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문제 정의
- pylori 저해 유산균주의 개발이 필요하다. 이를 위하여 H. pylorie 생육을 억제하는 새로운 종류의 유산균을 신생아의 분변으로부터 분리, 동정한 후, 그 배양액의 항균 활성 및 urease 저해능을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- Lactobacilli MRS broth의 pH를 각각 1.5, 2.0 그리고 3.0이 되도록 조절한 후 pepsin을 1,000 units/ml가 되도록 첨가하였다. 여기에 H.
- P. acidilactici GMB7330의 항균력에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 Lactobacilli MRS broth를 P. acidilactici GMB7330 의 pH와 동일한 4.5로 조절하여 실험하였을 경우 항균력을 보이지 않았다. 한편 P.
- 에 50mM/L의 urea를 현탁)과 혼합하여 37℃, 20분 반응시켰다. Urease 활성은 Wako Ammonia Test Kit (Wako, Japan)를 이용하여 측정한 암모니아 농도를 상대 활성으로 나타내었다.
- pylorie 대한 저해능이 큰 것으로 조사된 균주들을 약 106 CFU/ml가 되도록 접종하여 37℃, 2시간 배양한 후 균 생존율을 조사하였다. 내담즙성 실험을 위해서는 0.1, 0.3, 0.5,1.0%의 oxgall이 포함된 0.05 M N&HPQ, buffer (pH 7.0)에 접종하여 37℃, 6시간동안 배양하면서 생균수측정을 통해 균의 생존율을 조사하였다.
- pylorie 대한 저해능을 실험하였다. 또한 분리된 균주가 생산하는 젖산에 의한 저해를 알아보기 위해 시판되고 있는 젖산 시약의 농도를 일정하게 조절한 후 역시 H. pylorie 대한 저해능을 실험하였다.
- pylori 26695를 약 105 CFU/ ml가 되도록 접종하여 동일한 성분의 평판배지 위에 중층하여 건조한 후 여기에 직경 4 mm의 well을 만들어 40 ㎕ 배양여액 을 넣은 후 37℃, 2-3일간 배양하였다. 배양 후 나타난 생육 저지환의 크기를 측정하여 H. pylorie 증식 저해능이 가장 큰 균주를 선정하였다.
- 분리된 균주가 H. pylorie\ urease 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 분리된 균주의 배양여액 5 ml를 Brucella broth 10 ml에 첨가한 후 H: pylori 26695 배양액 5 ml (108 CFU/ml)를 접종하였다. 37℃에서 1시간 배양한 후, 시료 1 ml를 멸균된 PBS로 수세한 후 다시 Brucella broth 100 ㎕에 현탁하였다.
- 분리된 균주가 H. pylori에 미치는 저해작용을 전자현미경으로 관찰하였다. H.
- 분리된 균주의 동정을 위해 API 50CHL kit (Biomereux, France)를 이용하여 당자화능을 조사하였으며 16S rRNA 분석을 실시하였다.
- 신생아 분변 1 g을 취하여 멸균 증류수 10 ml에 넣어 약 1분간 vortexing한 후 적절히 희석해서 BCG medium (tryptone, 20 g; dextrose, 20 g; NaCl, 5 g; bromocresol green, 0.02 g per liter)에 도말, 배양(3TC, 2일)했을 때 나타난 노란색 집락들을 Lactobacilli MRS broth (Difco Laboratories, Detroit, Ml)에 접종하여 배양한 다음, OD6S0nm7]- 1.0이상이며 pH가 4.2이하를 나타내는 집락을 선택하였다. 이후 이들을 대상으로 Gram 양성이며 catalase 음성인 집락을 일차적으로 분리한 후, 아래와 같이 H.
- 0이 되도록 조절한 후 pepsin을 1,000 units/ml가 되도록 첨가하였다. 여기에 H. pylorie 대한 저해능이 큰 것으로 조사된 균주들을 약 106 CFU/ml가 되도록 접종하여 37℃, 2시간 배양한 후 균 생존율을 조사하였다. 내담즙성 실험을 위해서는 0.
- pylori 26695의 집락을 PBS (phosphate buffered saline)에 현탁하여 5, 500 x g, 5분간 원심분리한 후 Brucella broth에 재현탁(" CFU/ml)하였다. 이 현탁액 5 ml와 분리균주의 배양여액 5 ml를 Brucella broth 10 ml 에 접종하여 미호기적 조건에서 진탕배양하면서 생균수를 측정하였다. 이때 분리된 균주의 배양여액의 pH가 H.
- 이 현탁액 5 ml와 분리균주의 배양여액 5 ml를 Brucella broth 10 ml 에 접종하여 미호기적 조건에서 진탕배양하면서 생균수를 측정하였다. 이때 분리된 균주의 배양여액의 pH가 H. pylori 저해에 미치는 영향을 알아보기 위해 Lactobacilli MRS broth의 pH를 분리된 균주의 배양여액의 pH와 같은 4.5가 되도록 조절하여 H. pylorie 대한 저해능을 실험하였다. 또한 분리된 균주가 생산하는 젖산에 의한 저해를 알아보기 위해 시판되고 있는 젖산 시약의 농도를 일정하게 조절한 후 역시 H.
- pylori 26 695 (108 CFU/ml)의 배양액에 분리된 균주의 배양여액을 첨가하여 37℃, 12시간 배양하였다. 이후 원 심분리하여 균체를 모아 2.5% (v/v) glutaraldehyde로 고정한 후 전처리 과정을 거쳐 투과전자현미경(JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
- 1). 이후 이 균주를 GMB7330 으로 명명하여 실험을 진행하였다. GMB7330의 내산성 및 내담 즙성 실험 결과(Table 1), GMB7330은 pH 2.
- 2이하를 나타내는 집락을 선택하였다. 이후 이들을 대상으로 Gram 양성이며 catalase 음성인 집락을 일차적으로 분리한 후, 아래와 같이 H. pylori 증식 저해능 실험과 내산성 및 내담즙성 실험을 통해 시험균주를 선정하였다.
- 일차적으로 분리한 균주들의 H. pylorie 대한 저해능을 조사하기 위해 이들 균주들을 Lactobacilli MRS broth를 이용하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 5, 500 X g, 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양여액을 시료로 사용하였다. 10%의 FBS가 함유된 Brucella soft agar 배지 5 ml에 H.
대상 데이터
- H. pylori 26695는 경상의대 미생물학 교실로부터 제공받았으며, 10% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 Brucella agar plate 를 이용해 37℃, 미호기적 조건(10% CO2)에서 배양하였다.
- 본 실험에서 H. pylori에 대한 저해균주로서 신생아의 분변에서 분리, 선택한 균주의 배양여액은 10% FBS가 포함된 Brucella agar plate 상에서 증식한 H. pylori 26695에 대해 뚜렷한 생육저지환을 형성하였다(Fig. 1). 이후 이 균주를 GMB7330 으로 명명하여 실험을 진행하였다.
성능/효과
- Lactobacilli MRS broth와 Lactobacillus sp. GM7311의 배양여액의 경우 pH가 2.7이나 4.5의 산성일 경우에만 urease 활성을 감소시킨 반면, P. acidilactici GMB7330은 pH에 관계없이 urease 활성을 크게 감소시키는 것으로 나타났다(Table 6). 이러한 결과는 젖산으로 인한 pH 저하가 H.
- GMB7330은 API kit에 의한 당자화능 조사(Table 3) 및 16S rRNA 분석 (Fig. 2)에 의해 Pediococcus acidilactici으로 동정되었고 이후 P. acidilactici GMB7330으로 명명되었다.
- 이후 이 균주를 GMB7330 으로 명명하여 실험을 진행하였다. GMB7330의 내산성 및 내담 즙성 실험 결과(Table 1), GMB7330은 pH 2.0 및 3.0의 산성 조건에서 사멸되지 않았으며 1.0%의 bile salt 농도에서도 생존이 가능한 것으로 나타났다(Table 2).
- P. acidilactici GMB7330을 처리한 H pylori의 전자현미경 사진을 관찰한 결과(Fig. 4), GMB7330을 처리한 처리구는 대조구에 비하여 일부 세포벽의 파괴로 인해 세포 내 물질이 유출되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 GMB7330이 H.
- GM7311의 배양여액으로 비교실 험하였다. 실험 결과, H. pylori에 대한 항균력을 관찰할 수는 없어 이러한 항균활성이 모든 유산균에서 나타나는 보편적인 현상이 아님을 알 수 있었는데 이러한 결과는 Wendakoon 등(17)의 결과와 일치하는 것이었다. 한편 P.
- pylori에 대한 항균력을 관찰할 수는 없어 이러한 항균활성이 모든 유산균에서 나타나는 보편적인 현상이 아님을 알 수 있었는데 이러한 결과는 Wendakoon 등(17)의 결과와 일치하는 것이었다. 한편 P. acidilactici GMB7330의 항균력이 균 증식에 따라 생성되는 젖산에 의한 활성인지의 여부를 알아보기 위해 시판되고 있는 젖산시약을 농도별로 조절하여 H. pylori에 대한 항균력을 조사한 결과(Table 5), 젖산시약은 50 mM/1 이하의 농도에서는 H. pylorie] 증식을 억제시키지 못하는 것으로 나타났다. H.
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