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제안 방법
- Oxidase 활성은 filter paper위에서 tetramethyl-p-phenylene- diamine의 산화능력으로 조사하였다(11). Catalase 활성은 3% 과산화수소용액을 사용하여 기포 생성 여부로 관찰하였다(11). Indole 생성은 1% trypton 용액을 사용하여 검사하였다(11).
- Indole 생성은 1% trypton 용액을 사용하여 검사하였다(11). Citrate 이용능력은 Simmon's citrate agar (MgSO4, 0.2 g; NH4H2PO4, 1 g; KJIPO” 1 g; NaCl, 5 g; . 2H2O, 5 g; brom thymol blue, 0.08 g; Agar, 15 g/l、Difco) 배지를 사용하였고, urease는 Christensen urea agar (peptone, 1 g; glucose, 1 g; NaCl, 5 g; KH2PO4, 2 g; phenol red, 0.012 g; Agar, 20 g/l) 배지를 사용흐]였으며, H2S 생성은 kligler's iron agar 배지를 이용하여 검증하였다 (3). Nitrate 환원과 탈질산화는 Durham's tube를 사용하여 질소가스의 생성 여부로 조사하였다 (11).
- 012 g; Agar, 20 g/l) 배지를 사용흐]였으며, H2S 생성은 kligler's iron agar 배지를 이용하여 검증하였다 (3). Nitrate 환원과 탈질산화는 Durham's tube를 사용하여 질소가스의 생성 여부로 조사하였다 (11). 아미노산 (Sigma, St.
- 개체별 소화관 내 미생물 군집을 조사하기 위하여임의로 선발된 한국산 무당거미 자성 성체로부터 개체별로 소화관을 적출하 여 미생물 군집을 계수하였다. 호기적으로 배양된 미생물 군락을 육안으로 구분하여 계수한 결과 개체별로는 103 〜 106 CFUs/ spider로 10개체를 통합하여 처리하였을 때와 유사하였으나 미생물군종은 개체별로 차이가 심하여 다양한 군종이 나타나는 개체와 일부 군종만이 나타나는 개체로 크게 구분되었다 (Table 1B).
- 5~2 ml에 첨가하여 homogenization 후 연속 희석법으로 희석하여 plate count agar(PCA, Difco) 배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양하면서 매일 관찰하여 군종별로 관찰하였다. 군종별 계수는 육안으로 서로 다르게 보이는 미생물군집을 임의로 구분하여 수행하였으며 2차에 걸쳐 반복 실험하였다.
- 5%) 개가 지질분해능을 나타내었다. 그리고 개체별 미생물군집 조사에서 나타난 수종의 미생물 군락을 색깔, 형태 등 육안으로 구분이 가능한 방법으로 구분하고, 군종별로 1 균주씩 순수 분리하여 단백질 및 지질 분해능력을 조사하였다. 그 결과 순수 분리된 미생물 30균 주 중 단백질 또는 지 질 분해능을 갖는 균주가 각각 19균주(63.
- 미생물 군집의 조사에서 계수된 군종별로 3~5군락을 임의로 선택하여 단일 군락으로 순수 분리하였다. 순수 분리된 총 60여 균주의 미생물을 배지상에서의 군락의 형태와 광학현미경 관찰 및 그람 염색으로 그람 음성균과 그람 양성균으로 구분하였다.
- 본 연구에서는 최근 생물학적 방제의 매개체로서 각광을 받고 있는 거미 중 대형의 곤충도 포식할 수 있어 비교적 소화관이 잘 발달했을 것으로 생각되는 갈거미과 무당갈거미 속 중 유일하게 국내에서식하는 한국산 무당거미 (Nephila clavata)의 소화관 내 미생물의 분포 양상과 단백질 및 지질분해능을 조사하였고, 배양 가능한 장내 미생물을 분리하고 동정하였다.
- 한국산 무당거미 10마리의 개체로부터 미리 살균하여 준비된 면도날과 핀셋으로 거미의 큐티클성 외피를 조심스럽게 벗긴 후 소 화관(digestive tract, DT)을 분리하였다. 분리적출된 소화관을 멸균된 생리식염수 0.5~2 ml에 첨가하여 homogenization 후 연속 희석법으로 희석하여 plate count agar(PCA, Difco) 배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양하면서 매일 관찰하여 군종별로 관찰하였다. 군종별 계수는 육안으로 서로 다르게 보이는 미생물군집을 임의로 구분하여 수행하였으며 2차에 걸쳐 반복 실험하였다.
- 이들은 11종의 그 람음성균과 11종의 그람양성균으로 구분되었으며 동정을 위하여 생리 . 생화학적 특성 조사 및 세포지방산을 분석하였다.
- 광학현미경은 Nikon의 microphot-FXA 위상차현미경을 사용하였다. 세균의 편모와 형태를 관찰하기 위하여, 1% P1A를 사용하여 세균을 음염색하고, Philips의 CM20 투과 전자 현미경으로 관찰하였다. 주사 전자현미경으로 관찰하기 위하여 미생물을 2% glutaraldehyde(v/v)오} 0.
- 미생물 군집의 조사에서 계수된 군종별로 3~5군락을 임의로 선택하여 단일 군락으로 순수 분리하였다. 순수 분리된 총 60여 균주의 미생물을 배지상에서의 군락의 형태와 광학현미경 관찰 및 그람 염색으로 그람 음성균과 그람 양성균으로 구분하였다. 일차 구분된 미생물을 세포 지방산 분석으로 분류하여 동일 종 을 제외하고 총 22종의 미생물을 선택하였다.
- Nitrate 환원과 탈질산화는 Durham's tube를 사용하여 질소가스의 생성 여부로 조사하였다 (11). 아미노산 (Sigma, St. Louis, Missouri USA) 의 decarboxylation 은 Moeller b* ase 사용하여 조사하였으며, 이에 사용된 모든 시험관에 멸균된 mineral oil을 떨어뜨렸다 (3). 탄소원으로부터의 산 생 성은 Leifson의 방법에 의해 결정하였다 (8).
- 한국산 무당거미 자성 성체로부터 소화관(중장, 가지 창자, 후장)을 분리하고 homogenization하여 전체 군집을 계수하고 그 결과에 근거하여 한plate당 30-300 CFU가 형성되도록 nutrient agar(NA, beef extract, 3 g; peptone, 5 g, Difco, USA) 배지에 도말하여 3(TC에서 3〜4일 동안 계속적으로 colony 형성을 관찰하였다. 이렇게 형성된 colony 중강한 단백질 분해능력을 보이는 균주를 선발하기 위하여 3% skim milk를 함유하는 brain heart infusion(BHI, calf brains, 200 g; beef heart, 250 g; proteose peptone, 10 g; dextrose, 2 g; NaCl, 5 g; NazPQ, 2.5 g/l, Difco, USA) 배지에 이들을 picking하고 30℃에서 15〜 18시간 배양하여 단백질 분해효소의 분비능력을 확인하였다. 지질 분해능은 NA(Difco) 배지에 1% tributyrin 및 3~5% tween 80(v/v)을 함유하는 배지를 이용하여 확인하였다.
- 세균의 편모와 형태를 관찰하기 위하여, 1% P1A를 사용하여 세균을 음염색하고, Philips의 CM20 투과 전자 현미경으로 관찰하였다. 주사 전자현미경으로 관찰하기 위하여 미생물을 2% glutaraldehyde(v/v)오} 0.1 M sodium cacodylate pH 7.4 완충용액에서 2시간 동안 고정하였고, 에탄올의 농도를 증가시키면서 탈수시킨 후, 임계점 건조기를 이용하여 건조하고 금으로 증착하였다.
- 5 g/l, Difco, USA) 배지에 이들을 picking하고 30℃에서 15〜 18시간 배양하여 단백질 분해효소의 분비능력을 확인하였다. 지질 분해능은 NA(Difco) 배지에 1% tributyrin 및 3~5% tween 80(v/v)을 함유하는 배지를 이용하여 확인하였다.
- 탄소원으로부터의 산 생 성은 Leifson의 방법에 의해 결정하였다 (8). 추가적인 생화학 실험은 API 20E, API 20NE(BioMerieux St. Louis, Missouri USA), Biolog GN, 그리고 Biolog GP(BIOLOG, MicroLogTM System, Release 4.0)의 상용되는 kit를 이용하여 수행하였다.
- 야외에서 채집하여 온 한국산 무당거미 자성 성체를 60일간 굶긴 후 70% 에탄올로 거미의 표면을 살균하여 사용하였다. 한국산 무당거미 10마리의 개체로부터 미리 살균하여 준비된 면도날과 핀셋으로 거미의 큐티클성 외피를 조심스럽게 벗긴 후 소 화관(digestive tract, DT)을 분리하였다. 분리적출된 소화관을 멸균된 생리식염수 0.
- 한국산 무당거미 자성 성체로부터 소화관(중장, 가지 창자, 후장)을 분리하고 homogenization하여 전체 군집을 계수하고 그 결과에 근거하여 한plate당 30-300 CFU가 형성되도록 nutrient agar(NA, beef extract, 3 g; peptone, 5 g, Difco, USA) 배지에 도말하여 3(TC에서 3〜4일 동안 계속적으로 colony 형성을 관찰하였다. 이렇게 형성된 colony 중강한 단백질 분해능력을 보이는 균주를 선발하기 위하여 3% skim milk를 함유하는 brain heart infusion(BHI, calf brains, 200 g; beef heart, 250 g; proteose peptone, 10 g; dextrose, 2 g; NaCl, 5 g; NazPQ, 2.
- 한국산 무당거미 총 10개체의 소화관에서 계수된 미생물 군 집중 일부를 선택하여 단백질 또는 지질분해능을 확인하였다. 선택된 미생물 colony 40개 중에서 38(95%) 개가 단백질 분해능을 나타내었고.
- 한국산 무당거미의 소화관 내 미생물 군집의 분포는 호기적으로 배양된 미생물 군락을 색깔, 형태 등 육안으로 구분이 가능한 방법으로 우선적으로 구분하여 각각의 군종을 따로 계수하였다. 통합한 10개체의 소화관에서 계수된 총 개체수는 103~105 CFUs/spider로 계수되었으며, 미생물군종별로는 수십CFU에서 104 CFU까지 다양하게 분포하였다(Table 1A).
대상 데이터
- 실험 곤충은 1997년 9부터 10월까지와 1998년 8월부터 10월까지 대전 및 충청남도 일원의 야외에서 채집한 무당거미 (Nephila davata)를 한국생명공학연구원 곤충자원실의 곤충 사육실(온도, 25+1℃; 상대습도, 60%; 광주기 16L:8D)에서 사육하면서 실험에 이용하였다.
- 야외에서 채집하여 온 한국산 무당거미 자성 성체를 60일간 굶긴 후 70% 에탄올로 거미의 표면을 살균하여 사용하였다. 한국산 무당거미 10마리의 개체로부터 미리 살균하여 준비된 면도날과 핀셋으로 거미의 큐티클성 외피를 조심스럽게 벗긴 후 소 화관(digestive tract, DT)을 분리하였다.
- 순수 분리된 총 60여 균주의 미생물을 배지상에서의 군락의 형태와 광학현미경 관찰 및 그람 염색으로 그람 음성균과 그람 양성균으로 구분하였다. 일차 구분된 미생물을 세포 지방산 분석으로 분류하여 동일 종 을 제외하고 총 22종의 미생물을 선택하였다. 이들은 11종의 그 람음성균과 11종의 그람양성균으로 구분되었으며 동정을 위하여 생리 .
데이터처리
- Carrier gas는 고순도의 수소를 사용하였으며, 온도는 170℃에서 270℃로 분당 5℃씩 상승하도록 프로그램하였다. Fatty acid methyl esters의 분석과 정량은 MIS library generation software (Microbial ID)를 사용하여 수행하였으며, 결과는 MIDI Aerobe Library (version 3.8)와 비교하였다.
이론/모형
- 세포지방산의 성분을 조사하기 위하여 분리된 미생물을 trypticase soy agar에서 28℃로 24시간 동안 배양하였다. Fatty acid methyl esters는 Guckert 등(4)의 방법에 의해 준비하였고, 5% phenyl methyl silicone으로 채워진 silica capillary column (0.2 mm by 25 m; Hewlett-Packard)과 flame ionization detector 가 갖춰진 Hewlett-Packard 의 5890A gas chromatograph를 이용하여 분리하였다. Carrier gas는 고순도의 수소를 사용하였으며, 온도는 170℃에서 270℃로 분당 5℃씩 상승하도록 프로그램하였다.
- 미생물을 순수 분리하기 위한 colony의 형태 관찰은 색깔, 크기, 모양, elevation과 margin 등을 구분하는 방법으로 수행하였다(3, 7, 11). 광학현미경은 Nikon의 microphot-FXA 위상차현미경을 사용하였다. 세균의 편모와 형태를 관찰하기 위하여, 1% P1A를 사용하여 세균을 음염색하고, Philips의 CM20 투과 전자 현미경으로 관찰하였다.
- Louis, Missouri USA) 의 decarboxylation 은 Moeller b* ase 사용하여 조사하였으며, 이에 사용된 모든 시험관에 멸균된 mineral oil을 떨어뜨렸다 (3). 탄소원으로부터의 산 생 성은 Leifson의 방법에 의해 결정하였다 (8). 추가적인 생화학 실험은 API 20E, API 20NE(BioMerieux St.
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