[논문]자주쓴풀 메탄올추출물의 IgE-매개 알레르기 반응 억제 및 기전

전선하; 김영미

doi:10.22889/kjp.2020.51.4.317

자주쓴풀 메탄올추출물의 IgE-매개 알레르기 반응 억제 및 기전
Swertia pseudochinensis Methanol Extract Inhibits IgE-mediated Allergic Response In vitro and In vivo 원문보기

생약학회지, v.51 no.4, 2020년, pp.317 - 324

전선하 (덕성여자대학교 약학대학) , 김영미 (덕성여자대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Mast cells play a key role in IgE-mediated allergic response. We investigated whether Swertia pseudochinensis Hara extract (SPE) inhibits IgE-mediated allergic response in mast cells and an allergic animal model. Additionally, we explored SPE's mechanism of action in mast cells. Our results showed that SPE inhibited both antigen-stimulated degranulation and the production of TNF-α and IL-4 in bone marrow-derived mast cells (BMMCs) and rat basophilic leukemia (RBL)-2H3 cells. SPE also suppressed allergic response in IgE-mediated passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in mice. As for the mechanism of action of SPE in mast cells, it inhibited the activation of Syk kinase, a critical signaling protein in the FcεRI-mediated signaling pathway, and also the activation of LAT, a downstream adaptor protein of Syk. We further observed the reduced activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases (P38, ERK1/2, and JNK) and Akt in mast cells. Our results described for the first time that SPE has an anti-allergic effect by suppressing mast cells through the inhibition of Syk kinase. Therefore, SPE may be useful for the treatment of type I allergic diseases.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Swertia pseudochinensis extract (SPE) shows a reversible inhibitory effect on degranulation in antigen (Ag)-stimulated mast cells. RBL-2H3 cells (A) or BMMCs (B) were primed by 25 ng/ml DNP-specific IgE, then stimulated with 25 ng/ml Ag for 15 min. The degranulation was determined by measuring the activity of β-hexosaminidase as described in the section for "Materials and Methods". (C) Reversibility of the effect of SPE on mast cells. After treating RBL-2H3 cells with SPE for 1 hr, the cells were washed five consecutive times using PIPES buffer and then degranulation was measured as described in the section for "Materials and Methods". The values represent the mean ± S.E.M. from three independent experiments. *p<0.05 and **p<0.01. PP2 is a typical Srcfamily kinase inhibitor.
그림 Fig. 2. SPE suppresses the expression of inflammatory cytokines, TNF-α and IL-4, in antigen (Ag)-stimulated RBL-2H3 cells. (A) IgE-primed RBL-2H3 cells were stimulated by 25 ng/ml antigen with or without SPE. Total RNA was extracted and analyzed by RT-PCR as described in the section for "Materials and Methods". (B) The band density was measured using Multi gauge V3.1 software (FUJIFILM, Inc., Japan). The values are shown as the mean ± S.E.M. from three independent experiments. *p<0.05 and **p<0.01. PP2 is a typical Src-family kinase inhibitor.
그림 Fig. 3. SPE impedes the activation of Syk and its downstream signaling molecules in mast cells. The IgE-primed RBL-2H3 cells (upper part) or BMMCs (lower part) were treated with 25 ng/ml antigen (Ag), with or without SPE for 7 min. Immunoblot analysis was preformed using the whole cell lysates and specific antibodies for each signaling protein. Phosphorylated forms of Syk, LAT, PLCγ, Akt, and MAPK (ERK, p38, JNK) were measured in RBL-2H3 cells or BMMCs as described in the section for "Materials and Methods". Represented images are shown from three independent experiments. PP2 is a typical Src-family kinase inhibitor.
그림 Fig. 4. SPE inhibits passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in mice. DNP-specific IgE (0.5 μg) was intradermally injected into Balb/c mouse ear. After 24 h, 250 μg antigen (Ag) mixed with 4% Evans blue was intravenously injected. To measure the inhibitory effect of SPE on PCA, the mouse was orally administered with SPE (100-1000 mg/kg) 1 h prior to an antigen (Ag) injection. The amount of exuded Evans blue was quantitated as described in the section for "Materials and Methods". (A) The representative images are shown. (B) Values indicate the mean ± S.E.M. from three independent experiments, each with 5 mice. *p<0.05 and **p<0.01. Cetirizine (CZ, 10 mg/kg) was used as a typical anti-histamine reference drug.
그림 Fig. 5. SPE suppresses antigen-stimulated degranulation of mast cells in ear. After the PCA experiment in mice, the ear was removed. Histology for ear tissues was performed as described in the section for "Materials and Methods". (A) Representative images are shown. (B) The ratio of degranulated mast cells (black bar) to the total number of mast cells (whole bar) in ears are expressed as the mean ± S.E.M. from three independent experiments. *p<0.01. Cetirizine (CZ, 10 mg/kg) was used as a typical anti-histamine reference drug.
그림 Fig. 6. Schematic illustration of how SPE inhibits mast cell activation. In antigen-stimulated mast cells, SPE inhibits the activation of Syk and Syk-dependent signaling proteins, which leads to the inhibition of degranulation and cytokine secretion.

AI 본문요약
AI-Helper

제안 방법

Balb/c 마우스의 귀에 IgE를 국소적으로 피내 주사하여 비만세포를 감작시킨 후 Evans blue 색소와 항원을 동시에 꼬리 정맥 주사하여 알레르기 질환 동물 모델을 만들었다. IgE로 감작 후 항원을 투여하기 1시간 전에 SPE와 표준 약물(cetirizine)을 경구투여 한 후 알레르기 증상 억제 정도를 관찰하였다. 귀 조직을 분리하여 Evan blue를 추출 후 620nm 파장에서 정량한 결과 SPE의 농도가 증가함에 따라 귀 조직으로의 Evans blue의 삼출이 억제되었다(Fig.
본 연구에서 우리는 SPE의 비만 세포 활성화에 대한 억제 및 기전을 세포 수준에서 연구하였고, 추가적으로 알레르기 동물모델에서 SPE의 알레르기 반응 억제 효과를 관찰하였다. SPE는 항원 자극에 의해 활성화된 비만세포를 가역적으로 억제하였으며 SPE는 동물모델에서 농도의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다.
비만세포에서의 SPE의 효과에 근거하여 우리는 동물모델 에서의 알레르기 반응 효과를 실험하고자 IgE 매개성 즉시성 알레르기 동물모델인 PCA 알레르기 동물모델을 제작하여 사용하였다. 이 모델은 가장 일반적으로 사용되는 제1형 알레르기 동물모델로 잘 알려져 있다.
Passive Cutaneous Anaphylaxis(PCA)는 IgE 및 비만 세포 매개 알레르기 반응을 관찰할 수 있는 전형적인 동물모델이다. 우리는 Balb/c 마우스를 이용하여 SPE의 피부병리학적 분석 및 알레르기 억제효과를 알아보고자 하였다. Balb/c 마우스의 귀에 IgE를 국소적으로 피내 주사하여 비만세포를 감작시킨 후 Evans blue 색소와 항원을 동시에 꼬리 정맥 주사하여 알레르기 질환 동물 모델을 만들었다.
우리는 수동피부감작 알레르기(PCA) 동물 모델을 만들기 위해 Balb/c 마우스의 한쪽 귀에 IgE 0.5μg을 피내주사하고 12시간 동안 방치하여 비만세포가 IgE에 충분히 감작되도록 하였다

대상 데이터

Minimal Essential Medium(MEM)및 RPMI-1640 배양액은 GIBCO(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. PP2(4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo [3, 4-d] pyrimidine)는 Calbiochem(La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. Phospho(pY)-Syk, Phospho(pY)-LAT, LAT 및 Phospho-tyrosine(pY) 검출을 위한 각각의 항체들은 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
사료와 물은 자유롭게 먹도록 제공하였다. 동물실험은 군당 최소 5마리의 마우스를 사용하였다. 동물실험은 공동연구 기관인 건국대학교 동물실험센터에서 동물실험윤리 규정에 따라 승인 후 수행하였다(승인번호 KU20129).
마우스는 대한바이오링크에서 생후 4주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하였으며 동물실에서 최소 1주일의 적응기간을 가진 후 실험에 사용하였다. 동물실의 온도는 22±1o C, 습도는 55±10%로 유지하였고 낮과 밤의 주기는 12 시간으로 하였다.
우리는 20종 이상의 자생식물의 메탄올 추출물들을 한국식물추출물은행(충정북도 청주시)에서 구입하여 알레르기 반응 억제효과를 1 차로 측정하고 가장 효과가 뛰어난 자주쓴풀 메탄올추출물(SPE)을 선정하여 추가적인 실험을 진행하였다. 본 연구에 사용된 시료는 자주쓴풀(Swertia pseudochinensis Hara, Gentianaceae)을 채취하여 건조한 전초를 이용해 메탄올 추출물을 제조되었으며 그 표본 시료는 한국식물추출물은행에 보관되어 있다(Code no.

성능/효과

본 연구에서 우리는 SPE의 비만 세포 활성화에 대한 억제 및 기전을 세포 수준에서 연구하였고, 추가적으로 알레르기 동물모델에서 SPE의 알레르기 반응 억제 효과를 관찰하였다. SPE는 항원 자극에 의해 활성화된 비만세포를 가역적으로 억제하였으며 SPE는 동물모델에서 농도의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다. 우리는 SPE의 알레르기 억제 기전으로 비만세포에서 항원 자극에 의한 Syk kinase 활성화 및 Syk 의존성 하위신호전달 단백질을 억제하는 것을 규명하였다.
우리는 알레르기 유발 단계에서 중요한 역할을 담당하는 비만세포의 항원 자극에 의한 탈과립은 β-hexosaminidase를 측정 지표로 사용하여 실험하였다. 그 결과 SPE는 비만세포인 RBL-2H3세포와 BMMC에서 농도 의존적으로 탈과립을 억제하는 것을 관찰하였다. 항원만 처리한 RBL-2H3 세포에서는 약 35% 정도 탈과립이 일어난 반면, SPE를 처리한 세포에서는 농도의존적으로 탈과립이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig.
SPE는 항원 자극에 의해 활성화된 비만세포를 가역적으로 억제하였으며 SPE는 동물모델에서 농도의존적으로 알레르기 반응을 억제하였다. 우리는 SPE의 알레르기 억제 기전으로 비만세포에서 항원 자극에 의한 Syk kinase 활성화 및 Syk 의존성 하위신호전달 단백질을 억제하는 것을 규명하였다. 결과를 종합할 때 우리는 이 보고에서 SPE의 IgE 매개성 알레르기 질환의 치료제나 기능성 식품으로 개발 가능성을 제시하고자 한다.
이 모델은 가장 일반적으로 사용되는 제1형 알레르기 동물모델로 잘 알려져 있다. 우리의 예상대로 SPE는 동물모델에서도 농도의존적으로 알레르기 반응을 효과적으로 억제하였다(Fig. 4).
1C). 이 결과를 통해 우리는 SPE의 비만세포에 대한 탈과립 억제효과는 가역적임을 알 수 있었다.
5). 이러한 결과는 SPE가 in vitro 뿐 아니라 in vivo에서도 비만세포의 탈과립을 억제한다는 것을 의미하였다. 흥미롭게도 SPE의 저농도 처리군(100mg/kg)에서 유의성 있는 알레르기 억제 효과를 확인하였으며 이는 앞으로 의약품이나 건강 기능성 식품으로의 개발 가능성이 높은 것을 시사하였다.
이는 비만세포가 활성화될 때 방출되는 histamine과 serotonin등이 인근 혈관 투과성을 증가시켜 Evans blue가 혈관으로부터 귀 조직으로 삼출되며 SPE 투여 따라 Evans blue 삼출의 감소는 SPE가 귀에 분포하는 비만세포의 탈과립을 억제하였음을 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로 우리는 SPE가 in vivo에서도 IgE 매개 알레르기 반응의 억제 효과가 있음을 관찰할 수 있었다.
이러한 결과는 SPE가 in vitro 뿐 아니라 in vivo에서도 비만세포의 탈과립을 억제한다는 것을 의미하였다. 흥미롭게도 SPE의 저농도 처리군(100mg/kg)에서 유의성 있는 알레르기 억제 효과를 확인하였으며 이는 앞으로 의약품이나 건강 기능성 식품으로의 개발 가능성이 높은 것을 시사하였다.

후속연구

우리는 SPE의 알레르기 억제 기전으로 비만세포에서 항원 자극에 의한 Syk kinase 활성화 및 Syk 의존성 하위신호전달 단백질을 억제하는 것을 규명하였다. 결과를 종합할 때 우리는 이 보고에서 SPE의 IgE 매개성 알레르기 질환의 치료제나 기능성 식품으로 개발 가능성을 제시하고자 한다.

참고문헌 (24)

Yoo, B., Park, Y., Park, K. and Kim, H. (2015) A 9-year trend in the prevalence of allergic disease based on national health insurance data. J. Prev. Med. Public Health 48: 301-309.

원문보기 상세보기
Jung, Y. J. and Yang, W. M. (2019) Analysis of Korean medical status of acute bronchitis, chronic bronchitis and allergic rhinitis patients. J. Kor. Med. 40: 87-98.

원문보기 상세보기
Kim, H. (2017) The roles of mast cells in allergic inflammation and mast cell-related disorders. Allergy Asthma Respir. Dis. 5: 248.

상세보기
Galli, S. J. and Tsai, M. (2012) IgE and mast cells in allergic disease. Nat. Med. 18: 693-704.

상세보기
Helm, B., Marsh, P., Vercelli, D., Padlan, E., Gould, H. and Geha, R. (1988) The mast cell binding site on human immunoglobulin E. Nature 331: 180-183.

상세보기
Tkaczyk, C., Iwaki, S., Metcalfe, D. D. and Gilfillan, A. M. (2005) Roles of adaptor molecules in mast cell activation. Mast Cells in Allergic Diseases Chemical Immunology and Allergy, S. Karger publisher: 43-58. doi:10.1159/000087570
Bradding, P. and Arthur, G. (2016) Mast cells in asthma - state of the art. Clin. Exp. Allergy 46: 194-263.

상세보기
Beaven, M. A. (2009) Our perception of the mast cell from Paul Ehrlich to now. Eur. J. Immunol. 39: 11-25.

상세보기
Yang, S., Sharrocks, A. D. and Whitmarsh, A. J. (2003) Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades. Gene 320: 3-21.

상세보기
생약학교재편찬위원회 (2001) 생약학, 177-178. 동명사, 경기도.
Yang, Q., Shu, F., Gong, J., Ding, P., Cheng, R., Li, J., Tong, R., Ding, L., Sun, H., Huang, W., Wang, Z. and Yang, L. (2020) Sweroside ameliorates NAFLD in high-fat diet induced obese mice through the regulation of lipid metabolism and inflammatory response. J. ethnopharmacol. 255: 112556.

상세보기
Hoyte, F. and Nelson, H. S. (2018) Recent advances in allergic rhinitis. F1000Res. 7: F1000 Faculty Rev-1333.
Eiseman and Bolen, J. B. (1992) Engagement of the high-affinity IgE receptor activates src protein-related tyrosine kinases. Nature 355: 78-80.

상세보기
Reber, L. L. and Frossard, N. (2014) Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142: 416-435.

상세보기
Rivera, J. and Gilfillan, A. M. (2006) Molecular regulation of mast cell activation. J. Allergy Clin. Immunol. 117: 1214-1223.

상세보기
Theoharides, T. C. and Kalogeromitros, D. (2006) The critical role of mast cells in allergy and inflammation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1088: 78-99.

상세보기
Azzolina, A., Guarneri, P. and Lampiasi, N. (2002) Involvement of p38 and JNK MAPKs pathways in Substance Pinduced production of TNF-alpha by peritoneal mast cells. Cytokine 18: 72-80.

상세보기
Yamahara, J., Kobayashi, M., Matsuda, H. and Aoki, S. (1991) Anticholinergic action of Swertia japonica and an active constituent. J. Ethnopharmacol. 33: 31-35.

상세보기
Sheng, N., Zhi, X., Yuan, L., Zhang, Z., Jia, P., Zhang, X., Zhang, L. and Wang, X. (2014) Pharmacokinetic and excretion study of three secoiridoid glycosidesand three flavonoid glycosides in rat by LC-MS/MS after oraladministration of the Swertia pseudochinensis extract. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 967: 75-83.

상세보기
Kumarasamy, Y., Nahar, L., Cox, P., Jaspars, M. and Sarker, S. (2003) Bioactivity of secoiridoid glycosides from Centaurium Erythraea. Phytomed. 10: 344-347.

상세보기
Li, Y. L. and Bi, K.S. (2003) RP-HPLC determination and pharmacokinetic study of magniferin in rat plasma after taking traditional Chinese medicinal-preparation: Zhimu decoction. Chromatographia 57: 767-770.

상세보기
Li, Y. L., Sui, Y. J. and Dai, Y. H. (2008) LC determination and pharmacokinetic study of mangiferin in rat plasma and tissues. Chromatographia 67: 957-960.

상세보기
Lin, C. M., Huang, S. T., Liang, Y. C., Lin, M. S., Shih C. M., Chang, Y. C., Chen, T. Y. and Chen, C. T. Isovitexin suppresses lipopolysaccharide-mediated inducible nitric oxide synthase through inhibition of NF-kappa B in mouse macrophages. Planta Med. 71: 748-753.

상세보기
Tanaka T. (2014) Flavonoids for allergic diseases: present evidence and future perspective. Curr. Pharm. Des. 20: 879-885.

상세보기

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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