT1 유전자의 이상은 전이 및 재발과 연관이 있는 것으로 나타났고 또한 서로 동반되어 나타나 이들 종양억제유전자의 이상 분석은 두경부 편평상피세포암의 발암기전 연구뿐만 아니라 예후추정에도 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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