[논문]HIV-l 유래 렌티바이러스 벡터의 복제가능 바이러스 검출과 역가측정 분석방법 비교

장석기; 오일웅; 정자영; 안광수; 손여원

문제 정의

먼저 벡터를 처리한 후 3주간에 걸쳐 amplification 기간을 설정함으로써 RCL 이 생성될 수 있는 충분한 배양기간을 확보하였고 마지막 배양 일(21일)에서 얻은 배양 상등액을 2차 transduction에 사용하였 다. 2차 transduction 후에는 추가적으로 6일간의 indication 기 간을 설정하였으며 특정 바이러스 유전자의 이동에 의한 RCL 형성 가능성에 대해 확인 하고자 하였다.¹⁷⁾
현재 RCL의 생성을 검토하기 위한 다양한 방법들이 사용되고 있는데 대표적인 방법으로 p24 detection assay, PCR assay, syncitia formation assay 그리고 marker rescue assay 등■이 시" 용되고 있다.8)본 연구에서는 그 중 가장 용⑴하게 접근할 수 있 는 방법인 p24 ELISA와 PCR 분석법을 선택하여 RCL 검출방 법을 확립하고자 하였다. p24 ELISA는 배양상등액을 재료로 하 여 HIV-1 gag 유전자의 전달과 발현을 모니터 하는 방법이며9) PCR의 경우는 transduction된 세포의 genomic DNA를 이용하여 바이러스 서열의 특정부분에 대한 primerf- 제작하고 이 서열들 의 이동을 검토함으로써 RCL曰 유무를 판정하는 방법이다.
RCL에 관한 안전성 평가에 있어서 본 연구에서는 PCR과 P24 ELISA를 함께 사용하여 이를 확립하고자 하였다. Wild type 바 이러스와 달리 RCL은 그 특성상 아주 느린 속도로 증폭된다고 가정할 수 있다.
본 실험에 덧붙여 3주간의 amplification 기간 동안 진행되는 계대배양의 빈도가 RCL 검출시험의 결과에 어떠한 영향을 미치 는지 알아보고자 하였다. 각각 3회와 5회로 나누어 계대기간을 설정하고 amplification 배양을 진행하였다.
1°)한 편, 벡터의 기능적 역가를 측정하는 방법에 있어서도 DNA titer 나 RNA titer와 같이 real-time PCR을 이용하는 방법과 flow cytometer나 적절한 염색 등을 통하여 특정 표식 유전자의 발현 을 분석함으로써 기능적 역가를 결정하는 방법들이 사용되고 있 다. 본 실험에서는 Green Fluorescent Protein(GFP)의 발현정 도를 flow cytometer로 분석 함으로써 벡터의 GFP titer를 결 정하고자 하였고, 또한 real-time PCR을 이용하여 DNA titer를 측정함으로써 두 역가측정법을 상호 비교하여⑵ 유전자치료용 렌티바이러스 벡터의 효율적인 역가측정법을 조사하고자 하였다.
본 실험에서는 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 전달과 RCL 의 존재여부를 확인하기 위하여 일반 PCR과 real-time PCR을 사 용하였으며 이를 비교하고자 하였다. 두 PCR 간의 민감도 차이를 알아보고자 transfer 벡터 DNA와 envelope 플라스미드 DNA의 copy 수에 따른 PCR을 수행하였다.
2). 위의 primer* 이용하여 PCR을 수행하였을 때 PCR의 검출 민 감도가 어느 정도 인지를 알아보고자 하였다. 먼저 각각의 버旧 를 10배씩 단계별 희석하여 준비하였으며 1XPCR buffer, 2.
이러한 결과로 볼 때 copy수에 따른 두 PCR 간의 민감도는 큰 차 이를 나타내지 않았으며 따라서 본 실험에서는 RCL 검출을 위하 여 두 PCR을 모두 사용하여 진행하였다. 이러한 검출 민감도를 토대로 amplification3]- indicator 기간에서 얻은 genomic DNA에 대한 PCR 분석을 통하여 RCL의 존재여부를 확인하고자 하였다.
추가적으로 벡터 상등액 내의 p24 단백질의 양을 측정하여 벡 터의 물리적 역가를 측정할 수 있다. 이를 기능적 역가인 GFP titei; DNA titer와 비교하여 둘 사이의 관계를 알아보고자 하였 다. 먼저 벡터 상등액에 대한 p24 ELISA를 실시하고 벡터 상등 액 내의 p24 양을 측정한 결과 262.

가설 설정

RCL에 관한 안전성 평가에 있어서 본 연구에서는 PCR과 P24 ELISA를 함께 사용하여 이를 확립하고자 하였다. Wild type 바 이러스와 달리 RCL은 그 특성상 아주 느린 속도로 증폭된다고 가정할 수 있다. 따라서 RCL이 증폭될 수 있는 충분한 배양 기간이 요구되는데 본 연구에서는 3주간의 amplification 기간을 두고 실험을 진행하였다.

제안 방법

본 실험에서 진행한 3주간의 amplification 기간으로 위의 문제점을 해결하기에 충분한 계대배 양과 세척 과정을 이행하였다. Amplification 기간 동안 얻은 7, 14, 21일 차의 배양 상등액과 indication 기간에서 얻은 6일차의 배양 상등액을 이용하여 ELISA를 실시하였다. p24 ELISA 분석에서는 샘플의 p24 농도가 cutoff value(CV) 이하 일 때 RCL이 없다고 판정하며 본 실험에서 설정한 CV값은 5.
p24 존재여부의 확인은 HIV-1 p24 antigen ELISA kit를 사 용하여 제조사의 지시에 따라 실험을 수행하였다. Amplification 기간과 indicator 기간에서 확보한 각각의 배양 상등액을 재료 로 하여 p24 항원을 검출함으로써 RCL 존재의 여부를 확인하 였다.
DNA titer 결정 - 다음으로 DNA titer를 결정하기 위해서 transfer 벡터의 PBS/psi 부분에 대한 primer와 probe를 제작하 였다. FPLV(5'-CGCGCACGGCAAGAG-3'), RPW-GCCTC- CGCTAGTCAAAATTTTTGG-3'), WAM-CCAGTCGCCGC- CCCT) (Applied Biosystems, U.
2일이 경과한 후, 각 well의 세포를 trypsin 처 리하여 400 g에서 5분간 원심분리하고 세포를 얻었다. FACS buffer 0.5 mZ을 이용하여 단일세포로 부유 시킨 후, Flow cytometer를 이용하여 각각의 샘플마다 5, 000 live events로 GFP positive 세포의 %를 측정하였다.
). GFP titer와 같은 방 법으로 HeLa 세포에 transduction과 배양을 실시한 후, DNeasy tissue kit를 이용하여 세포의 genomic DNA를 얻었 다. 역가결정에 필요한 standard 곡선은 transfer 벡터를 10배 씩 단계별 희석하여 준비하고 primer, probe와 함께 50°C에서 2분 1 cycle, 95%:에서 10분 1 cycle, 95%3에서 15초, 60。(3에 서 1분의 조건으로 40 cycle 동안 real-time PCR을 수행하여 결정하였다.
G) 등을 Lipofectamine2000을 사용하여 trans- fection시켰다. Ihansfection을 실시한 후, &시간 후에 새로운 배 지로 교체하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양을 실시하였다. 배양 후 벡터가 포함되어 있는 배양 상등액을 확보 하고 0.
실험에 필요한 primer와 probe를 제작하기 위해서 렌티바이 러스 벡터에 필수적인 부분인 PBS/psi 에 대한 primer와 probe 를 제작하였다. Transfer 벡터를 10배씩 단계별 희석(1乂1()6~1) 하여 standard 곡선을 그리고 이를 이용하여 transduction된 HeLa 세포의 genomic DNA에 대한 역가를 결정하였다(Fig. 5). 그 결과 DNA titer는 8.
p24 존재여부의 확인은 HIV-1 p24 antigen ELISA kit를 사 용하여 제조사의 지시에 따라 실험을 수행하였다. Amplification 기간과 indicator 기간에서 확보한 각각의 배양 상등액을 재료 로 하여 p24 항원을 검출함으로써 RCL 존재의 여부를 확인하 였다.
본 실험에 덧붙여 3주간의 amplification 기간 동안 진행되는 계대배양의 빈도가 RCL 검출시험의 결과에 어떠한 영향을 미치 는지 알아보고자 하였다. 각각 3회와 5회로 나누어 계대기간을 설정하고 amplification 배양을 진행하였다. 그 결과 PCR과 p24 ELISA 모두에서 S회와 5회 사이에 뚜렷한 차이를 확인할 수 없 었으며 따라서 amplification 기간동안의 계대배양의 빈도는 실 험결과에 별다른 영향을.
AZT를 처리한 well에는 희석하지 않 은 벡터 상등액 1 m/을 넣어주었다. 다捨날, 기존 배지를 새로운 배지로 교체해주고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 추가적으로 2일 동안 배양하였다. 2일이 경과한 후, 각 well의 세포를 trypsin 처 리하여 400 g에서 5분간 원심분리하고 세포를 얻었다.
5~0.0025가 되게 하여 8 卩g/m/의 polybrene과 함께 넣어주었 다. 다음날, 기존 배지를 새로운 배지로 교체해주고 37°C, 5%의 CO₂ 배양기에서 추가적으로 21일 동안 배양하였다(amplihcation stage). 배양기간 동안 7, 14, 21일차 에서의 PCR 분석과 p24 ELISA 분석을 위하여 각각 HeLa 세포의 genomic DNA와 배양 상등액을 확보하였다.
렌티바이러스 벡터는 transient tnansfectioii법으로 생산하였다. 실험 하루 전, 10-cm dish에 2X1()6개의 293T 세포를 준비하였 다. 다음날, 벡터생산에 필요한 4가지 플라스미드인 transfer 벡 터 (pRWLSIN・cPPT.PGK/GFPWPRE), packaging 플라스미드 (pMDLg.pRRE), rev 발현 플라스미드(pRSVRev), envelope 플 라스미드(pMD.G) 등을 Lipofectamine2000을 사용하여 trans- fection시켰다. Ihansfection을 실시한 후, &시간 후에 새로운 배 지로 교체하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 동안 배양을 실시하였다.
다음으로 real-time PCR을 이용하여 DNA titer를 결정 하였 다. 실험에 필요한 primer와 probe를 제작하기 위해서 렌티바이 러스 벡터에 필수적인 부분인 PBS/psi 에 대한 primer와 probe 를 제작하였다.
본 실험에서는 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 전달과 RCL 의 존재여부를 확인하기 위하여 일반 PCR과 real-time PCR을 사 용하였으며 이를 비교하고자 하였다. 두 PCR 간의 민감도 차이를 알아보고자 transfer 벡터 DNA와 envelope 플라스미드 DNA의 copy 수에 따른 PCR을 수행하였다. Transfer 벡터 DNA&X 105~1 copy)와 envelope 플라스미드 DNA(1.
Wild type 바 이러스와 달리 RCL은 그 특성상 아주 느린 속도로 증폭된다고 가정할 수 있다. 따라서 RCL이 증폭될 수 있는 충분한 배양 기간이 요구되는데 본 연구에서는 3주간의 amplification 기간을 두고 실험을 진행하였다. Ttu&RCL은 amplification 기간에서 indicator 기간으로 특정 바이러스 유전자가 이동된 것이라 정의 할 수 있다.
배양기간 동안 7, 14, 21일차 에서의 PCR 분석과 p24 ELISA 분석을 위하여 각각 HeLa 세포의 genomic DNA와 배양 상등액을 확보하였다. 또한 true RCL2] 확인을 위하여 21일차 에서 얻은 배양상등액으로 HeLa 세포에 2차 transduction을 실 시하였으며 추가적으로 6일 동안 배양하였다(indicator stage). 마지막 날에 역시 genomic DNA와 배양 상등액을 확보하였다 (Fig.
렌티바이러스 벡터의 역가를 결정하기 위하여 GFP 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(Fig. 2A)를 flow cytometer를 이용 하여 GFP titerS 측정하였다(Fig. 3). 벡터의 양을 10배씩 단계 별 희석(1(尸, IO% 10召)하여 HeLa 세포에 transduction한 후 flow cytometer로 즉정 한 결과, 1(尸에서는 65.
본 실험에서 실시한 PCR은 두개의 영역을 검출하기 위해서 제작되었다. 먼저 transfer 벡터의 PBS/psi 부분을 검출 하기 위해 Fiy(5'-ACCTGAAAGCGAAAGGGAAAC-3') 와 RLV(5'- CACCCATCTCTCTCCTTCTA.GCC-3'X 제작하였고 다음으로 envelope 플라스미드 DNA의 VSV-G 부분을 검출하기 위해 서 FVSV(5, -CGAGATGGCTGATAAGGATCTC-3)와 RVSV(5'- ATTGATTATGGTGAAAGCAGGAC-3')< 제작하였다(Fig. 2). 위의 primer* 이용하여 PCR을 수행하였을 때 PCR의 검출 민 감도가 어느 정도 인지를 알아보고자 하였다.
본 실험에서 사용한 렌티바이러스 벡터 안전성 시험의 전체적인 방향은 레트로바이러스 벡터에 대한 FDA의 가이드라인을16) 모델로 하여 세포배양 방법 및 기간을 설정하였다. 먼저 벡터를 처리한 후 3주간에 걸쳐 amplification 기간을 설정함으로써 RCL 이 생성될 수 있는 충분한 배양기간을 확보하였고 마지막 배양 일(21일)에서 얻은 배양 상등액을 2차 transduction에 사용하였 다. 2차 transduction 후에는 추가적으로 6일간의 indication 기 간을 설정하였으며 특정 바이러스 유전자의 이동에 의한 RCL 형성 가능성에 대해 확인 하고자 하였다.
다음날, 기존 배지를 새로운 배지로 교체해주고 37°C, 5%의 CO₂ 배양기에서 추가적으로 21일 동안 배양하였다(amplihcation stage). 배양기간 동안 7, 14, 21일차 에서의 PCR 분석과 p24 ELISA 분석을 위하여 각각 HeLa 세포의 genomic DNA와 배양 상등액을 확보하였다. 또한 true RCL2] 확인을 위하여 21일차 에서 얻은 배양상등액으로 HeLa 세포에 2차 transduction을 실 시하였으며 추가적으로 6일 동안 배양하였다(indicator stage).
먼저 transduction 후 남아있는 바이러스 벡터가 완전히 제거될 수 있 도록 확실한 세척 과정이 필요하며 목적세포에 대해서는 일정 기 간동안 계대배양을 거쳐야 한다. 본 실험에서 진행한 3주간의 amplification 기간으로 위의 문제점을 해결하기에 충분한 계대배 양과 세척 과정을 이행하였다. Amplification 기간 동안 얻은 7, 14, 21일 차의 배양 상등액과 indication 기간에서 얻은 6일차의 배양 상등액을 이용하여 ELISA를 실시하였다.
본 연구에서는 렌티바이러스 벡터 유래 유전자치료제의 품질 관리 중 가장 중요한 두 가지 요소인 벡터의 복제가능 바到러스 검출(RCL)과 역가측정에 관한 시험법을 설정하였다.
다음으로 real-time PCR을 이용하여 DNA titer를 결정 하였 다. 실험에 필요한 primer와 probe를 제작하기 위해서 렌티바이 러스 벡터에 필수적인 부분인 PBS/psi 에 대한 primer와 probe 를 제작하였다. Transfer 벡터를 10배씩 단계별 희석(1乂1()6~1) 하여 standard 곡선을 그리고 이를 이용하여 transduction된 HeLa 세포의 genomic DNA에 대한 역가를 결정하였다(Fig.
6). 이러한 결과로 볼 때 copy수에 따른 두 PCR 간의 민감도는 큰 차 이를 나타내지 않았으며 따라서 본 실험에서는 RCL 검출을 위하 여 두 PCR을 모두 사용하여 진행하였다. 이러한 검출 민감도를 토대로 amplification3]- indicator 기간에서 얻은 genomic DNA에 대한 PCR 분석을 통하여 RCL의 존재여부를 확인하고자 하였다.
4A, 4B). 이중에서 GFP의 %값이 1-25% 범위 안에 포함되는 IO®과 10-3의 희석배수를 역가 결정에 사용하였 으며 각각의 %값과 세포수, 그리고 들어간 벡터의 양을 이용하 여 역가를 구하였다. 본 실험에 사용된 렌티바이러스.

대상 데이터

DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM(Eagle Minimum Essential Medium), FBS(Fetal Bovine Serum), PBS(Phosphate Buffered Saline), trypsin-EDTA 등은 Gibco BRL (Grand Island, NY U.S.A.) 제품을 사용하였고 Lipofectamine 2000伽은 lnvitrogen(Carlsbad, CA, U.S.A.) 제품을 사용하였다. DNeasy Tissue Kit는 QIAGEN(Hilden, Germany) 제품을 사용 하였고 Polybrene(lf5-Dimethyl-lf5-Diazaundecamethylene- Poly- methobromide)과 AZT(3'-Azido-3'-deoxythymidine)^ Sigma (St.
) 제품을 사용하였다. DNeasy Tissue Kit는 QIAGEN(Hilden, Germany) 제품을 사용 하였고 Polybrene(lf5-Dimethyl-lf5-Diazaundecamethylene- Poly- methobromide)과 AZT(3'-Azido-3'-deoxythymidine)^ Sigma (St. Louis, MO, U.S.A.) 제품을 사용하였다. PCR에 사용되는 laq polymerase, MgCl》PCR buffer; dNTP 등은 Promega (Madison.
) 제품을 사용하였다. PCR에 사용되는 laq polymerase, MgCl》PCR buffer; dNTP 등은 Promega (Madison. WI, U.S.A.) 제품을, HIV-1 p24 antigen ELISA lest kit는 Vironostika(Organon Teknika, USA.)의 제품을 사용하였 다. Flow cytometer는 Beckman Coulter■의 Cytomics FC 500, real-time PCR은 Applied Biosystems의 9700HT를 사용하였다.
이중에서 GFP의 %값이 1-25% 범위 안에 포함되는 IO®과 10-3의 희석배수를 역가 결정에 사용하였 으며 각각의 %값과 세포수, 그리고 들어간 벡터의 양을 이용하 여 역가를 구하였다. 본 실험에 사용된 렌티바이러스. 벡터의 GFP titer는 lx 107 TU/mZ로 조사되었다.
세포주로는 293T(ATCC CRL-11268), HeLa(ATCC CCL-2) 등을 American Type Culture Collection(Ro이cville, MD)으로부 터 구입하여 사용하였고 각각의 세포주를 10% FBS, 2mM L- glutamine, 1% antibiotics(penicillin-streptomycin)/}- 첨 가된 DMEM과 EMEM에서 37°C, 5% C(&의 조건으로 계대배양하여 사용하였다. '
렌티바이러스 벡터는 transient tnansfectioii법으로 생산하였다. 실험 하루 전, 10-cm dish에 2X1()6개의 293T 세포를 준비하였 다. 다음날, 벡터생산에 필요한 4가지 플라스미드인 transfer 벡 터 (pRWLSIN・cPPT.

이론/모형

렌티바이러스 벡터는 transient tnansfectioii법으로 생산하였다. 실험 하루 전, 10-cm dish에 2X1()6개의 293T 세포를 준비하였 다.
본 실험에서 사용한 렌티바이러스 벡터 안전성 시험의 전체적인 방향은 레트로바이러스 벡터에 대한 FDA의 가이드라인을16) 모델로 하여 세포배양 방법 및 기간을 설정하였다. 먼저 벡터를 처리한 후 3주간에 걸쳐 amplification 기간을 설정함으로써 RCL 이 생성될 수 있는 충분한 배양기간을 확보하였고 마지막 배양 일(21일)에서 얻은 배양 상등액을 2차 transduction에 사용하였 다.
본 연구에서 RCL의 안전성 평가를 위하여 사용한 두 번째 방 법은 p24 ELISA 분석이다. 이 분석법은 매우 표준화된 방법으 로써 널리 사용되지만 몇 가지 문제점을 내포하고 있다.

성능/효과

마찬가지로 21일차 에서 얻은 배양 상등액을 이용하여 2차 transduction을 실시한 경우 상등액 내의 RCL 존재여부에 따라 indicator 기간 후에 실 시하는 PCR의 결과는 상이하게 나올 것으로 예상할 수 있다. Fig. 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 indicator 기간에서는 VSV- G는 물론 PBS/psi 서열도 검출할 수 없었으며 결론적으로 이러 한 유전자의 이동이 이루어지지 않았고 따라서 true RCL이 존 재하지 않음을 입증할 수 있었다.
두 PCR 간의 민감도 차이를 알아보고자 transfer 벡터 DNA와 envelope 플라스미드 DNA의 copy 수에 따른 PCR을 수행하였다. Transfer 벡터 DNA&X 105~1 copy)와 envelope 플라스미드 DNA(1.6x 105~1.6 copy)를 10배씩 단계별로 희석하고 PCR을 실시한 결과 검출 민감도는 두 PCR 모두에서 각각 10 copy와 16 copy임을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 이러한 결과로 볼 때 copy수에 따른 두 PCR 간의 민감도는 큰 차 이를 나타내지 않았으며 따라서 본 실험에서는 RCL 검출을 위하 여 두 PCR을 모두 사용하여 진행하였다.
9 pg/mZ) 정도의 비율로 희석됨을 알 수 있었다. 결과적으로 MOI 가 2.5 이상으로 벡터를 처리할 경우 상등액에 남아 있는 벡터 를 완전히 제거하기 위해서는 7일 이상의 배양기간이 요구됨을 확인할 수 있었다.
따라서 7일 동안 1회의 세척과 1회의 .계대배양을 실시한 후의 p24 농도는 약 3배(18.9 pg/mZ) 정도의 비율로 희석됨을 알 수 있었다. 결과적으로 MOI 가 2.
5). 그 결과 DNA titer는 8.9 x 107 molecules/m/을 나타내었다. 추가적으로 벡터 상등액 내의 p24 단백질의 양을 측정하여 벡 터의 물리적 역가를 측정할 수 있다.
각각 3회와 5회로 나누어 계대기간을 설정하고 amplification 배양을 진행하였다. 그 결과 PCR과 p24 ELISA 모두에서 S회와 5회 사이에 뚜렷한 차이를 확인할 수 없 었으며 따라서 amplification 기간동안의 계대배양의 빈도는 실 험결과에 별다른 영향을. 미치지 않는 것으로 사료된다.
5 ng/m/의 값을 나타내었다. 따라서 GFP titer의 경우 p24(ng) 당 3.8x 104 TU/m/의 관계가 있었으며 DNA titer의 경우는 p24(ng) 당 3.4X 105 molecules/m/ 의 관계가 있음을 확인하였다(1汕le I)- 현재까지 Transducing Unit(TU)를 결정하는 표준 분석법은 아직 확립되어 있지 않은 상태이다. 따라서 p24(ng) 당 TU의 값은 각 실험실마다 매우 다 양하게 나타날 수 있다.
이를 기능적 역가인 GFP titei; DNA titer와 비교하여 둘 사이의 관계를 알아보고자 하였 다. 먼저 벡터 상등액에 대한 p24 ELISA를 실시하고 벡터 상등 액 내의 p24 양을 측정한 결과 262.5 ng/m/의 값을 나타내었다. 따라서 GFP titer의 경우 p24(ng) 당 3.
4p以m/이었다. 실험 결과, amplification 기간 중 7일차에 MOI가 2.5인 샘플에 서 7.35±0.45pg/m/의 p24가 검출되었다. 이를 제외한 나머지 샘플에서는 날짜와 MOH 관계없이 모두 CV값 이하의 결과를 나타냄으로써 p24가 검출되지 않음을 확인하였다(Ibble HI).
4C). 이러한 실험을 통하여 transduction된 세포에서 의 GFP 발현은 바이러스 벡터에 의한 reverse transcription의 결과임을 확인할 수 있었다.
45pg/m/의 p24가 검출되었다. 이를 제외한 나머지 샘플에서는 날짜와 MOH 관계없이 모두 CV값 이하의 결과를 나타냄으로써 p24가 검출되지 않음을 확인하였다(Ibble HI). Transfer 벡터에 포함되어있는 start gag 부분은 전체 gag의 일 부분으로써 온전한 gag가 발현될 수 없고 계대배양이 이루어진 14, 21일차에서는 높은 MOI(MOI=2.
반면에 PBS/psi의 경*는' amplification 기간에서는 검출되 지만 indicator 기간에서는 검출되지 않음을 보이기 위해 실시하 였다. 즉 amplification 기간에서 검출된 서열이 indicator phase 로 이동되지 않았음을 증명하였다.
즈訂 인위적으로 높아진 transduction 효율을 나타낼 수 있는데, 이러한 pseudo- transduction을 테스트하기 위해 transduction을 실시하기 30분 전 역전사 효소의 활성억제 물질인 AZT(50uM)를 처리해주고 높은 농도의 벡터(MOI=20)를 넣어 줌으로써 확인할 수 있다. 처리전후의 flow cytometer를 분석한 결과, AZT를 처리한 세포 에서 transduction 효율이 약 90% 이상 감소되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4C). 이러한 실험을 통하여 transduction된 세포에서 의 GFP 발현은 바이러스 벡터에 의한 reverse transcription의 결과임을 확인할 수 있었다.

후속연구

따라서 이러한 단점을 극복하고자 real-time PCR 을 이용한 역가측정법(DNA titer 측정법)。] 개발되었으며 본 연 구에서 비교 실험한 결과 GFP titer 보다 더욱 정확한 역가를 얻을 수 있었다.⑵ 다만 DNA titer의 경우 벡터 상등액에 남아 있는 플라스미드 DNA가 역가에 영향을 줄 수 있다는 내용이 보 고 되었으며 따라서 플라스미드 DNA의 제거에 대한 연구가 추 가로 진행되어야 한다고 사료된다.
이러한 단점에도 불구하고 PCR 분석법의 경우 는 RCL의 생성 가능성을 DNA 수준에서 추정하는 것과 달리 p24의 경우 이미 생성된 RCL을 검출하기 때문에 더욱 실제적인 RCL 검출법이라 할 수 있다. 결론적으로 PCR과 p24 ELISA는 각각의 장단점을 가지고 있으며 따라서 두 분석법을 서로 병행 하여 사용함으로써 더욱 정확한 RCL 검증이 이루어질 것으로 생각된다.
본 연구에서 언급한 유전자치료용 벡터의 품질평가 방법들은 향후 벡터의 RCL 및 역가측정을 검토하기 위한 가장 기본적이 고 필수적인 방법들이다. 따라서 앞으로 개발될 다양한 HIV-1 유 래 렌티바이러스 벡터의 품질관리를 위해 매우 중요한 자료가- 될 것이며, 많은 활용이 예상된다.
본 연구에서 언급한 유전자치료용 벡터의 품질평가 방법들은 향후 벡터의 RCL 및 역가측정을 검토하기 위한 가장 기본적이 고 필수적인 방법들이다. 따라서 앞으로 개발될 다양한 HIV-1 유 래 렌티바이러스 벡터의 품질관리를 위해 매우 중요한 자료가- 될 것이며, 많은 활용이 예상된다.

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증

HIV-l 유래 렌티바이러스 벡터의 복제가능 바이러스 검출과 역가측정 분석방법 비교
Comparison of Analysis Methods for Detection of Replication Competent Virus and Functional Titers of HIV-l Based Lentivirus Vector 원문보기

Abstract ▼ AI-Helper

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

가설 설정

제안 방법

대상 데이터

이론/모형

성능/효과

후속연구

참고문헌 (18)

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

연합인증

HIV-l 유래 렌티바이러스 벡터의 복제가능 바이러스 검출과 역가측정 분석방법 비교 Comparison of Analysis Methods for Detection of Replication Competent Virus and Functional Titers of HIV-l Based Lentivirus Vector 원문보기

Abstract ▼ AI-Helper

주제어

AI 본문요약 엑셀 다운로드 AI-Helper

문제 정의

가설 설정

제안 방법

대상 데이터

이론/모형

성능/효과

후속연구

참고문헌 (18)

이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

정자영 (26) 안광수 (6) 손여원 (7)

관련 콘텐츠

원문 보기

원문 URL 링크

이 논문과 함께 이용한 콘텐츠

AI-Helper ※ AI-Helper는 오픈소스 모델을 사용합니다.

선택된 텍스트

HIV-l 유래 렌티바이러스 벡터의 복제가능 바이러스 검출과 역가측정 분석방법 비교
Comparison of Analysis Methods for Detection of Replication Competent Virus and Functional Titers of HIV-l Based Lentivirus Vector 원문보기

AI 본문요약
AI-Helper