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문제 정의
- 본 연구에서는 곤충 장내미생물이 생산하는 효소의 산업적 이용 가능성에 대한 조사로서 10여종의 곤충 및 일부 무척추동물로부터 lipase를 생산하는 미생물을 탐색하였으며, 그 중에서 톱히늘소의 장으로부터 우수한 lipase 생산균주를 분리하고 lipase의 생산 특성을 조사하였다.
가설 설정
- HY-10 at various conditions. A: lipase production through cultivation of HY-10 on M9 medium contained different carbon sources. B: effect of olive oil contents on lipase production.
- A: lipase production through cultivation of HY-10 on M9 medium contained different carbon sources. B: effect of olive oil contents on lipase production. C: effect of temperatures on lipase production.
- B: effect of olive oil contents on lipase production. C: effect of temperatures on lipase production. D: cell growth and lipase production.
- C: effect of temperatures on lipase production. D: cell growth and lipase production.
- b: pNP-butyrate was used as substrate.
- c: pNP-palmitate was used as substrate.
- d: developmental stages of insect were represented as: E(egg), F(female adult), M(male adult), L(larvae).
제안 방법
- Microplate assay는 p-nitrophenyl-ester (pNP-ester)를 기질로 사용하여 유리되는 p-nitrophenol의 양을 분광광도계(Smart Spec 3000, Bio-Rad, USA)를 이용한 405 nm에서의 흠광도 증가량으로 측정하였으며 반응액은 기질의 종류에 따라 두 가지 방법으로 혼합하였다. Ester carbon 의 길이가 12개 이하의 탄소수를 가지는 기질의 경우 (pNP-butyrate) acetonitrile로 녹인 10 mM pNP-butyrate 5 吸 ethanol 5 吸 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) 180 以와 효소액 10 畝를 섞은 다음 37℃에서 10 분간반응 후 405 nm에서의 흡광도를 측정하였고 long chain pNP-estcr인 pNP-palmitate를 기질로 사용할 경우 10 成 의 효소액과 170 成의 buffer 혼합액(50 mM phosphate buffer containing 0.1% gum arabic and 0.2% deoxycholate), 그리고 isoprophanol로 녹인 8 mM의 기질 20 以를 혼합하여 동일한 조건으로 반응을 실시하였다 효소의 unit 측정은 1분간 1 um이의 pNP를 생성하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.
- 활성의 크기는 오렌지색의 분해환의 지름을 상대적으로 나타내었다(+, 2-4 mm; ++, 4-8 mm; +++, 8-12 mm; ++++, 12 mm 이상). Microplate assay는 p-nitrophenyl-ester (pNP-ester)를 기질로 사용하여 유리되는 p-nitrophenol의 양을 분광광도계(Smart Spec 3000, Bio-Rad, USA)를 이용한 405 nm에서의 흠광도 증가량으로 측정하였으며 반응액은 기질의 종류에 따라 두 가지 방법으로 혼합하였다. Ester carbon 의 길이가 12개 이하의 탄소수를 가지는 기질의 경우 (pNP-butyrate) acetonitrile로 녹인 10 mM pNP-butyrate 5 吸 ethanol 5 吸 50 mM phosphate buffer (pH 7.
- 미생물의 16S rDNA 증폭을 위한 PCR amplificatione 균주로부터 분리한 total DNA를 template로 하여 FastStart Taq polymerase kit (Roche, Germany)을 이용하였으며 PCR에 이용된 primei■는 27F: 5'-agagtttgatcmtggctcag-3', 1492R: 5-ggttaccttgttacgactt- 3, 를 각각 forward 및 reverse primer로 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간의 denaturation을 수행한 후 94℃ 에서 30초의 denaturation, 65℃에서 30초의 annealing, 72℃에서 3분의 extension을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 extension으로 마무리하고 4℃에서 유지되었다 이렇게 확보된 PCR 산물의 염기서열을 결정하여 GenBank data base 검색을 통하여 16S rDNA의 상동성을 조사하였다. 생리 .
- 곤충의 장내에 존재하는 lipase 생산 미생물의 탐색을 위하여 검정하늘소(卬(衣〃s buprestoides\ 땅강아지 (Gryllotalpa africana), 멋쟁이딱정벌레妇” Jankovskii), 붉은산꽃하늘소(C。以诚기, rubra), 울도하늘소(户ssz沥用 hilaris), 재붙이등에(74况〃?必 trigeminus), 꼽추재주나방 (Rabtala cristata), 줄지렁이fetidd), 톱하늘소 (Prionus insularis), 녹색박각시나방(CW如沥히㎛ tatarinovil) 을 포함하는 10종의 곤충 성충 또는 유충으로부터 olive oil과 Rhodamin B가 포함된 R2A agar 배지에서 1차적으로 선별 후 액체배양을 통하여 9종의 우수한 lipase 생산 균주를 분리하였다(Table 1). 분리된 균주의 16S rDNA partial sequencing과 data base 검색 결과 Burkholderia 속, Serratia 속, Pseudomonas 속, Acinetobacter w속 등 주로 G(-)의 균주들이 lipase 생산균주로 밝혀졌으며 균혈증(bacteraemia)에 관련된 균주로 알려진 Cedecea neteri (Farmer et al.
- 대상곤충에서 미생물을 분리하기 위한 해부는 Heo등(2006)이 사용한 방법으로 실시하였다. 대상곤충을 멸균된 Petri-dish에 놓고 70% (w/w) 에탄올에 1-2분 정도 침지하여 충체 표면의 오염원을 제거한 후, 충체에 묻어있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 2번 세척하였다. 증류수로 세척 한 후 핀셋과해부셋트를 이용하여 대상곤충의 내장을 꺼내 100 以의 phosphate buffered saline (PBS, 0.
- 생화학적 특성조사 및 미생물의 세포지방산 조사를 하였다. 미생물의 16S rDNA 증폭을 위한 PCR amplificatione 균주로부터 분리한 total DNA를 template로 하여 FastStart Taq polymerase kit (Roche, Germany)을 이용하였으며 PCR에 이용된 primei■는 27F: 5'-agagtttgatcmtggctcag-3', 1492R: 5-ggttaccttgttacgactt- 3, 를 각각 forward 및 reverse primer로 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간의 denaturation을 수행한 후 94℃ 에서 30초의 denaturation, 65℃에서 30초의 annealing, 72℃에서 3분의 extension을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 extension으로 마무리하고 4℃에서 유지되었다 이렇게 확보된 PCR 산물의 염기서열을 결정하여 GenBank data base 검색을 통하여 16S rDNA의 상동성을 조사하였다.
- 상기의 방법으로 1차 선별된 균주들을 1% 올리브오일이 함유된 제한 배지(6.8 잉 2 Na2HPO4, 3 입 2 KH2PO4, 0.5 입 2 NaCl, 1 입 Q NHQ, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCI2, 5 입 0 yeast extract) 3 戒에 접종하여 25℃의 진탕 배양기에서 48시간 배양 및 원심분리한 후 싱등액을 회수하여 lipase 활성을 측정하고, 그 중 lipase 활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다.
- 5% olive oil°] 포함된 M9 media에 균주를 접종한 다음 각각 25, 30, 37℃에서 48시간 배양하며 lipase의 생산량을 측정하였다. 생균수의 측정은 0.5% yeast extract, 0.5% olive oil°] 포함된 M9 media에서 25 ℃, 180 rpm의 조건으로 배양하며 각 시간별로 시료를 채취한 다음 단계적으로 희석하여 colony forming unit를 측정하였다.
- 1A) 분자생물학적, 생리 . 생화학적 동정을 실시하였다. HY-10 균주는 G(・)의 간구균으로서 0.
- 자세한 분석을 위해 생리 . 생화학적 특성조사 및 미생물의 세포지방산 조사를 하였다. 미생물의 16S rDNA 증폭을 위한 PCR amplificatione 균주로부터 분리한 total DNA를 template로 하여 FastStart Taq polymerase kit (Roche, Germany)을 이용하였으며 PCR에 이용된 primei■는 27F: 5'-agagtttgatcmtggctcag-3', 1492R: 5-ggttaccttgttacgactt- 3, 를 각각 forward 및 reverse primer로 사용하였다.
- 0% 까지 첨가하여 48시간 배양을 실시하였으며 그 과정에서 lipase의 생산량을 측정하였다. 온도에 따른 lipase의 생산조건을 조사하기 위하여 0.5% yeast extract, 0.5% olive oil°] 포함된 M9 media에 균주를 접종한 다음 각각 25, 30, 37℃에서 48시간 배양하며 lipase의 생산량을 측정하였다. 생균수의 측정은 0.
- 로서 현탁하여 Petri dish 에 25 ml 씩 분주하였다. 이렇게 만들어진 배지에 미생물을 접종 후 24C 또는 30℃에서 48시간 배양하여 생성되는 olive oil의 분해 환을 UV light 위에서 관찰하였다. 활성의 크기는 오렌지색의 분해환의 지름을 상대적으로 나타내었다(+, 2-4 mm; ++, 4-8 mm; +++, 8-12 mm; ++++, 12 mm 이상).
- 대상곤충을 멸균된 Petri-dish에 놓고 70% (w/w) 에탄올에 1-2분 정도 침지하여 충체 표면의 오염원을 제거한 후, 충체에 묻어있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 2번 세척하였다. 증류수로 세척 한 후 핀셋과해부셋트를 이용하여 대상곤충의 내장을 꺼내 100 以의 phosphate buffered saline (PBS, 0.8% NaCl? 0.02% KC1, 0.144% Na2HPO4, 0.024% KH2PO4, pH 7.4) 에 넣고 분쇄하였으며, 여기서 얻어진 분쇄물을 IO'까지 희석하여 1% 올리브오일과 0.001% Rhodamin B (Sigma, USA)를 첨가한 고체배지에 도말하여 25℃에서 2-3일간 배양 후 UV에서 관찰을 통해 자라난 콜로니 주변에 오렌지색의 환 (plaque)을 형성하는 균주를 1차적으로 선별하였다.
- 탄소원에 따른 배양시간별 lipase의 생산을 100 mt flask 배양으로 조사하였다. 미생물의 배양은 0.
- 5% (v/v)로 접종하여 25℃, 180 rpm으로 진탕배양 하면서 각 시간별로 시료를 채취하여 lipase 활성을 microplate assay로 검정하였다. 탄소원으로 이용된 olive oil의 첨가량에 따른 lipase의 생산을 조사하기 위하여 0.5%의 yeast extract가 첨가된 M9 minimal media에 olive oil을 0.14.0% 까지 첨가하여 48시간 배양을 실시하였으며 그 과정에서 lipase의 생산량을 측정하였다. 온도에 따른 lipase의 생산조건을 조사하기 위하여 0.
대상 데이터
- Lipase 생산 활성을 가지는 미생물의 탐색에 이용된 곤충은 주로 5월-7월 사이에 대전 인근 야산에서 채집하여 살아있는 상태로 연구실로 운반하여 분류 후 사용하였으며, 울도하늘소(Psacot/iea hilar is) 의 유충과 성충은 농업과학기술원의 설광렬 박사로부터, 줄지렁이(E&沥a fetida)는 대진대학교의 배윤환 박사로부터 분양받아 이용하였다(Table 1). 대상곤충에서 미생물을 분리하기 위한 해부는 Heo등(2006)이 사용한 방법으로 실시하였다.
데이터처리
- 생화학적 조사는 30℃에서 수행하였으며, oxidase 활성, catalase 활성, indol 생성, nitrate 환원과 탈질산화는 Smibert and Krieg (1994)의 방법을 사용하였고, 추가적인 생화학실험은 API 20E (BioMerieux)의상용 되는 kit를 이용하였다. 세포지방산의 성분 분석과 정량은 MIS library generation software (Microbial ID)를이용하여 수행하였으며, 결과는 MIDI Aerobe Library (ver. 3.8)와 비교하였다.
이론/모형
- Lipase의 활성검정은 olive oil이 포함된 agar 배지에서 활성을 검정하는 agar plate method (Kouker and Jaeger, 1987)와 기질과 결합된 p-nitrophenol (pNP) 이 효소에 의해 유리되는 양을 흡광도의 변화로 측정하는 microplate assay 방법(Ryu et al., 2006)으로 측정하였다. Agar plate assay는 고압멸균 한 R2A배지(0.
- HY-10 and closely related Burkholderia species on the basis of 16S rDNA sequences. The tree was generated by neighbor-joining algorithm of PHYLIP. The bar corresponds to 0.
- 1). 대상곤충에서 미생물을 분리하기 위한 해부는 Heo등(2006)이 사용한 방법으로 실시하였다. 대상곤충을 멸균된 Petri-dish에 놓고 70% (w/w) 에탄올에 1-2분 정도 침지하여 충체 표면의 오염원을 제거한 후, 충체에 묻어있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 2번 세척하였다.
- 생리 . 생화학적 조사는 30℃에서 수행하였으며, oxidase 활성, catalase 활성, indol 생성, nitrate 환원과 탈질산화는 Smibert and Krieg (1994)의 방법을 사용하였고, 추가적인 생화학실험은 API 20E (BioMerieux)의상용 되는 kit를 이용하였다. 세포지방산의 성분 분석과 정량은 MIS library generation software (Microbial ID)를이용하여 수행하였으며, 결과는 MIDI Aerobe Library (ver.
성능/효과
- vietanamiensis 등의 균주와도 높은 상동성을 나타내었다 (Table 2). 16S rDNA sequence를 이용한 phylogenetic tree 분석에 의히면 B. pyrrocinia, B. vietanamiensis 등의 균주와 가까운 group을 형성하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2). 1992년부터 기존의 Pseudomonas 속으로부터 새로운 속으로 분류되기 시작한 Burkholderia 속의 세균들 중 B.
- IB). 16S rDNA 염기서열의 결정 및 data base 상동성 검색 결과 Burkholderia stabilis 균주와 99.65%의 가장 높은 상동성을 보여주었으며 B. cepacia. B.
- pNP-butyrate와 pNP- palmitate를 기질로 이용하여 탐색된 lipase의 기질에 대한분해능을 조사하였을 때 분리된 9종의 균주 중 6종의 균주에서 비교적 우수한 pNP-palmitate 분해능을 나타내는 true lipase를 생산하였으며 그 중 톱하늘소로부터 분리된 HY-10 균주가 가장 우수한 lipase 활성을 나타내었다. AT-3과 AA-4 균주의 경우 agar plate assay에서는 우수한 lipase 활성을 나타내었지만 배양상등액에서의 활성은 HY-10에 비해 낮게 나타났다. 각 균주의 protease 생산 활성을 조사하였을 때 AT・3과 AA-4 균주는 48시간 배양 상등액에서 비교적 높은 활성을 나타내어 48시간의 배양과정에서 protease에 의한 lipase의 실활이 일어났을 가능성이 높은 것으로 판단된다(data not shown).
- cepacia. B. pyrrocinia, B. vietanamiensis 등의 균주와도 높은 상동성을 나타내었다 (Table 2). 16S rDNA sequence를 이용한 phylogenetic tree 분석에 의히면 B.
- Burkholderia sp. HY-10에 의한 lipase의 생산조건을 검정하기 위하여 M9 배지에 glucose, citric acid, olive oil을 각각 0.5%가 되도록 탄소원을 첨가한 다음 lipase의 생산을 조사하였을 때 glucose와 citric acid 첨가 시 60시간 배양과정에서 lipase의 생산이 매우 낮은 것을 볼 수 있으며 olive oil 첨가 시 우수한 lipase 생산이 일어남을 볼 수 있었다. 또한 M9 배지 대신 rich media인 LB 배지를 사용하였을 때에도 lipase의 생산이 저해되는 것으로 보아 HY-10 lipase의 생산은 catabolic repression을 받는 것으로 보여진다(Fig.
- , 1992) 생리 . 생화학적 동정을 통해 자세한 동정을 시도하였다그 결과 HY-10 균주는 Biolog를 이용한 carbon source assimilation test에서 Tween 40, Tween 80, N-acetyl-D- glucosamine, adonitol, D-arabitol, D-fructose, L-fiicose, D-galactose? oD-gl니cose, m-inositol, D-mannitol, D-mannose, D-raffinose, D-sorbitol, D-trehalose, xylitol, methyl pyruvate, mono-methyl succinate, acetic acid (weak), cis-aconitic acid, citric acid, formic acid, D- galactonic acid lactone, D-galacturonic acid, D-gluconic acid, D-glucosaminic acid, D-glucuronic acid, a-hydro- xybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid, p-hydroxypheny- lacetic acid, a-ketobutyric acid, ci-keto이utaric acid, DL-lactic acid, malonic acid, propionic acid, D-saccharic acid, sebacic acid, succinic acid, bromosuccinic acid, D-alanine, L-alanine, L-alanyl glycine, L-asparagine, L- aspartic acid, L-glutamic acid, L-histidine, hydroxy-L- proline, L-ornithine (weak), L-phenylalanine, L-proline, L-pyroglutamic acid, L-serine, L-threonine, DL-camitine, y-aminobutyric acid, urocanic acid, thymidine, phenylethylamine, putrescine, 2-aminoethanol, glucose 6-pho- sphate 등에 대해 positive로 나타났으며 API 50C니에 의한 carbone assimilatione D-arabinose, L-arabinose, adonitol, glucose, galactose, mannose, dulcitol, inositol, mannitol, sorbitol, esculine, cellobiose, maltose, lactose, trehalose, xylitol, gentiobiose, D-fucose, L-fucose, D- arabitol, L-arabitol에 대해 positive로 나타났다. 세포 내 구성 지방산 함량은 C18:l straight-chain mon。니nsa- turated fatty acid가 24.
- , 2004). pNP-butyrate와 pNP- palmitate를 기질로 이용하여 탐색된 lipase의 기질에 대한분해능을 조사하였을 때 분리된 9종의 균주 중 6종의 균주에서 비교적 우수한 pNP-palmitate 분해능을 나타내는 true lipase를 생산하였으며 그 중 톱하늘소로부터 분리된 HY-10 균주가 가장 우수한 lipase 활성을 나타내었다. AT-3과 AA-4 균주의 경우 agar plate assay에서는 우수한 lipase 활성을 나타내었지만 배양상등액에서의 활성은 HY-10에 비해 낮게 나타났다.
- AT-3과 AA-4 균주의 경우 agar plate assay에서는 우수한 lipase 활성을 나타내었지만 배양상등액에서의 활성은 HY-10에 비해 낮게 나타났다. 각 균주의 protease 생산 활성을 조사하였을 때 AT・3과 AA-4 균주는 48시간 배양 상등액에서 비교적 높은 활성을 나타내어 48시간의 배양과정에서 protease에 의한 lipase의 실활이 일어났을 가능성이 높은 것으로 판단된다(data not shown).
- 3B). 배양온도에 따른 lipase의 생산의 영향을 조사하기 위하여 25℃, 30℃, 37℃에서 각각 48시간 배양하였을 때 30℃에서 가장 우수한 효소의 생산이 이루어짐을 볼 수 있으며 37℃에서는 lipase의 생산이 상대적으로 감소함을 볼 수 있었다(药g. 3C). HY-10 균주는 배양액 내 균체의 수가 W7/m£ - 10W 이상이 되었을 때 lipase 생산이 유도되는 것을 볼 수 있었다(Fig.
- 분리하였다(Table 1). 분리된 균주의 16S rDNA partial sequencing과 data base 검색 결과 Burkholderia 속, Serratia 속, Pseudomonas 속, Acinetobacter w속 등 주로 G(-)의 균주들이 lipase 생산균주로 밝혀졌으며 균혈증(bacteraemia)에 관련된 균주로 알려진 Cedecea neteri (Farmer et al., 1982)와 높은 상동성을 보/이는 AL-2 균주 외에는 대부분이 extera-cellular protease나 lipase를 생산하는 균주들이 다수 보고 된 속(genus)에 포함되는 것을 볼 수 있다(Gupta et 시., 2004). pNP-butyrate와 pNP- palmitate를 기질로 이용하여 탐색된 lipase의 기질에 대한분해능을 조사하였을 때 분리된 9종의 균주 중 6종의 균주에서 비교적 우수한 pNP-palmitate 분해능을 나타내는 true lipase를 생산하였으며 그 중 톱하늘소로부터 분리된 HY-10 균주가 가장 우수한 lipase 활성을 나타내었다.
- 3A). 첨가하는 olive oil의 양은 검토된 0.1-1.0%의 농도 중 0.5%의 첨가 시 가장 우수한 lipase의 생산을 볼 수 있었다(Fig. 3B). 배양온도에 따른 lipase의 생산의 영향을 조사하기 위하여 25℃, 30℃, 37℃에서 각각 48시간 배양하였을 때 30℃에서 가장 우수한 효소의 생산이 이루어짐을 볼 수 있으며 37℃에서는 lipase의 생산이 상대적으로 감소함을 볼 수 있었다(药g.
후속연구
- , 1986) 난분해성물질을 분해하는 연구에도 이들 Burkholderia 속의 균주들이 이용되고 있다는 점 등을 고려할 때 곤충의 장내에 공생적으로 존재할 것으로 판단되는 Burkholderia sp. HY-10 균주의 병원성 관련 여부와 숙주와의 상호관계에 대한 보다 깊은 연구가 지속적으로 필요할 것으로 사료된다. 현재 진행되고 있는 연구 결과들로 보아 Burkholderia sp.
- 그 외 기타 생리 생화학적 결과를 종합하면 Table 4와 같이 요약您 수 있다. 이상의 결과들로 보아 본 균주는 B. cepacia complex 에 속하는 종으로 보여지나 정확한 동정을 위해서는 DNA-DNA hybridization 등을 통한 추가적인 연구가 필요하다.
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