수용성 식이섬유의 섭취는 혈청 콜레스테롤 저하효과가 있으며 , 그 작용기 작으로는 수용성 식이섬유의 점성으로 인한 콜레스테롤과 담즙산 흡수저해, 대장내 미생물 발효로 생성 된 단쇄지방산에 의한 콜레스테롤 합성률 변경 및 담즙산 합성증가 등으로 설명되어진다. 그러나 명확한 작용기전은 규명 되지 않았다. 본 연구에서는 간세포 핵내의 CYP7A1의 발현에 호르몬과 식이섬유의 발효로 생성된 단쇄지방산이 미치는 영향을 알아보았다. 사람의 간세포(HepG2 세포)의 배양배지에 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine을 각각 $1\;{\mu}M$ 투여하고 24시간 배양하였다. Semi-quantitative RT-PCR기법에 의해 CYP7A1 mRNA발현을 측정한 결과, dexamethasone에서 가장 높아 $173\%$의 증가를 나타내었고, 그 다음으로 insulin에서 $150\%$, triiodothyronine 에서 $141\%$의 증가를 나타내었다. 이처럼 transient transfection을 하지 않은 HepG2 세포에서 생리적 조절자로 알려진 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine이 CYP7A1의 발현을 모두 증가시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 규명하며, rat gene and/or human gene 발현이 다르게 조절됨을 제안한다. 단쇄지방산에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해서 actetate, propionate 및 butyrate를 각각 1 M농도로 24시간 동안 배양한 결과, 모든 단쇄지방산이 CYP7A1의 발현을 증가시켰다. Acetate와 propionate는 유사한 효과를 나타내어 대조군에 비하여 1.8배의 증가를 나타내었으며 , butyrate는 1.5배의 증가를 보였다. 이상의 결과는 수용성 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 수용성 식이섬유의 대장 발효가 대장을 자극함으로써 내인성 호르몬의 변화를 통해서 나타나거나 대장내 발효산물인 actetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있을 것이다. 단쇄지방산의 CYP7A1 발현에 미치는 작용은 acetate와 propionate가 butyrate보다 큼을 알 수 있었다.
수용성 식이섬유의 섭취는 혈청 콜레스테롤 저하효과가 있으며 , 그 작용기 작으로는 수용성 식이섬유의 점성으로 인한 콜레스테롤과 담즙산 흡수저해, 대장내 미생물 발효로 생성 된 단쇄지방산에 의한 콜레스테롤 합성률 변경 및 담즙산 합성증가 등으로 설명되어진다. 그러나 명확한 작용기전은 규명 되지 않았다. 본 연구에서는 간세포 핵내의 CYP7A1의 발현에 호르몬과 식이섬유의 발효로 생성된 단쇄지방산이 미치는 영향을 알아보았다. 사람의 간세포(HepG2 세포)의 배양배지에 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine을 각각 $1\;{\mu}M$ 투여하고 24시간 배양하였다. Semi-quantitative RT-PCR기법에 의해 CYP7A1 mRNA발현을 측정한 결과, dexamethasone에서 가장 높아 $173\%$의 증가를 나타내었고, 그 다음으로 insulin에서 $150\%$, triiodothyronine 에서 $141\%$의 증가를 나타내었다. 이처럼 transient transfection을 하지 않은 HepG2 세포에서 생리적 조절자로 알려진 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine이 CYP7A1의 발현을 모두 증가시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 규명하며, rat gene and/or human gene 발현이 다르게 조절됨을 제안한다. 단쇄지방산에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해서 actetate, propionate 및 butyrate를 각각 1 M농도로 24시간 동안 배양한 결과, 모든 단쇄지방산이 CYP7A1의 발현을 증가시켰다. Acetate와 propionate는 유사한 효과를 나타내어 대조군에 비하여 1.8배의 증가를 나타내었으며 , butyrate는 1.5배의 증가를 보였다. 이상의 결과는 수용성 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 수용성 식이섬유의 대장 발효가 대장을 자극함으로써 내인성 호르몬의 변화를 통해서 나타나거나 대장내 발효산물인 actetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있을 것이다. 단쇄지방산의 CYP7A1 발현에 미치는 작용은 acetate와 propionate가 butyrate보다 큼을 알 수 있었다.
Cholesterol $7\alpha-hydroxylase$ (CYP7A1) is the rate-limiting enzyme in the conversion of cholesterol to bile acids and plays a central role in regulating cholesterol homeostasis. We previously showed that a fermentable $\beta-glucan$ ingestion decreased plasma cholesterol le...
Cholesterol $7\alpha-hydroxylase$ (CYP7A1) is the rate-limiting enzyme in the conversion of cholesterol to bile acids and plays a central role in regulating cholesterol homeostasis. We previously showed that a fermentable $\beta-glucan$ ingestion decreased plasma cholesterol levels due to fecal bile acid excretion elevation involved inincrease of cholesterol $7\alpha-hydroxylase$ mRNA expression and activity. It is proposed that short chain fatty acids (SCFA) produced by cecal and colonic fermentation of soluble fiber are associated with cholesterol-lowering effect of fiber. In the present study, we investigated whether CYP7A1 expression is up-regulated by short chain fatty acids or by hormones in cultured human hepatoma (HepG2) cells. Confluent HepG2 cell were incubated with acetate, propionate, or butyrate at 1 mM concentration for 24 hrs. Acetate as well as propionate increased to 1.8-fold expression of CYP7A1 mRNA than the control. Butyrate also increased 1.5-fold expression of CYP7A1 mRNA. Our data show for the first time that SCFA increase expression of CYP7A1 mRNA. Adding insulin, dexamethasone and triiodothyronine $(1\;{\mu}M)$ to HepG2 cell increased the expression of CYP7A1 mRNA to $150\%,\;173\%,\;141\%$, respectively. These results suggest that SCFA produced by cecal fermentation stimulate enteric nervous system, in which secreted some neuropeptides may be responsible for change in cholesterol and bile acid metabolism. These findings suggest that SCFA are involved in lowering plasma cholesterol levels due to the up-regulation of CYP7A1 and bile acid synthesis.
Cholesterol $7\alpha-hydroxylase$ (CYP7A1) is the rate-limiting enzyme in the conversion of cholesterol to bile acids and plays a central role in regulating cholesterol homeostasis. We previously showed that a fermentable $\beta-glucan$ ingestion decreased plasma cholesterol levels due to fecal bile acid excretion elevation involved inincrease of cholesterol $7\alpha-hydroxylase$ mRNA expression and activity. It is proposed that short chain fatty acids (SCFA) produced by cecal and colonic fermentation of soluble fiber are associated with cholesterol-lowering effect of fiber. In the present study, we investigated whether CYP7A1 expression is up-regulated by short chain fatty acids or by hormones in cultured human hepatoma (HepG2) cells. Confluent HepG2 cell were incubated with acetate, propionate, or butyrate at 1 mM concentration for 24 hrs. Acetate as well as propionate increased to 1.8-fold expression of CYP7A1 mRNA than the control. Butyrate also increased 1.5-fold expression of CYP7A1 mRNA. Our data show for the first time that SCFA increase expression of CYP7A1 mRNA. Adding insulin, dexamethasone and triiodothyronine $(1\;{\mu}M)$ to HepG2 cell increased the expression of CYP7A1 mRNA to $150\%,\;173\%,\;141\%$, respectively. These results suggest that SCFA produced by cecal fermentation stimulate enteric nervous system, in which secreted some neuropeptides may be responsible for change in cholesterol and bile acid metabolism. These findings suggest that SCFA are involved in lowering plasma cholesterol levels due to the up-regulation of CYP7A1 and bile acid synthesis.
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문제 정의
이제까지, transient transfection assay에 의한 CYP7A1 유전자의 발현 조절을 살펴본 보고들은 있으나, CYP7A1 유전자를 transfection하 지 않은 HepG2 cell에서의 mRNA 발현을 조사한 보고는 없었다. 간세포인 HepG2 celle 자체적으로 CYP7A1 유전 자를 가지므로, confluent한 HepG2 cell 상태에서 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine 호르몬과 단쇄 지 방산을 처리하여 그 발현정도를 살펴본 본 연구의 결과는 의미가 있다. Semi-quantitative RT-PCR 기법을 이용하여 조사한 호르몬 모두에서 CYP7A1 발현이 증가하였으며, 그 효과는 dexamethasone 처리 시 에 가장 컸다.
그러나 명확한 작용기전 은 규명되지 않았다. 본 연구에서는 간세포 핵내의 CYP7A1의 발현에 호르몬과 식이섬유의 발효로 생성된 단쇄지방산 이 미치는 영향을 알아보았다. 사람의 간세포(HepG2 세포) 의 배양배지에 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine 을 각각 1 UM 투여하고 24시간 배양하였다.
본 연구의 목적은 식이섬유의 대장 발효산물인 acetate, propionate 및 butyrate 단쇄지방산과 생리적 조절자로서 알 려진 insulin, dexamethasone과 triiodothyronine 호르몬이 사람의 간세포인 HepG2 cell 내의 CYP7A1 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
Semi-quanti- tative RT-PCR 기 법 에 의해 CYP7A1 mRNA 발현을 측정한 결과, dexamethasone에서 가장 높아 173%의 증가를 나 타내었고, 그 다음으로 insulin에서 150%, triiodothyronine 에서 141%의 증가를 나타내었다. 이처럼 transient trans- fection을 하지 않은 HepG2 세포에서 생리적 조절자로 알려진 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine ° ] CYP7A1의 발현을 모두 증가시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 규명 하며, rat gene and/or human gene 발현 이 다르게 조절 됨을 제안한다. 단쇄지방산에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해서 actetate, propionate 및 butyfate를 각각 1 mM 농도로 24시간 동안 배 양한 결과, 모든 단쇄지방산이 CYF7A1의 발현을 증가시 켰다.
가설 설정
분리된 간세포의 초기 연구로부터, propionate가 콜레 스테롤 합성에 저해효과를 가지는 것으로 추측되었다(48-50). 이 가설은 propionate(<l mmol/L 농도에서)가 간세포 에서 acetate로부터 콜레스테롤 생합성을 유의적으로 저 해 할 수 있다는 관측으로부터 일부 지지를.받았다(51).
제안 방법
Forward primer의 sequence는 다음과 같다: CYP7A1 5'-TGG ATT AAT TCC ATA CCT GG~3‘; P-actin, 5JGGA CCT GAC AGA CTA CCT CA-3\ Reverse primer의 sequence는 다음과 같다: CYP7A1 5'-CCT TAT GGT ATG ACA AGG GA-3Z; P-actin, 5-GTT GCC AAT AGT GAT GAC CT-3\RT-product의 semi-quantitation's 위하여 cDNA를 농 도별로 희석시켜 준비하고 1卜actin으로 증폭하여 동량의 cDNA를 구하였다. 각각의 cDNA를 10X Taq polymerase buffer(15 mM MgCh 포함), 0.2 mM dNTPs, 0.125 U Super Taq polymerase와 혼합하고, 0.25 uM의 primer와 반응人] 켰 匸" 증폭은 DNA thermal cycler (Gene Amp® PCR System 2700)로 하였다.
PCR의 반응조건은 다음과 같다. 95℃에서 5분, 95℃에서 15초(denaturation), CYP7A1 25 cycle, P-actin 20 cycled 55 C에서 30초(annealing), 72℃에서 40초(extension), 72℃ 에서 10분(final extension)하였다. 증폭된 각각의 시료는 ethidium bromide으로 염 색 하여 1.
HepG2 세포가 약 80%의 confluence를 나타낼 때 serum free medium(Dulbecco, s mod迁ied Eagle's medium, 1 mg/ mL BSA, 15 mM HEPES, 100 IU penicillin, 100 Hg strep- tomycin/mL) 에 acetate, propionate와 butyrate를 각각 0.5, 1, 2.5, 5 mM의 네 가지 농도로 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하여 최적의 조건을 확립하였다. 호르몬 으로 insulin, thyroid(T3)와 dexamethasone-®- 배지 에 각각 0.
단쇄지방산인 acetate(C2)와 propionate(C3)0, 0.5, 1,2.5, 5 mM의 5가지 농도를 HepG2 cell에 24시 간, 48시간 처 리한 후, CYP7A1 유전자의 발현정도를 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 최적의 조건을 조사하였다. HepG2 cell 에서의 CYP7A1 gene의 발현은 acetate의 처리시 0에서 1 mM의 농도에서는 dose-dependant하게 증가하였으며, 二L 이상의 농도에서 는 약간 증가하는 경 향올 보였다(Fig.
본 연구에서는 간세포 핵내의 CYP7A1의 발현에 호르몬과 식이섬유의 발효로 생성된 단쇄지방산 이 미치는 영향을 알아보았다. 사람의 간세포(HepG2 세포) 의 배양배지에 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine 을 각각 1 UM 투여하고 24시간 배양하였다. Semi-quanti- tative RT-PCR 기 법 에 의해 CYP7A1 mRNA 발현을 측정한 결과, dexamethasone에서 가장 높아 173%의 증가를 나 타내었고, 그 다음으로 insulin에서 150%, triiodothyronine 에서 141%의 증가를 나타내었다.
HepG2 세포는 이전의 방법(34)에 따라 배양하였다. 즉, growth medium(Dulbecco5s modified Eagle's medium, 10% FBS, 1% glutamine, 50IU penicillin/mL, 50 Ug streptomycin/ mL) 에 5x 105 ceU/plate의 배 율로 plating하고, media는 1회 /2일으로 교환하면서 cell의 confluent condition올 확인하였다.
여러가지 처리 조건에서 배양된 세포의 totalRNA는 I X 107 cells/1 mL TRIZOL® reagent로 추출하였다. 추출된 RNA의 농도는 spectrophotometer를 사용하여 측정하였다.
5, 5 mM의 네 가지 농도로 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하여 최적의 조건을 확립하였다. 호르몬 으로 insulin, thyroid(T3)와 dexamethasone-®- 배지 에 각각 0.5, 1, 2.5, 5 UM의 네 가지 농도로 처리한 후 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하여 최적의 조건을 확립하였다.
호르몬에 의한 HepG2 cell에서의 CYP7A1 gene의 발현 정도를 측정 하기 위하여 insulin, dexamethasone 및 triiodo- thyronine을 0, 0.1, 0.5, 1 UM의 4가지 농도에서 24시 간, 48시간 및 72시간 처리한 후, CYP7A1 유전자의 발현정도를 semi- quantitative RT-PCR을 이용하여 안정적 인 조건을 조사하였다. Insulin을 24시간 처리한 경우 0.
대상 데이터
Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM), glutamine, trypsin-EDTA, penicillin/ streptomycin, Hank's balanced salt solution(HBSS), bovine serum albumin 및 fetal bovine serume GIBCO(USA) 에서 구입하였고, HEPES는 Amresco에서 구입하였다. Acetate, propionate, butyrate 및 dexamethasone, triiodothyronine, insulin(from porcine pancreas)-$- Sigma(USA)사를 이용하였고, RNA isolation kit인 TRIZOL® reagent는 In- vitrogen(USA)에서 구입하였다. RT-PCR에 사용한 5X RT buffer, PCR Nucleotide mix(10 mM), M-MLV(moloney- murine leukemia virus) reverse transcriptase(200 U/uL), lOObp DNA Ladder는 Promega(USA)에서 구입 하였고, oligo dTi9는 Bioneer(Korea)에서 구입 하였다.
5 mM dNTPs, Super Taq polymerase(5 U/μL)는 Super-Bio (Korea)에서 구입하였다. DNA thermal cycler(GeneAmp® PCR System 2700)는 Applied Biosystems의 제품을 사용중} 였다.
HepG2 세포는 생명공학연구원(한국, 대전)으로부터 분양 받아 액체질소에 보관하였다. Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM), glutamine, trypsin-EDTA, penicillin/ streptomycin, Hank's balanced salt solution(HBSS), bovine serum albumin 및 fetal bovine serume GIBCO(USA) 에서 구입하였고, HEPES는 Amresco에서 구입하였다. Acetate, propionate, butyrate 및 dexamethasone, triiodothyronine, insulin(from porcine pancreas)-$- Sigma(USA)사를 이용하였고, RNA isolation kit인 TRIZOL® reagent는 In- vitrogen(USA)에서 구입하였다.
HepG2 세포는 생명공학연구원(한국, 대전)으로부터 분양 받아 액체질소에 보관하였다. Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM), glutamine, trypsin-EDTA, penicillin/ streptomycin, Hank's balanced salt solution(HBSS), bovine serum albumin 및 fetal bovine serume GIBCO(USA) 에서 구입하였고, HEPES는 Amresco에서 구입하였다.
RT-PCR에 사용한 5X RT buffer, PCR Nucleotide mix(10 mM), M-MLV(moloney- murine leukemia virus) reverse transcriptase(200 U/uL), lOObp DNA Ladder는 Promega(USA)에서 구입 하였고, oligo dTi9는 Bioneer(Korea)에서 구입 하였다. Primer는 Bioneer (Korea)에서 구입하였고, 10X Taq polymerase buffer, 2.5 mM dNTPs, Super Taq polymerase(5 U/μL)는 Super-Bio (Korea)에서 구입하였다. DNA thermal cycler(GeneAmp® PCR System 2700)는 Applied Biosystems의 제품을 사용중} 였다.
각 실험의 결과는 3회 반복 실험한 결과를 Statistic Analysis System(SAS) 통계 프로그램에 의하여 실험군의 평균 과 표준오차를 계산하였다. 각 실험 군의 분석 항목별 차이는 Duncan's multiple range test로 general linear model(GLM) 을 이용하여 p<0.05수준에서 유의성을 검증하였다.
각 실험의 결과는 3회 반복 실험한 결과를 Statistic Analysis System(SAS) 통계 프로그램에 의하여 실험군의 평균 과 표준오차를 계산하였다. 각 실험 군의 분석 항목별 차이는 Duncan's multiple range test로 general linear model(GLM) 을 이용하여 p<0.
성능/효과
단쇄지방산에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해서 actetate, propionate 및 butyfate를 각각 1 mM 농도로 24시간 동안 배 양한 결과, 모든 단쇄지방산이 CYF7A1의 발현을 증가시 켰다. Acetate와 propionate는 유사한 효과를 나타내어 대조군에 비하여 1.8배의 증가를 나타내었으며, butyrate는 1.5배의 증 가를 보였다. 이상의 결과는 수용성 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 수용성 식이섬유의 대장 발효가 대장을 자극함으로써 내인성 호르몬의 변화를 통해서 나타 나거 나 대 장내 발효산물인 actetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있을 것이다.
1). Dexamethasone에 의한 HepG2 cell에서의 CYP7A1 gene의 발현 정도를 살펴본 결과는 24시간 배양시 에 0.1 J1M의 농도에서 발현이 가장 증가 하였으며(Fig. 1), 그 이상의 농도에서는 대조구보다 상승하였다. 배양시간을 24시 간에서 48, 72시 간으로 각각 연장시 켰 을 경우에도 역시 0.
5, 5 mM의 5가지 농도를 HepG2 cell에 24시 간, 48시간 처 리한 후, CYP7A1 유전자의 발현정도를 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 최적의 조건을 조사하였다. HepG2 cell 에서의 CYP7A1 gene의 발현은 acetate의 처리시 0에서 1 mM의 농도에서는 dose-dependant하게 증가하였으며, 二L 이상의 농도에서 는 약간 증가하는 경 향올 보였다(Fig. 3, Acetate). 배양시간을 24시간에서 48시간으로 연장시켰을 경우에 발현이 더 이상 증가하지는 않았다.
사람의 간세포(HepG2 세포) 의 배양배지에 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine 을 각각 1 UM 투여하고 24시간 배양하였다. Semi-quanti- tative RT-PCR 기 법 에 의해 CYP7A1 mRNA 발현을 측정한 결과, dexamethasone에서 가장 높아 173%의 증가를 나 타내었고, 그 다음으로 insulin에서 150%, triiodothyronine 에서 141%의 증가를 나타내었다. 이처럼 transient trans- fection을 하지 않은 HepG2 세포에서 생리적 조절자로 알려진 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine ° ] CYP7A1의 발현을 모두 증가시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 규명 하며, rat gene and/or human gene 발현 이 다르게 조절 됨을 제안한다.
간세포인 HepG2 celle 자체적으로 CYP7A1 유전 자를 가지므로, confluent한 HepG2 cell 상태에서 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine 호르몬과 단쇄 지 방산을 처리하여 그 발현정도를 살펴본 본 연구의 결과는 의미가 있다. Semi-quantitative RT-PCR 기법을 이용하여 조사한 호르몬 모두에서 CYP7A1 발현이 증가하였으며, 그 효과는 dexamethasone 처리 시 에 가장 컸다. 본 연구의 결과는 사람 의 간세포에서 CYP7A1 mRNA 발현이 HepG2 transient transfection system 내의 rat gene and/or human gene과는 다르게 조절됨을 제안한다.
CYP7/luciferase chimeric ge- nes의 전사는 HepG2 세포의 subconfluent시보다 confluent 할 때 높았으며, glucocorticoid receptors는 dexamethasone 존재시에 CYP7 유전자를 up-regulate충卜였음을 보고하였 匸}. Thyroid hormonese 영향을 주지 않았으며, insuline 저 해 하였고 dexamethasone에 의한 CYP7 유전자의 up-reg- ulation 효과를 상쇄시켰다, 위의 연구 결과는 본 실험결과와 차이가 있었으나, 이는 사람의 CYP7A 유전자와 rat CYP7A 유전자의 차이에 의한 것으로 추측된다. 이제까지, transient transfection assay에 의한 CYP7A1 유전자의 발현 조절을 살펴본 보고들은 있으나, CYP7A1 유전자를 transfection하 지 않은 HepG2 cell에서의 mRNA 발현을 조사한 보고는 없었다.
5% sodium propionate와 콜레스테롤 식이를 섭취한 흰쥐에서 혈청과 간의 콜레스테롤이 유의적으로 감소하였으며 이는 식이섬 유의 콜레스테롤 저 하효과에 그 발효산물인 propionatee} 일부 관여함을 주장하였다. 그럼에도 불구하고, 콜레스테롤 합 성 은 발효가능한 수용성 식 이 섬유 또는 propionate를 섭 취 한 실험동물에서 감소되지 않았고 증가되는 것으로 반복적으 로 보였다. Levrat 등(54)은 propionic .
이상의 결과는 수용성 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 수용성 식이섬유의 대장 발효가 대장을 자극함으로써 내인성 호르몬의 변화를 통해서 나타 나거 나 대 장내 발효산물인 actetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있을 것이다. 단쇄 지방산의 CYP7A1 발현에 미치는 작용은 acetate와 pro- pionate가 butyrate보다 큼을 알 수 있었다.
단쇄지방산 처리에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유 전자의 발현 정도를 측정 하기 위해서 actetate, propionate 및 butyrate를 각각 1 mM, 24시간 배양한 결과, 모든 단쇄지방 산이 CYP7A1의 발현을 증가시 켰다. Acetate와 propionate 는 유사한 효과를 나타내 어 대 조군에 비하여 1.
이처럼 transient trans- fection을 하지 않은 HepG2 세포에서 생리적 조절자로 알려진 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine ° ] CYP7A1의 발현을 모두 증가시킨다는 결과는 본 연구에서 처음으로 규명 하며, rat gene and/or human gene 발현 이 다르게 조절 됨을 제안한다. 단쇄지방산에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위해서 actetate, propionate 및 butyfate를 각각 1 mM 농도로 24시간 동안 배 양한 결과, 모든 단쇄지방산이 CYF7A1의 발현을 증가시 켰다. Acetate와 propionate는 유사한 효과를 나타내어 대조군에 비하여 1.
본 연구자들은 앞선 연구에서 발효성의 보리 B-glucan의 급여가 흰쥐의 혈 청 콜레스테롤을 저하시키며, 이는 분변으로의 담즙산 배설 증가와 간에서의 CYP7A1 활성과 발현 증가에 기 인함을 밝 혔다(21). 따라서 본 연구자는 식이섬유의 결장발효로 생성된 단쇄지방산이 간 콜레스테롤 합성 조절이 아니라 주로 담즙산 생합성과 관련한 CYP7A1의 전사 조절을 통해서 혈 청 콜레스테롤을 저 하시 키는 것으로 확신했으며 , 본 실험 의 결과가 이것을 지지한다. 또한 본 연구에서 사용된 단쇄지방 산의 농도(1 mM)는 0, 0.
따라서 본 연구자는 식이섬유의 결장발효로 생성된 단쇄지방산이 간 콜레스테롤 합성 조절이 아니라 주로 담즙산 생합성과 관련한 CYP7A1의 전사 조절을 통해서 혈 청 콜레스테롤을 저 하시 키는 것으로 확신했으며 , 본 실험 의 결과가 이것을 지지한다. 또한 본 연구에서 사용된 단쇄지방 산의 농도(1 mM)는 0, 0.5, 1, 2.5, 5 mM의 농도에서 측정한 예비실험의 결과로써 결정되 었으며, 이용가능한 자료(26, 58,59)로부터 생리적 수준의 농도임을 알 수 있다. 이상의 결과 로써, 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 발효산물인 단쇄지 방산 acetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담 즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있다.
이상의 결과 로써, 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 발효산물인 단쇄지 방산 acetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담 즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있다. 또한, acetate 와 propionate의 작용이 butyrate보다는 큼을 알 수 있었다.
배양시간을 24시간에서 48시간으로 연장시켰을 경우에 발현이 더 이상 증가하지는 않았다. 또한, propionate의 처리시 HepG2 cell에서의 CYP7A1 gene의 발현은 acetate 의 경우와 유사하였다, 즉, 0에서 1 mM의 농도에서는 dose- dependant하■게 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 약간의 상승 경향을 보였으나 유의 성 은 나타나지 않았다(Fig. 3, Propionate). 배양시간을 24시간에서 48시 간으로 연장시 켰을 경우의 발현정도는 최고농도에서 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 보였다.
Semi-quantitative RT-PCR 기법을 이용하여 조사한 호르몬 모두에서 CYP7A1 발현이 증가하였으며, 그 효과는 dexamethasone 처리 시 에 가장 컸다. 본 연구의 결과는 사람 의 간세포에서 CYP7A1 mRNA 발현이 HepG2 transient transfection system 내의 rat gene and/or human gene과는 다르게 조절됨을 제안한다.
1). 이러한 결과는 배양시간을 48, 72시간으로 각각 연장시켰을 경우에도 0.1 J1M에서 가장 발 현이 증가하였으며 그 이상의 농도에서는 대조구보다 상승 하는 유사한 경향을 보였다(Fig. 1). Dexamethasone에 의한 HepG2 cell에서의 CYP7A1 gene의 발현 정도를 살펴본 결과는 24시간 배양시 에 0.
5, 5 mM의 농도에서 측정한 예비실험의 결과로써 결정되 었으며, 이용가능한 자료(26, 58,59)로부터 생리적 수준의 농도임을 알 수 있다. 이상의 결과 로써, 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 발효산물인 단쇄지 방산 acetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담 즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있다. 또한, acetate 와 propionate의 작용이 butyrate보다는 큼을 알 수 있었다.
호르몬에 의한 HepG2 세포에서의 CYP7A1 유전자의 발 현 정도를 측정 하기 위하여 insulin, dexamethasone 및 triiodothyronine-8- 0.1 11M의 농도로 24시간 배양한 결과, de- xamethasone에서 가장 높은 173%의 증가를 나타내었다. 그 다음으로 insulin에서 150%, triiodothyronine에서 141%의 증가를 나타내었다(Fig.
후속연구
5배의 증 가를 보였다. 이상의 결과는 수용성 식이섬유 섭취시 나타나는 콜레스테롤 저하 효과는 수용성 식이섬유의 대장 발효가 대장을 자극함으로써 내인성 호르몬의 변화를 통해서 나타 나거 나 대 장내 발효산물인 actetate, propionate 및 butyrate 등이 흡수되어 간에서의 CYP7A1의 up-regulation에 의한 담즙산 배설증가에 따른 결과로 설명할 수 있을 것이다. 단쇄 지방산의 CYP7A1 발현에 미치는 작용은 acetate와 pro- pionate가 butyrate보다 큼을 알 수 있었다.
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