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문제 정의
- 이전의 연구에서 한국산 무당거미(NepMa davata)의 중장 (midgut)으로부터 우유단백질(casein)을 높은 효율로 분해하는 단백질 분해효소를 분비하는 장내세균을 분리하였으며 계통분류와 수리분류학적인 분석으로 이 장내세균은 Serratia proteamaculane 속하는 것으로 동정되었다(35). 본 연구에서는 이 S. pmteamaculans 에서 분비성 단백질 분해효소를 순수분리하고 그 생화학적 특성을 규명하였다.
- 금속 이온은 가수분해 반응을 촉진하는 금속성 효소의 충요한 조효소이다(11). 본 연구에서는 다양한 금속이온의 순수 분리된 효소의 단백질 분해능에 대하여 조사하였다. 1, 5, 10mM의 농도로 다양한 금속 이온#등과 같이 배양하였다.
제안 방법
- 효소 활성 측정 방법은 Braun과 Schntz(7)의 방법을 약간 변형 하여 405nm 에서 분광광도계 (Spectrophotometer DU-650, Beckman, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 0.
- pH에 대한 영향을 조사하기 위하여 5mM ZnC.의 존재 하에 azocasein을 기질로 사용하여 pH 3.0 부터 pH 12.0 까지 단백질 분해활성을 측정하였다. pH 3.
- 활성은 완충 용액에 효소를 넣어 3TC에서 30분간 반응시킨 후 측정되었다. 효소의 최적온도를 측정하기 위해, 효소를 각각 10, 20, 30, 40. 50, 60, 70, 80℃ 에서 1시간동안 미리 반응시킨 뒤, ZnCL의 존재 하에 50 mM phosphate 완충용액 (pH 7.
- 효소의 최적온도를 측정하기 위해, 효소를 각각 10, 20, 30, 40. 50, 60, 70, 80℃ 에서 1시간동안 미리 반응시킨 뒤, ZnCL의 존재 하에 50 mM phosphate 완충용액 (pH 7.8)의 1% azocasein 에 첨가해서 3TC에서 30분 반응시킨 뒤, 단백질 분해효소의 역가를 측정하였다.
- 금속이온이 효소활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 CaCl2, MgSO4, CoCl2, MnCl2, ZnCl2, FeSO4, CuSO4, 그리고 I&SQ(를 최종농도가 각각 1, 5, 10mM이 되게 첨가한 뒤, 3TC에서 30분 간 전처리를 한 다음 단백질 분해활성을 측정하였다.
- 단백질분해효소 저해제에 대한 효과를 알아보기 위해 aspartate protease의 저해제인 pepstatin A (Sigma, USA), trypsin의 저해제인 antipain hydrochloride (Sigma, USA), cystine protease 의 저해제인 E-64(N-(trans-Epoxysuccinyl)-L-leucine 4-guanidinobutylamide) (Sigma, USA), chymotiyp의 저해제인 chymostatin (Calbiochem, Germany), extracellular protease의 저해제인 leupeptin (Sigma, USA), serine protease의 저해제인 pefabloc SC (Roche, Germany), aprotinin (Sigma, USA), PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) (Sigma, USA), metalloprotese 저해제인 phosphoramidon disodium salt (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), 1, 10-phenanthroline들을 각각 ImM의 동일 농도로 37C에서 5분간 전처리를 한 다음, 효소 활성을 측정하였다.
- 단백질분해효소의 특성을 규명하기 위하여 먼저 단백질 분해 효소를 배양액으로부터 filtration과 DEAE-cellulose 및 Sephadex G-75 크로마토그래피를 사용하여 순수 분리하였다. 0.
- 3 배 높은 활성으로 분리되는 것으로 밝혀졌다. 활성을 가지는 분획을 다시 Sephadex G-75를 사용한 gel filtration 분리를 시도하였으며 38.4 배 높은 활성을 가지는 분획을 분리하였다(Table 1). SDS-PAGE로 분리하고 Coomassie Brilliant Blue R-250로 염색하고 densitometry를 사용하여 분석한 결과 최종 단계의 순수도는 95% 정도로 계산되었다(Fig.
- S. proggcs에서 분리된 52kD 단백질 분해효소의 활성을 여러가지 물리적인 조건에서 조사하였다. 단백질분해효소의 활성은 pH 8.
- 단백질분해효소의 작용기작을 이해하기 위해 다양한 종류의 단백질분해효소 저해제로 전처리한 후 단백질 분해능을 조사하였다. 먼저 순수 분리된 효소를 37℃에서 5분 동안 1 mM의 단백질 분해효소와 함께 배양한 후 단백질 분해능을 측정하였다.
- 단백질분해효소의 작용기작을 이해하기 위해 다양한 종류의 단백질분해효소 저해제로 전처리한 후 단백질 분해능을 조사하였다. 먼저 순수 분리된 효소를 37℃에서 5분 동안 1 mM의 단백질 분해효소와 함께 배양한 후 단백질 분해능을 측정하였다. antipain, aprotinin, pefabloc SC, chymostatin, phosphoramidon, leupeptin, E-64, PMSF등은 주목할 만한 저해효과를 보이지 않았 다(Fig.
- 5 배 증가시켰다(자료미제시). 단백질 분해능에 대한 다양한 금속 이온에 대한 효과를 조사하기 위하여, 먼저 5mM의 EDTA의 완충 용액에서 배양한 후 다시 금속 이온과 배양하고 분해능을 조사하였다. 0~20 mM의 농도로#등을 처리하였을 때, 5 mM의 금속이온을 첨가한 경우 금속이온을 첨가하지 않은 조건에 비해 대부분 2-4 배 정도로 활성이 증가되었다.
- 본 연구에서는 거미의 중장에서 분리한 장내세균인 5. proteamaculans에서 분비되는 단백질분해효소의 생화학적인 특성을 조사하였다. 순수 분리된 단백질분해효소는 여러가지 생화학적 특성으로 인하여 이전의 많은 연구에서 이미 보고된 바 있는 serralysin 군에 속하는 단백질 분해효소로 사료된다.
- 순수 분리된 단백질분해효소는 여러가지 생화학적 특성으로 인하여 이전의 많은 연구에서 이미 보고된 바 있는 serralysin 군에 속하는 단백질 분해효소로 사료된다. 첫째, 이 단백질의 분자량은 serralysin 군의 단백질분해효소와 같은 52kD로 SDS-PAGE에서 계산되었다. 둘째, 본 단백질분해효소는 세포외 로 분비되는 효소이며 azocasein을 기질로 사용한 실험에서 다른 대부분 serralysin 군의 효소와 활성도가 비슷하였다.
- 3). 금속이온의 치환제인 EDTA와 EGTA가 단백질 분해능에 미치는 영향을 좀 더 자세히 조사하기 위하여 1, 5, 10, 20, 50mM의 농도에서 전처리한 후 단백질 분해능을 조사하였다. 단백질 분해능의 EGTA에 의한 현저한 저해는 관찰되지 않았지만, 5mM의 EDTA는 약 70% 정도의 분해능을 저해하였고 20mM의 농도로 전처리한 경우에는 대부분의 단백질 분해능을 제거하였다(Table 2).
대상 데이터
- 본 연구에서는 한국산 무당거미(Nep/Wa davma)에서 분리한 Serratia pmteamaculans strain KCTC 2390를 야생형으로 사용하 였다(35). 이 균주는 Luria-Bertani (LB), skim milk (skim milk 1%, yeast extract 0.
- SDS-PAGE(10%)는 Laemmli (27)의 방법으로 수행하였다. 사용한 분자량 측정 marker로는 phosphorylase b (103 kD), BSA (77 kD), ovalbumin (50 kD), carbonic anhydrase (34.3 kD), soybean trypsin inhibitor (28.8 kD), lysozyme (20.7 kD) (Prestained SDS- RA.GE Standards, low range, Bio-Rad, USA) 등을 사용하였다.
이론/모형
- 0 증가시키는 데 필요한 효소의 양으로 정하였다. 단백질은 BSA를 표준 단백질로 하여 Bradford(6)의 방법에 따라 정 량되었다.
- SDS-PAGE(10%)는 Laemmli (27)의 방법으로 수행하였다. 사용한 분자량 측정 marker로는 phosphorylase b (103 kD), BSA (77 kD), ovalbumin (50 kD), carbonic anhydrase (34.
성능/효과
- 단백질분해효소의 특성을 규명하기 위하여 먼저 단백질 분해 효소를 배양액으로부터 filtration과 DEAE-cellulose 및 Sephadex G-75 크로마토그래피를 사용하여 순수 분리하였다. 0.15M 과 0.2M NaCl 농도의 분획에서 단백질의 분해능이 세포배양액과 비교하였을 때 6.3 배 높은 활성으로 분리되는 것으로 밝혀졌다. 활성을 가지는 분획을 다시 Sephadex G-75를 사용한 gel filtration 분리를 시도하였으며 38.
- 4 배 높은 활성을 가지는 분획을 분리하였다(Table 1). SDS-PAGE로 분리하고 Coomassie Brilliant Blue R-250로 염색하고 densitometry를 사용하여 분석한 결과 최종 단계의 순수도는 95% 정도로 계산되었다(Fig. 1, LaneP). 분리된 효소를 SDS-BXGE 한 결과 zymogram으로 분석한 것과 마찬가지로 약 52 kD 정도의 크기를 가지는 것으로 계산되었다.
- 1, LaneP). 분리된 효소를 SDS-BXGE 한 결과 zymogram으로 분석한 것과 마찬가지로 약 52 kD 정도의 크기를 가지는 것으로 계산되었다.
- proggcs에서 분리된 52kD 단백질 분해효소의 활성을 여러가지 물리적인 조건에서 조사하였다. 단백질분해효소의 활성은 pH 8.0과 8.5에서 가장 높은 활성을 보였으며 pH 5.0과12.0사이에서 최대 활성의 80% 정도를 가지고 있는 것으로 관찰 되었다(Fig. 2A). 효소활성의 최적온도를 조사하기 위하여 4 ℃ 와 80℃ 사이에서 효소의 활성을 측정하였을 때 37℃에서 최대의 활성을 나타내었으며 45℃에서는 약 24% 및 70。(2에서는 약 16%의 활성이 유지되는 것으로 밝혀졌다(Fig.
- 금속이온의 치환제인 EDTA와 EGTA가 단백질 분해능에 미치는 영향을 좀 더 자세히 조사하기 위하여 1, 5, 10, 20, 50mM의 농도에서 전처리한 후 단백질 분해능을 조사하였다. 단백질 분해능의 EGTA에 의한 현저한 저해는 관찰되지 않았지만, 5mM의 EDTA는 약 70% 정도의 분해능을 저해하였고 20mM의 농도로 전처리한 경우에는 대부분의 단백질 분해능을 제거하였다(Table 2).
- 첫째, 이 단백질의 분자량은 serralysin 군의 단백질분해효소와 같은 52kD로 SDS-PAGE에서 계산되었다. 둘째, 본 단백질분해효소는 세포외 로 분비되는 효소이며 azocasein을 기질로 사용한 실험에서 다른 대부분 serralysin 군의 효소와 활성도가 비슷하였다. 셋째, 넓은 pH 범위와 넓은 온도범위에서 상대적으로 높은 활성을 가지고 있다.
- 둘째, 본 단백질분해효소는 세포외 로 분비되는 효소이며 azocasein을 기질로 사용한 실험에서 다른 대부분 serralysin 군의 효소와 활성도가 비슷하였다. 셋째, 넓은 pH 범위와 넓은 온도범위에서 상대적으로 높은 활성을 가지고 있다. 넷째, 금속이온의 치환제인 edtA에 의해서 활성이 현저히 저해를 받으며 Zn2+, Ca2+, Mt2+등 금속 이온에 의해 활성이 증가된다.
- 셋째, 넓은 pH 범위와 넓은 온도범위에서 상대적으로 높은 활성을 가지고 있다. 넷째, 금속이온의 치환제인 edtA에 의해서 활성이 현저히 저해를 받으며 Zn2+, Ca2+, Mt2+등 금속 이온에 의해 활성이 증가된다. 또한 Zinc metalloprotease 의 저해제인 1, 10- phenanthroline에 활성이 완전히 저해되는 금속성 단백질분해효소 의 특성을 가지고 있기 때문이다.
후속연구
- 곤충에서 분리된 Serratia 속에 속하는 많은 세균들이 공생관계나 병원성을 가지는 것으로 알려져 있다 (37). 거미가 포획한 먹이에 소화액을 주입하여 단시간에 분해 시키는 강력한 소화효소를 분비한다는 습식습관을 볼 때, 이 거미의 장내 세균인 S. proteamaculans 분비하는 금속성 단백질분해효소가 넓은 범위의 온도와 pH에서 활성이 높으며 거미의 소화를 도와주는 역할을 할 것이라 생각할 수 있다. 또한, 대부분의 장내 세균이 만들 어내는 Serralysin 군의 단백질분해효소는 그들의 숙주에 병원성 으로 작용하는 것으로 보아(16, 17) 이 S.
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