목련과 수종인 함박꽃나무의 현탁배양세포로부터 생리활성을 갖는 리그난화합물인 (+)-eudesmin을 효율적으로 생산하기 위한 연구로써 플라스크배양 단계에서의 다양한 배양조건들 즉, 배지, 초기 당농도, 교반속도, 초기 접종농도, 그리고 elicitation 효과를 확인하고자 하였다. MS배지를 포함한 4종의 배지에서는 물질의 생산성과 생중량 모두에서 MS배지가 적합한 것으로 나타났다. 130 rpm으로 교반되는 항온배양기에서 $3\%$ sucrose와 0.5 mg/L 2,4-D가 첨가된 MS배지에 0.5 mg (DCW)의 농도로 세포를 접종한 실험구에서 8주 후 플라스크 당 3.71 g (DCW)의 생중량을 얻었으며, 지표물질인 (+)-eudesmin의 함량은 $5\%$ sucrose와 200 mg/L chitosan 처리구에서 $3.2{\mu}g/g$ (DCW)으로 대조구에 비해 1.7배의 증가를 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 생물반응기를 이용한 목련과 수종에서의 유용물질 생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
목련과 수종인 함박꽃나무의 현탁배양세포로부터 생리활성을 갖는 리그난화합물인 (+)-eudesmin을 효율적으로 생산하기 위한 연구로써 플라스크배양 단계에서의 다양한 배양조건들 즉, 배지, 초기 당농도, 교반속도, 초기 접종농도, 그리고 elicitation 효과를 확인하고자 하였다. MS배지를 포함한 4종의 배지에서는 물질의 생산성과 생중량 모두에서 MS배지가 적합한 것으로 나타났다. 130 rpm으로 교반되는 항온배양기에서 $3\%$ sucrose와 0.5 mg/L 2,4-D가 첨가된 MS배지에 0.5 mg (DCW)의 농도로 세포를 접종한 실험구에서 8주 후 플라스크 당 3.71 g (DCW)의 생중량을 얻었으며, 지표물질인 (+)-eudesmin의 함량은 $5\%$ sucrose와 200 mg/L chitosan 처리구에서 $3.2{\mu}g/g$ (DCW)으로 대조구에 비해 1.7배의 증가를 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 생물반응기를 이용한 목련과 수종에서의 유용물질 생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
In order to product the furofuranoid lignans, (+)-eudesmin which is one of the secondary products from Magnolia sieboldii. through cell suspension cultures; various culture media, initial sucrose concentration, elicitations, shaking speeds, and inoculum sizes. Among the culture media tested, MS medi...
In order to product the furofuranoid lignans, (+)-eudesmin which is one of the secondary products from Magnolia sieboldii. through cell suspension cultures; various culture media, initial sucrose concentration, elicitations, shaking speeds, and inoculum sizes. Among the culture media tested, MS medium had a pronounced effect on suspension cell growth and (+)-eudesmin contents. The maximum dry cell weight (DCW) of 3.71 g per flask was obtained at inoculum size of 0.5 g and in MS medium supplemented with $3\%$ sucrose plus 0.5 mg/L 2,4-D after 8 weeks. (+)-Eudesmin biosynthesis was stimulated with high initial sucrose concentration ,and the maximum (+)-eudesmin production of $3.2{\mu}g/g$ DCW was achieved at 200mg/L chitosan and $5\%$ initial medium sucrose. The optimal shaking speeds for dry biomass accumulation and (+)-eudesmin contents was 130 rpm. This work is considered to be helpful for large-scale bioprocessing of Magnolia sieboldii suspension cell cultures in bioreactor.
In order to product the furofuranoid lignans, (+)-eudesmin which is one of the secondary products from Magnolia sieboldii. through cell suspension cultures; various culture media, initial sucrose concentration, elicitations, shaking speeds, and inoculum sizes. Among the culture media tested, MS medium had a pronounced effect on suspension cell growth and (+)-eudesmin contents. The maximum dry cell weight (DCW) of 3.71 g per flask was obtained at inoculum size of 0.5 g and in MS medium supplemented with $3\%$ sucrose plus 0.5 mg/L 2,4-D after 8 weeks. (+)-Eudesmin biosynthesis was stimulated with high initial sucrose concentration ,and the maximum (+)-eudesmin production of $3.2{\mu}g/g$ DCW was achieved at 200mg/L chitosan and $5\%$ initial medium sucrose. The optimal shaking speeds for dry biomass accumulation and (+)-eudesmin contents was 130 rpm. This work is considered to be helpful for large-scale bioprocessing of Magnolia sieboldii suspension cell cultures in bioreactor.
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문제 정의
지금까지 함박꽃나무로부터 분리된 주요 성분으로는 수피로부터 sesquiterpene lactone, costunolide, 15-acetoxycostunolide, 잎에 magnoporphine, 그리고 꽃잎에서 essential oils 등이 있으나(16-19), 배양세포로부터 이와 같은 생리활성물질의 생산성을 검정한 연구 결과는 보고된 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 함박꽃나무로부터 유래한 체세포의 현탁배양을 통하여 생리활성물질인 furofuranoid lignan (+)-eudesmin의 생산을 위해 다양한 배양조건 하에서 실험한 결과를 보고하고자 한다.
목련과 수종인 함박꽃 나무의 현탁배양세포로부터 생리활성을 갖는 리그난 화합물인 (+)-eudesmin을 효율적으로 생산하기 위한 연구로써 플라스크 배양 단계에서의 다양한 배양조건들 즉, 배지, 초기 당 농도, 교반 속도, 초기 접종 농 도, 그리고 elicitation 효과를 확인하고자 하였다. MS배지를 포함한 4종의 배지에서는 물질의 생산성과 생중량 모두에서 MS배지가 적합한 것으로 나타났다.
제안 방법
5 g에 메탄올 70 ml을 가 하여 수욕 상에서 3회 가열하여 추출하였다. 3회 연속 같은 방법으로 얻은 메탄올 추출물을 3, 000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상징액을 Table 1과 같은 조건하에서 HPLC (Shimazu, Tyokyo, JAPAN) 를 이용하여 분석하였다 (25). (+)-Eudesmin의 표준시료는 임업연구원에서 단리 한 것을 분양받아 사용하였다.
1% Phytagel가 첨가된 semi-solid 배지에 치상하였다. 6주 동안 암배양을 통하여 세포군을 형성하는 속도에 따라 M-01, M-17, M-21을 1차로 선발하였으며, 이들 중 M-21 세포주를 고형배지에서 재증식 후 동일조성의 액체배지로 옮겨 현탁배양을 하였다. M-21 세포주는 현탁배양을 통하여 동일한 방법으로 4종의 세포주를 재선발하고 이들 중 성장 속도가 가장 빠른 M-219를 이후 모든 실험에 사용하였다.
7)에 치상한 후 암소에서 4주 간격으로 계대배양(26 ±「C)을 통하여 증식시켰다. 계대배양 된 캘러스는 동일조성의 액체배지에 접종하여 4주간 전 배양 (pre-culture) 을 수행한 후 3주 간격으로 stainless steel filteration chamber (pore size 50, 100 ]irn) 를 이용하여 새로 형성된 동일한 크기의 세포군만을 수집한 후 0.1% Phytagel (Sigma. USA)가 첨가된 semi-solid 배지에 치상하여 세포군 (colony)의 형성 속도에 따라 세포주를 선발 하는 방식으로 이루어졌다.
고형배지에서 증식된 캘러스를 동일조성의 액체배지에 접종하여 4주 간격으로 계대배양 하면서 8주 이상 전 배양 (pre-culture) 을 수행하였다. 이 과정에서 3주 간격으로 stainless steel filteration chamber (pore size 50, 100 11m)를 이용하여 새로 형성된 동일한 크기의 세포군만을 반복적으로 수집하였으며, 이들을 액체배지에 희석한 후 0.
세포의 성장과 물질의 생산성에 적합한 기본 배지를 선정하기 위하여 MS 배지, 무기염의 농도를 절반으로 낮춘 1/2 MS 배지, SH 배지(21), WPM 배지(23), 그리고 Bs배지(24) 를 사용하였으며, 탄소 원인 sucrose의 농도는 1%에서부터 7% 농도까지 기본 배지에 첨가하였다. 배가시간 (doubling time)과 회분배양 (batch culture) 후 물질의 생산성에 미치는 초기 접종 농도의 영향을 조사하기 위해서 균질화된 세포를 약 0.1, 0.5, 3, 그리고 5 g (FCW) 씩 40 ml 배지가 들어있는 100 ml Erlemnyer flask에 접종하였으며, 교반 속도 는 60, 100, 130, 그리고 150 rpm 속도로 각기 조정하여 사용하였다. 또한, 지표물 질의 생합성에 있어서 elicitation 작용 효과를 조사하기 위해 chitosan (Sigma.
세포의 성장과 물질의 생산성에 적합한 기본 배지를 선정하기 위하여 0.5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 MS 배지, 1/2MS배 지, SH 배지, WPM 배지, 그리고 Bs배지에 각각 M-219 세포를 접종하였다. 배양 8주 후 생중량과 건중량을 측정한 결과 MS배지에서 가장 높았으며, (+)-eudesmin의 생합성 또한 MS배지에서 다른 4종의 배지 조건에 비해 가장 좋은 결과를 보여주었다(Fig.
세포의 성장과 물질의 생산성에 적합한 기본 배지를 선정하기 위하여 MS 배지, 무기염의 농도를 절반으로 낮춘 1/2 MS 배지, SH 배지(21), WPM 배지(23), 그리고 Bs배지(24) 를 사용하였으며, 탄소 원인 sucrose의 농도는 1%에서부터 7% 농도까지 기본 배지에 첨가하였다. 배가시간 (doubling time)과 회분배양 (batch culture) 후 물질의 생산성에 미치는 초기 접종 농도의 영향을 조사하기 위해서 균질화된 세포를 약 0.
세포의 성장률은 8주 동안 배양된 현탁 배양세포를 여과지에서 24시간 탈수시킨 뒤 측정한 생중량 (FCW) 과 냉동 건조기 (Eyela, Japan)에서 48시간 건조한 후 측정한 건조중량 (DCW) 으로 나타내었다.
고형배지에서 증식된 캘러스를 동일조성의 액체배지에 접종하여 4주 간격으로 계대배양 하면서 8주 이상 전 배양 (pre-culture) 을 수행하였다. 이 과정에서 3주 간격으로 stainless steel filteration chamber (pore size 50, 100 11m)를 이용하여 새로 형성된 동일한 크기의 세포군만을 반복적으로 수집하였으며, 이들을 액체배지에 희석한 후 0.1% Phytagel가 첨가된 semi-solid 배지에 치상하였다. 6주 동안 암배양을 통하여 세포군을 형성하는 속도에 따라 M-01, M-17, M-21을 1차로 선발하였으며, 이들 중 M-21 세포주를 고형배지에서 재증식 후 동일조성의 액체배지로 옮겨 현탁배양을 하였다.
함박꽃나무의 현탁 배양세포로부터 리그난 성분의 분석은 8주 배양된 세포를 수집한 다음 냉동건조 시켜 막 자사 발에서 마쇄한 다음 분말시료 0.5 g에 메탄올 70 ml을 가 하여 수욕 상에서 3회 가열하여 추출하였다. 3회 연속 같은 방법으로 얻은 메탄올 추출물을 3, 000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상징액을 Table 1과 같은 조건하에서 HPLC (Shimazu, Tyokyo, JAPAN) 를 이용하여 분석하였다 (25).
대상 데이터
3회 연속 같은 방법으로 얻은 메탄올 추출물을 3, 000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상징액을 Table 1과 같은 조건하에서 HPLC (Shimazu, Tyokyo, JAPAN) 를 이용하여 분석하였다 (25). (+)-Eudesmin의 표준시료는 임업연구원에서 단리 한 것을 분양받아 사용하였다.
6주 동안 암배양을 통하여 세포군을 형성하는 속도에 따라 M-01, M-17, M-21을 1차로 선발하였으며, 이들 중 M-21 세포주를 고형배지에서 재증식 후 동일조성의 액체배지로 옮겨 현탁배양을 하였다. M-21 세포주는 현탁배양을 통하여 동일한 방법으로 4종의 세포주를 재선발하고 이들 중 성장 속도가 가장 빠른 M-219를 이후 모든 실험에 사용하였다.
함박꽃나무 (Magnolia sieboldii Koch.)의 캘러스는 충북대 임산자원학부에서 유기한 것을 분양받아 0.5 mg/L 2, 4-D가 포함된 MS 배지(20)(3% sucrose, pH 5.7)에 치상한 후 암소에서 4주 간격으로 계대배양(26 ±「C)을 통하여 증식시켰다. 계대배양 된 캘러스는 동일조성의 액체배지에 접종하여 4주간 전 배양 (pre-culture) 을 수행한 후 3주 간격으로 stainless steel filteration chamber (pore size 50, 100 ]irn) 를 이용하여 새로 형성된 동일한 크기의 세포군만을 수집한 후 0.
이론/모형
5, 3, 그리고 5 g (FCW) 씩 40 ml 배지가 들어있는 100 ml Erlemnyer flask에 접종하였으며, 교반 속도 는 60, 100, 130, 그리고 150 rpm 속도로 각기 조정하여 사용하였다. 또한, 지표물 질의 생합성에 있어서 elicitation 작용 효과를 조사하기 위해 chitosan (Sigma. USA)를 Chang과 Lee(1992)의 방법(24)에 따라 준비한 후 배양 3주 후에 농도별로 처리하였다.
성능/효과
MS배지를 포함한 4종의 배지에서는 물질의 생산성과 생중량 모두에서 MS배지가 적합한 것으로 나타났다. 130 rpm으로 교반되는 항온 배양기에서 3% sucrose와 0.5 m이L 2, 4-D가 첨가된 MS배지에 0.5 mg (DCW)의 농도로 세포를 접종한 실험구에서 8주 후 플라스크당 3.71 g (DCW)의 생중량을 얻었으며, 지표물질인 (+)-eudesmin의 함량은 5% sucrose와 200 mg/L chitosan 처리구에서 3.2 Ug/ g (DCW)으로 대조구에 비해 1.7배의 증가를 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 생물 반응기를 이용한 목련과 수종에서의 유용물질 생산연구에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
5 g (DCW) 이상 농도로 접종하였을 때보다 1주 일 정도 늦어지는 경향을 보여주었으며, 2 g (DCW) 이상 고농도로 접종할 경우에는 4주 후 세포의 성장이 정체되는 양상을 보여주었다(data not shown). 8주 동안 배양한 다음 생산성을 비교해 보았을 때 초기접종 농도를 0.5 g (DCW) 으로 하는 게 가장 적합한 것으로 나타났다(Fig. 5). van Gulik 등(1994)은 Catharanthus rose“s의 현탁배양에서 초기 접종 농도가 낮을 경우 세포의 성장 속도 곡선의 변화가 크게 지연됨을 확인한 바 있고(35), Zhong 등(1995)과 Su와 Lei(1993)도 Perilla frutescense Anchusa officinalis 현 탁 배양에서 적정, 수준의 초기 접종 농도를 확인함으로써 물질의 생산성을 최대로 얻은 바 있다(36, 37).
목련과 수종인 함박꽃 나무의 현탁배양세포로부터 생리활성을 갖는 리그난 화합물인 (+)-eudesmin을 효율적으로 생산하기 위한 연구로써 플라스크 배양 단계에서의 다양한 배양조건들 즉, 배지, 초기 당 농도, 교반 속도, 초기 접종 농 도, 그리고 elicitation 효과를 확인하고자 하였다. MS배지를 포함한 4종의 배지에서는 물질의 생산성과 생중량 모두에서 MS배지가 적합한 것으로 나타났다. 130 rpm으로 교반되는 항온 배양기에서 3% sucrose와 0.
5 mg/L 2, 4-D가 첨가된 MS 배지, 1/2MS배 지, SH 배지, WPM 배지, 그리고 Bs배지에 각각 M-219 세포를 접종하였다. 배양 8주 후 생중량과 건중량을 측정한 결과 MS배지에서 가장 높았으며, (+)-eudesmin의 생합성 또한 MS배지에서 다른 4종의 배지 조건에 비해 가장 좋은 결과를 보여주었다(Fig. 1, 2). 이와 같이 배지의 조성은 많은 식물 종의 세포배양에서 세포의 성장과 물질대사에 영향을 미치는 주요 요인으로 작용하게 된다(26-29).
함박꽃나무의 현탁배양에 있어서는 탄소 원으로 sucrose를 사용 하였으며, MS 배지에 1%에서 7%까지 농도를 달리 처리한 후 8주 동안 배양하였다. 세포의 생중량은 3%에서 3.65 g DCW/flask였으며, 물질의 생산성의 경우 5% 농도에서 1.82 ug/g (DCW) 으로 각각 나타났다(Fig. 3, 4). 현탁세포배 양에서 물질의 생산성을 극대화시키기 위해서 7% 이상 12%까지 고농도로 처리해 주는 경우도 있으나(31-33), 이와 달리 5% 이하의 저농도 처리를 통하여 물질의 생산성에 대한 효과를 기대하는 경우도 있다(34).
특히 scale-up 과정에서는 초기접종 농도는 단 위 시간당 생중량의 변화에 매우 중요한 요인으로 작용하는 경우가 많다. 함박꽃나무의 현탁 배양세포를 100 ml 용량의 플라스크에서 8주간 회분배양을 한 결과 초기 접종 농도를 0.1 g (DCW) 이하로 할 경우에는 성장기의 진입 속도가 0.5 g (DCW) 이상 농도로 접종하였을 때보다 1주 일 정도 늦어지는 경향을 보여주었으며, 2 g (DCW) 이상 고농도로 접종할 경우에는 4주 후 세포의 성장이 정체되는 양상을 보여주었다(data not shown). 8주 동안 배양한 다음 생산성을 비교해 보았을 때 초기접종 농도를 0.
Chitosane P-l, 4-gluco- samine 중합체로 식물세포에 작용하여 대사에 영향을 주는 것으로 보고된 바 있다(42). 함박꽃나무의 현탁배양에서는 배양 3주 후에 각 실험구별로 chitosan을 100, 200, 그리고 300 mg/L의 농도로 배양액에 첨가하였을 때 세포의 성장에는 유의적인 영향을 확인할 수 없었으나, (+)-eudesmin의 생합성에는 영향을 준 것으로 보였다. Chitosan을 처리하지 않은 대조 구에 비해 200 mg/L 처리 구에서 1.
(38). 함박꽃나무의 현탁배양에서는 세포의 성장과 물질의 생산성을 위해서 교반 속도를 130 rpm으로 유지시켜주는 게 바람직할 것으로 보였다(Fig. 6, 7). 본 실험에서처럼 현 탁 배양에서 세포의 성장과 물질의 생합성 모두에 동일한 수준의 교반 속도가 필요한 경우도 있으나, Wu 등(2003)이 Rhodiola sachalinensisS] 세포를 가지고 수행한 실험에서 나타난 것처럼 세포증식과 물질의 생산성을 위한 교반 속 도가 다르게 요구되는 경우도 있다(39).
후속연구
7배의 증가를 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 생물 반응기를 이용한 목련과 수종에서의 유용물질 생산연구에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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