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문제 정의
- 구강에도 강산을 생성하거나 과산화수소룔 분비는 다양한 유산균들이 상재한다기・23). 구취의 억제는 휘발성 황화합물을 생성하는 혐기성 세균의 증식 을 억제하는 것이 가장 효과적이므로 본 연구에서는 과산화수소룔 분비하는 유산간균 2주룔 분리하여 혐기성 세균의 억제효과를 조사하였다. 본 연구에서처럼 과산화수소를 생성하는 유산간균과 휘발성 황화합물을 생성하는 혐기성 세균이 상호결합되어, 두 종류의 세균이 긴밀하게 접촉하게 되면 유산간균에 의해 생성되는 소량의 과산화수소에 의해서도 혐기성 세균이 억제되기 때문에 구취가 현저히 감소될 것으로 생각되었다.
- 본 연구는 구취의 예방과 치료를 위한 Probiotic bacteria를 개발하여 구강건강 증진에 기여하고자 소아의 타액에서 유산균 2주를 분리하여 그 분리균주가 구취를 유발하는 혐기성 세균에 의한 휘발성 황화합물 생성을 억제하는 것을 확인하고, API 50 CHL medium kit를 이용한 생화학적 검사로 동정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구는 소아의 타액에서 과산화수소를 분비하는 유산균 2주를 분리하여 구취와 치주질환을 유발하는 원인균으로 지목되고 있는 혐기성 세균과의 관계를 파악하며, 분리균주의 생화학적 성질을 탄수화물 발효실험을 통한 동정을 실시하여, 치주질환 및 구취를 예방하기 위한 항균제의 연구개발에 기여하고자 실시하였다.
가설 설정
- 단백질과 탄수화물 같은 영양 물질과 pH의 변화가 혐기성 세균의 구취 발생에 영향을 미칠 수 있으며, 타액의 양이나 치태의 유무, 그리고 치태를 형성하는데 관여하는 Streptococcus mutansS. 영향을 미칠 것이다. 타 액은 아미노산으로 가수분해되기 쉬운 단백질을 많이 함유하고 있어 구취 발생에 중요한 공급원이 되며, 특히 혀는 그 해부학적 특수성으로 인해 설태의 침착을 용이하게 하고 혐기성 세균의 증식처가 된다16~18).
제안 방법
- 분리균주 2주는 MRS 액체배지에 배양한 후 글리세롤의 최종농도가 20%(w/v) 되도록 첨가하여 -80℃에 냉동 보 관하면서 필요에 따라 접종, 배양하여 실험에 사용하였다. 분리균주는 그람염색을 실시하고 카탈라아제 시험 (catalase test)은 MRS 한천배지에 분리균주룔 접종하여 37"C에서 1일 배양 한 후 3% 과산화수소를 가할 때 기포 발생 여부로 판정하였다. 배양온도에 대한 영향을 알기 위하여 MRS 한천배지에 분리균주를 접종하여 15° C와 45℃에서 각각 배양한 후 분리균주의 증식 여부를 관찰하였다.
- 1 M MES. 0.2% FeSCQ를 가한 Fn broth 또는 Pg broth 2 ml룔 가하여 1일간 혐기성 상태에서 배양한 다옴, 배지 내의 FeS 농도를 알기 위하여 분광광도계 700nm에서 배지 흡광도를 측정하였으며 실험을 3번 반복한 후 평균을 산출하였다.
- Fusobacterium nucleatun과 Porphyromonas gingivalis에 의한 휘발성 유황화합물의 생성 정도를 액체배지에서 생성된 FeS 농도를 분광광 도계로 측정하였다. Fusobacterium nucleatum-^ Fn broth에서, Porphyromonas gingivalise- Pg broth에서 1 일간 배양하고 유산균은 MRS 액체 배지에 18시간 배양한 후 원심하여 0.
- 000 주의 유산간균 분리하였다. MRS 액체배지에 분리균주를 접종하여 37℃에서 18시간 배양한 다음, TMB(3, 3', 5. 5'-Tetramethyl Benzidine. 0.25mg/ml)와 peroxidase(0.01 mg/ml)룔 첨가한 MRS 한천배지에 유산균 배양액 3μ1씩 접종하여 호기성 배양기에서 배양시 파란색의 집락 형성 여부로 과산화수소 생성 여부를 검사하였으며. 과산화수소를 분비하는 유산간균 2주를 최종적으로 분리하였다.
- 탄수화물 발효검사 결과, Lactobacillus 1은 galactose, glucose, fructose, mannose, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glucosamine. maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose 를 분해하였고, Lactobacillus 2는 glucose, fructose, mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, maltose, lactose, sucrose, trehalose, xylitol, D-arabitol을 분해하였다<표 5-1. 5-2>
- 광주지역 유치원 아동의 타액을 채취하여 유산간균 분리용 배지인 Rogosa 한천배지(Difco, Detroit. ML USA)에 타액을 100배 희석하여 접종하고 37℃에서 48시간 배양한 후 집락을 취하였다. 이것을 다시 MRS 한천배지(Difco.
- 분리균주는 그람염색을 실시하고 카탈라아제 시험 (catalase test)은 MRS 한천배지에 분리균주룔 접종하여 37"C에서 1일 배양 한 후 3% 과산화수소를 가할 때 기포 발생 여부로 판정하였다. 배양온도에 대한 영향을 알기 위하여 MRS 한천배지에 분리균주를 접종하여 15° C와 45℃에서 각각 배양한 후 분리균주의 증식 여부를 관찰하였다. 유산 발효형태룔 구별하기 위하여 분리균주룔 MRS 액체배지에 24시간 배양한 후 배양액을 혼들지 않은 상태에서 백금이를 화염에 달구어 배양액에 넣었다가 꺼낼 때 기포가 생기면 탄산가스가 녹아 있기 때문에 이종발효로 판정하고 기포가 생기지 않으면 동종발효로 판정하였다.
- 과산화수소를 분비하는 유산간균 2주를 최종적으로 분리하였다. 분리균주 2주는 MRS 액체배지에 배양한 후 글리세롤의 최종농도가 20%(w/v) 되도록 첨가하여 -80℃에 냉동 보 관하면서 필요에 따라 접종, 배양하여 실험에 사용하였다. 분리균주는 그람염색을 실시하고 카탈라아제 시험 (catalase test)은 MRS 한천배지에 분리균주룔 접종하여 37"C에서 1일 배양 한 후 3% 과산화수소를 가할 때 기포 발생 여부로 판정하였다.
- 110 rpm으로 30분간 진탕한 후 3분간 실온에 방치하였다. 상청액 0.5 ml를 취하여 분광 광도계 (spectrophotometer, Hitachi. Tokyo, Japan) 660nm 파장에서 홉광도(optical density) 를 측정하여 분리균주와 혐기성 세균과의 상호 결합 정도를 계산하는데 이용하였다. 각 균주의 자가결합 정도는 30분간 진탕한 후 흡광도 수치를 진탕 전의 흡광도 수치로 나눈 값을 1에서 먼 다음, 100을 곱해 준 값을 퍼센트로 표시 하였다.
- 배양온도에 대한 영향을 알기 위하여 MRS 한천배지에 분리균주를 접종하여 15° C와 45℃에서 각각 배양한 후 분리균주의 증식 여부를 관찰하였다. 유산 발효형태룔 구별하기 위하여 분리균주룔 MRS 액체배지에 24시간 배양한 후 배양액을 혼들지 않은 상태에서 백금이를 화염에 달구어 배양액에 넣었다가 꺼낼 때 기포가 생기면 탄산가스가 녹아 있기 때문에 이종발효로 판정하고 기포가 생기지 않으면 동종발효로 판정하였다.
- 혐기성 세균인 Fiisobacteriiini nucleatum과 Porphyromoitas gingivalis가 분리균주와의 결합 정도를 보기 위하여 Fusobacterium nudeatume Fn broth에서 PorpR/romoms gingivalise Pg broth에서 1 일간 배양하고 유산균은 MRS 액체 배지 에서 18시간 배양한 후 원심하여 (6, 000 rpm. 10 min, 4℃) 0.85% 식 염수에 1회 세척한 후 부유하였다. 시험관에 세균 부유액 1 ml씩을 단독 또는 혼합으로 10초간 혼합하고 37° C.
데이터처리
- 탄수화물이 발효되어 산 이 생성되면 배지에 포함되어 있는 bromocresol purple에 의해 배지가 노란색으로 변하고, esculin이 보라색에서 검은색으로 변하면 양성으로 판정하였다. 검사결과는 동정 프로그램인 APILAB plus로 분석하였다.
성능/효과
- 1. 분리균주 2주는 그람양성 간균으로 과산화수소를 생성하였다.
- 2. Fusobacterium nuclcatun을 30분간 진탕한 후 상청액 흡광도는 1.286 이었으나, Fusobacterium nuclcatun과 분리균주를 혼합으로 30분간 진탕한 후의 상청액 흡광도는 각각 0.628과 0.497로 감소하였으며, 상호 결합 정도는 29.4%와 57.8%이었다.
- 표 1. 2에서 분리균주가 혐기성 세균인 Fusobacterium nucleatunie Porphyromms gin- gionh's에 상호결합하는 정도를 각각 흡광도로 측정한 결과, 분리균주는 이들과 상호결합을 하였으며, 특히 Fusobacterium mdeMi과의 상호 결합 정도가 높게 나타났다. 비록 Porphyromonas s와의 상호결합 정도는 Fusobacterium de자"m과의 상호결합 정도에 비해 낮았으나, 분리균주와 Porphyromonas gin- 의 혼합 배양시 30분간 진탕한 후의 상청 액 흡광도가 각각의 상청액 흡광도의 합보다 감소되어 분리균주와 Porphyromonas gingivalis 와의 상호결합이 일어난 것을 확인할 수 있었다.
- 3. Fusobacteriuni nuclcatun 단독 배양시 침전물에 Cysteine과 FeSQ를 첨가한 배지를 가할 때 배지는 검정색으로 나타났으며 침전물의 배지 흡광도는 1.794이었으나, 분리 균주와 혼합 배양시에는 배지는 검정색으 로 변화되지 않았으며 배지 흡광도가 각각 1.144와 0.915로 감소하였다.
- 4. Porphyromonas gingisdis의 단독 배양시 침전몰에 Cysteine과 FeSo4룔 첨가한 배지를 가할 때 배지는 검정색으로 나타났으며 침전물의 배지 홉광도는 1.932였으나. 분리균 주와 혼합 배양시에는 배지는 검정색으로 변화되지 않았으며 배지 흡광도가 각각 1.
- 5. 분리균주 2주의 탄수화물 발효검사를 API 50 CHL medium kit로 검사한 결과, 분리 균주 1주는 Lactobacillus saliimrius로, 다른 균주는 Lactobacillus derueckii subsp. lac- fis로 동정되었다.
- 본 연구에서 Laobaciallius sa/hwiiis와 Lactobacillus derueckii subsp. :fis가 과산화수소를 분비하여 혐기성 세균에 의한 휘발성 황화합물의 생성을 억제하는 효과가 있음이 확인되었으나. 이 연구의 결과가 사람의 구강에서도 동일하게 임상적으로 검증된다면 분리균주를 치주질환 및 구취의 예방과 치료를 위한 항균제로 개발하여 구강건강의 증진에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 Fusobacterium "“cleMu", 과 Porphyromonas gingimlis는 유황성분이 함유된 배지에서 배양할 때, 황화수소가 만들어져 철 성분과 결합하여 검정색의 침전물 즉 FeS를 생성하므로 분광광도계 700nm 파장에서 배지의 흡광도를 측정하여 그 증식 정도를 간접적으로 파악할 수 있었다. Fusobacterium deefum이나 Porphyromonas ghigiis의 단독 배양시 배지 홉광도에 비하여 분리균주와의 혼합 배양시 배 지 흡광도가 감소되었으며, 배지는 모두 검정색으로 변하지 않았다. 이것은 분리균주가 Fusobacterium nucleatunie- Porphyromonas gin- gs와 상호결합을 한 다음, 분리균주가 생성하는 과산화수소가 이들 세균의 증식을 억제함으로써 휘발성 유황화합물의 생성이 억제되고 FeS, 즉 검정색 침전물 생성이 감소되어 배지의 흡광도가 떨어진 것으로 사료된다.
- 0%이었다. Fusobacterium nucleatuni2\ 단독 부유시에는 상청액 흡광도가 1.626에서 30분간 진탕한 후 1.286으로 감소하여 자가결합 정도가 21.0%이 었으며, Porphyromonas gingiualis 의 단독 부유시 에는 상청액 흡광도가 1.070에서 30분간 진탕한 후 0.995로 감소하여 자가결합 정도가 7.1 %이 었다. Lactobacillus 1과 Fusobacteriuiii nucleatum 과의 혼합 부유시에는 30분간 진탕한 후 상청 액 흡광도가 0.
- 1 %이 었다. Lactobacillus 1과 Fusobacteriuiii nucleatum 과의 혼합 부유시에는 30분간 진탕한 후 상청 액 흡광도가 0.628로 감소하여 상호결합 정도가 29.4%이었으며, Lactobacillus 2와 Fusobacterium nucleatum과의 혼합 부유시에는 30분간 진탕한 후 상청액 흡광도가 0.497로 감소하여 상호결합 정도가 57.8%이었다. Lactobacillus 1과 Porphi/roinonas gOighm's와의 혼합 부유시에는 30분간 진탕한 후 상청액 홉광도는 1.
- 932이었다. Lactobacillus 1과 Fusobacterium nucleatum과의 혼합 배양시 침전 물에 배지를 가하고 1일간 배양한 후의 배지는 검정색으로 변화하지 않았으며 흡광도는 1.144 이었고, Lactobacillus 2와 Fusobacterium nucleatum과의 혼합 배양시 침전물에서도 배지는 검 정색으로 변화하지 않았으며 홉광도는 0.915이 었다. Lactobacillus 1 및 Lactobacillus 2와 Porphyromonas gingivalis와의 혼합 배양시 침전 물에 배지를 가하고 1일간 배양한 후의 배지는 검정색으로 변화하지 않았으며 흡광도는 각각 1.
- Lactobacillus 1의 단독 부유시 660nm에서 상청액 흡광도가 2.358에서 30분간 진탕한 후 0.494로 감소하여 자가결합 정도가 79.1 %이었으며, Lactobacillus 2의 단독 부유시에는 상청액 흡광도가 2.376에서 30분간 진탕한 후 1.070으 로 감소하여 자가결합 정도가 55.0%이었다. Fusobacterium nucleatuni2\ 단독 부유시에는 상청액 흡광도가 1.
- 구취 억제는 구강내 혐기성 세균의 증식을 억제하는 것이 가장 효과적이므로 분리균주가 구취와 치주질환을 유발시키는 원인균으로 지목되고 있는 혐기성 그람음성 세균인 Fusobacteriuni nucleatum과 Porphyromonas gin-givalis에 작용하여 발생기 산소를 방출하는 과산화수소룔 분비함으로써 휘발성 황화합물의 생성에 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 분리균주 2주룔 탄수화물 발효로 검사하는 API 50 CHL medium kit로 동정 시험을 시행한 결과, Lactobaciallius salivarius(7]- 능성 99.9%)와 Lactobacillus derueckii subsp. /ncfis(가능성 68.
- 구취의 억제는 휘발성 황화합물을 생성하는 혐기성 세균의 증식 을 억제하는 것이 가장 효과적이므로 본 연구에서는 과산화수소룔 분비하는 유산간균 2주룔 분리하여 혐기성 세균의 억제효과를 조사하였다. 본 연구에서처럼 과산화수소를 생성하는 유산간균과 휘발성 황화합물을 생성하는 혐기성 세균이 상호결합되어, 두 종류의 세균이 긴밀하게 접촉하게 되면 유산간균에 의해 생성되는 소량의 과산화수소에 의해서도 혐기성 세균이 억제되기 때문에 구취가 현저히 감소될 것으로 생각되었다. 이러한 구강내 항세균 성분을 생성하는 세균의 작용은 구강환경의 균형을 파괴시키지 않으면서 효과를 지속적으로 발휘할 수 있어24-25)구강건강의 유지에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.
- 932였으나. 분리균 주와 혼합 배양시에는 배지는 검정색으로 변화되지 않았으며 배지 흡광도가 각각 1.170과 1.266으로 감소하였다.
- 분리균주들은 그람양성 간균으로 카탈라아제 옴성이었으며, 15℃에서 증식하지 못하였으나 45℃에서는 증식하였다. 분리균주 모두 이종발효하였다.
- 이상의 성적을 API 50 CHL medium kit의 동정 프로그램인 APILAB plus로 판독한 결과, Lactobacillus 1은 Lactobacillus wlivoriiis（가능성 99.9%）, Lactobacillus 2는 Lactobacillus delbriteckii subsp. （가능성 68.
- 탄수화물 발효검사 결과, Lactobacillus 1은 galactose, glucose, fructose, mannose, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glucosamine. maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, raffinose 를 분해하였고, Lactobacillus 2는 glucose, fructose, mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, maltose, lactose, sucrose, trehalose, xylitol, D-arabitol을 분해하였다<표 5-1.
- 9%）, Lactobacillus 2는 Lactobacillus delbriteckii subsp. （가능성 68.4%）, Aerococcus 勿ridnzis（가능성 20.8%）, Leuconostoc lactis（가능성 6.9%）. Lactobacillus salivarius（가능성 29%） 로 판정되었다<표 6〉.
후속연구
- 종래 미생물을 동정하기 위하여 이용하던 배양이나 혈청학적 방법에 비교하여 미생물에 존재하는 고유한 유전자를 이용하여 동정하는 방법은 민감도와 정확성에 있어서 월등하기 때문에 최근에 세균으로부터 추출한 DNA에 rRNA 유전자 probe를 hybridization시킨 후 제한효소로 처리한 결과로 세균을 분류하기 시작하였다26). 그러므로 향후 최종적인 세균의 동정은 유전자 분석에 의해 이루어져야 될 것으로 사료된다.
- :fis가 과산화수소를 분비하여 혐기성 세균에 의한 휘발성 황화합물의 생성을 억제하는 효과가 있음이 확인되었으나. 이 연구의 결과가 사람의 구강에서도 동일하게 임상적으로 검증된다면 분리균주를 치주질환 및 구취의 예방과 치료를 위한 항균제로 개발하여 구강건강의 증진에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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