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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 미생물적 방법에 의하여 생산된 DFA Ⅳ의 동물모델을 활용한 in vivo 시스템에서 장내 발효 가능성과 프라바이오틱으로서의 효과를 확인하고 장건강 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다. DFA Ⅳ 식이를 흰쥐에게 공급하고 장내의 pH, 소화기관의 길이와 내용물의 양, 단쇄지방산 및 젖산 생성에 미치는 영향을 관찰하여 식이로 공급된 DFA Ⅳ에 의한 장내환경 개선 효과를 살펴보았다.
- 본 연구는 식이로 공급된 DFA Ⅳ가 장내의 pH, 소화 기관이 길이와 내용물의 양, 단쇄지방산 및 젖산 생성에 미치는 영향을 조사하여 DFA Ⅳ의 장내환경 개선 효과를 살펴봄으로써 DFA Ⅳ의 프리바이오틱 소재로서의 활용 가능성을 조사하였다.
제안 방법
- 따라서, 본 연구에서는 미생물적 방법에 의하여 생산된 DFA Ⅳ의 동물모델을 활용한 in vivo 시스템에서 장내 발효 가능성과 프라바이오틱으로서의 효과를 확인하고 장건강 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다. DFA Ⅳ 식이를 흰쥐에게 공급하고 장내의 pH, 소화기관의 길이와 내용물의 양, 단쇄지방산 및 젖산 생성에 미치는 영향을 관찰하여 식이로 공급된 DFA Ⅳ에 의한 장내환경 개선 효과를 살펴보았다.
- 맹장과 대장에서 각각 내용물 0.5g을 취하여 10배의 증류수로 희석하고 4oC, 3000rpm에서 10분 동안 원심분리 (5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)한 후 상층액을 취하여 pH meter (model 725p, Istek, Seoul, Korea)를 사용하여 pH를 측정하였다[9].
- 구체적으로, 맹장과 장 내용물에서 단쇄지방산과 젖산의 정량분석을 위하여 회수한 장 내용물에 phosphoric acid를 가하여 최종농도 10% (w/v)로 조정한 후 10000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액은 HP-FFAP (0.25 m, 25 m X 0.2 mm) column이 장착된 gas chromatography (Hewlett Packard Model 5890 Series II, USA)를 이용하였으며, 칼럼 온도는 70oC 에서 1분 유지한 후, 200oC 까지 15oC /min 속도로 증가시킨 다음, 200oC 에서 5분으로 정체되도록 설정하였다.
- 소장, 맹장, 대장에서 각각의 장 길이와 장 무게를 측정하였다 (Table 2). 소장의 길이와 무게는 대조군과 실험군간 차이가 없었다.
- 실험기간 후 12시간 동안 절식시킨 상태에서 ethyl ether로 마취한 후 간문맥에서 채혈하여 희생하고 간과 신장, 소장, 맹장, 대장을 적출하였다. 소장, 맹장, 대장을 분리하여 중량을 측정하였고, 각각 장의 내용물을 분리한 후 50 mM phosphate 완충용액 (pH 7.0)으로 세척하고 여분의 수분을 충분히 제거한 뒤 장벽의 중량을 측정하였다.
- 식이 DFA Ⅳ 공급이 맹장 및 대장에서의 단쇄지방산과 젖산 생성에 미치는 영향을 비교하였다 (Fig. 3). DFA군에서 맹장 내용물의 아세트산, 부티르산, 젖산 함량이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.
- 실험 기간 동안 식이는 하루 3시간씩 2회, 물은 제한 없이 공급하였다. 식이섭취량은 매일 일정한 시간 잔량을 측정하였으며, 체중은 1주일에 한 번 씩 측정하였다.
- 실험기간 후 12시간 동안 절식시킨 상태에서 ethyl ether로 마취한 후 간문맥에서 채혈하여 희생하고 간과 신장, 소장, 맹장, 대장을 적출하였다. 소장, 맹장, 대장을 분리하여 중량을 측정하였고, 각각 장의 내용물을 분리한 후 50 mM phosphate 완충용액 (pH 7.
- 실험동물은 각 군에 6마리씩 나누어 3주간 사육하였으며, 3주차에는 한 마리씩 분리하여 1주간 대사 cage에서 사육하였다. 실험 기간 동안 식이는 하루 3시간씩 2회, 물은 제한 없이 공급하였다.
- 장내 단쇄지방산도 장내의 발효를 나타내는 지표이지만, 신속히 체내로 흡수되는 관계로 장내 발효 정도를 나타내기 위해서 장내 pH를 측정하였다. 소장 내용물의 pH는 대조군과 DFA군에서 모두 약산성으로 군들 간의 유의적 차이는 없었다.
대상 데이터
- 7주령 Sprague-Dawley 종 숫컷 흰쥐를 중앙실험동물사에서 구입하여 1주일간 적응시킨 후 DFA Ⅳ를 0% 또는 1% 함유한 실험식이 (w/w)를 공급하여 각각 대조군과 DFA군으로 하였다 (Table 1). 시험물질로 사용한 DFA Ⅳ는 백색의 단맛을 가진 결정성 분말로 ㈜리얼바이오텍 (Kongju, Korea)에서 제공받아 사용하였다.
- 7주령 Sprague-Dawley 종 숫컷 흰쥐를 중앙실험동물사에서 구입하여 1주일간 적응시킨 후 DFA Ⅳ를 0% 또는 1% 함유한 실험식이 (w/w)를 공급하여 각각 대조군과 DFA군으로 하였다 (Table 1). 시험물질로 사용한 DFA Ⅳ는 백색의 단맛을 가진 결정성 분말로 ㈜리얼바이오텍 (Kongju, Korea)에서 제공받아 사용하였다.
데이터처리
- Values are mean±S.D. *p<0.05, Control versus DFA by Independent samples t-test.
- 실험결과는 평균과 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었고, Statistical Analysis System (SAS) program을 이용하여 Independent samples t-test 분석을 통해 실험군 간의 차이를 α=0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 단쇄지방산 및 젖산의 정량분석은 선행연구에서 사용된 방법에 따라 실시하였다[9]. 구체적으로, 맹장과 장 내용물에서 단쇄지방산과 젖산의 정량분석을 위하여 회수한 장 내용물에 phosphoric acid를 가하여 최종농도 10% (w/v)로 조정한 후 10000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
성능/효과
- 1) 식이섭취량과 체중, 간과 신장의 무게는 실험군간 차이가 나타나지 않았다.
- 2) 소장의 길이 및 조직 무게, 대장 조직 및 대장벽의 무게는 실험군간 차이를 보이지 않았으나, 맹장의 무게는 대조군에 비해 DFA군에서 맹장 무게는 67%, 맹장벽의 무게는 73% 증가하여 DFA Ⅳ가 소장에서 소화되지 않고 맹장에서 장내미생물의 생육을 촉진하였음을 시사하였다.
- 3) 식이 DFA Ⅳ 공급에 의해 맹장 내 아세트산, 프로피온산, 젖산 함량이 유의적으로 증가하여 DFA Ⅳ가 장내미생물에 의해 발효되어 단쇄지방산과 유기산으로 대사됨을 보여주었다.
- 4) 맹장 및 대장의 pH는 DFA Ⅳ 식이를 섭취한 실험동물에서 유의적으로 낮게 나타나 DFA Ⅳ는 장내 환경을 산성화시켰다.
- DFA군에서 맹장 내용물의 아세트산, 부티르산, 젖산 함량이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. DFA군에서 대조군에 비해 맹장 내용물의 아세트산은 1.6배, 부티르산은 3.2배, 젖산 함량은 1.5배로 높았고 젖산 함량은 두 군들간 차이를 보이지 않았다. 대장 내용물의 단쇄 지방산과 젖산은 실험군간 유의적인 차이가 없었다.
- 3). DFA군에서 맹장 내용물의 아세트산, 부티르산, 젖산 함량이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. DFA군에서 대조군에 비해 맹장 내용물의 아세트산은 1.
- 소장의 길이와 무게는 대조군과 실험군간 차이가 없었다. 그러나 맹장의 무게는 DFA군에서 유의적으로 증가하여 대조군에 비해 맹장조직은 67%, 맹장벽은 73% 높았다. 대장의 무게는 실험군간 유의적인 차이가 없었다.
- 2). 대조군에 비해 DFA Ⅳ를 섭취한 실험동물에서 체중과 간, 신장의 무게가 약간 감소하는 경향을 나타내었는데 이는 난소화성의 DFA Ⅳ 공급에 적응하는 과정에서 나타난 설사에 기인한 것으로 사료되며, 통계적으로는 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 또한 간과 신장에서 DFA Ⅳ섭취에 따른 육안으로 확인되는 차이는 없었다.
- 이는 소화되지 않은 다당류들이 대장 미생물의 생육 조건을 호전시킨 결과로 볼 수 있다. 따라서 본 연구 결과 식이 DFA Ⅳ 공급에 의해 대장 내용물이 증가된 것은 DFA Ⅳ가 장내에서 미생물 증식을 유도한 결과라고 사료된다. 실제로 동물실험에서 DFA Ⅲ 섭취에 의해 장내 젖산균 증식이 증가하는 등 미생물의 증식이 촉진되었다고 보고되었다 [5,12,14].
- 2% DFA Ⅳ를 생성하였다. 따라서, 고농도의 DFA Ⅳ가 장 관련 부작용을 야기할 수 있으며 DFA Ⅳ생산이 1~2% 기질농도에서 진행된다는 점을 고려하여 본 연구에서는 DFA Ⅳ의 사용 농도를 식이의 1%, 사용 기간을 3주로 특정지었다.
- 선행 연구에서 DFA Ⅳ의 기질이 되는 다당류인 레반을 쥐에게 공급 시 식이의 10% 농도에서 장내 발효로 인한 체중 감소 또는 장기 무게 감소는 발견되지 않았다 [9]. 또한 본 실험에 사용한 DFA Ⅳ의 단회 및 4주간 반복 경구투여 독성시험에서는 단회 경구투여 시 특기할만한 임상증상이 관찰되지 않았고, LD50치는 5000mg/kg 이상일 것으로 판단되었으며, 2000 mg/kg의 용량에서 명백한 독성학적 변화가 관찰되지 않았다 [4]. 현재까지, DFAs 중에서 DFA III와 DFA Ⅳ는 일본에서 생산되고 있으며, 국내에서는 DFA Ⅳ를 효소적 방법으로 생산하고 있다.
- 본 실험 결과에 나타난 장내용물 pH의 저하는 DFA Ⅳ가 장내 미생물에 의해 발효되어 장내 미생물의 생육이 활발하게 진행된다는 것을 의미하며, 특히 단쇄지방 산과 유기산 생성능이 있는 장내 미생물의 생육이 왕성하게 촉진되어 장내 환경을 산성화하는 것을 의미한다 [25].
- 본 연구 결과 단쇄지방산은 맹장에 비해 대장 내용물에서 감소한 반면, 젖산의 함량은 대장 내용물에서 증가하였는데 이는 젖산보다 단쇄지방산의 체내 흡수율이 높은 것에서 기인한다. 또한 대장에서의 단쇄지방산과 젖산 함량이 실험군간 차이를 보이지 않는 것은 이당류인 DFA Ⅳ는 분자량이 작기 때문에 빠른 속도로 발효되었고, 이렇게 단시간에 생성된 단쇄지방산은 이미 맹장에서 대부분 흡수되었기 때문인 것으로 생각된다.
- 본 연구 결과 부티르산 함량은 대조군에 비해 DFA군이 맹장에서 3.2배 높은 결과를 보여 식이 DFA Ⅳ가 맹장에서 부티르산 생성을 크게 증가시켰다. 이러한 결과로부터 DFA Ⅳ는 체내에서 장 환경 개선 및 대장암 예방, 면역증강 및 무기질 흡수 증진 용도로 사용이 가능할 것으로 판단된다.
- DFA Ⅳ의 화학적 합성법은 낮은 반응선택성과 복잡한 분리정제과정이 요구되어 경제적인 생산수단이 되기 어려운 반면 미생물 효소를 이용한 생성공정은 기질에 대한 선택성이 높고 비교적 분리공정이 용이하여 DFA Ⅳ 생산기술로 효과적이다. 본 연구에서 사용한 DFA Ⅳ는 레반을 기질로 사용하여 미생물인 Arthrobacter에서 유래된 levan fructotransferase의 유전자를 사용하여 생산하였고[3], 동물을 이용한 독성시험에서 DFA Ⅳ는 독성학적인 변화가 없는 안전한 물질로 밝혀졌다[4]. DFA Ⅳ는 체내에서 소화효소에 의해 분해될 수 없으므로 소장에서 흡수되지 않고 대장으로 이행하므로 장내에서의 발효가능성을 보여준다[2,5].
- 생성된 젖산은 다시 효소적 작용에 따라 다른 대사산물로 변화되는데, 젖산은 주로 아세트산, 부티르산 같은 단쇄지방산으로 대사된다 [22]. 본 연구에서 젖산 함량은 맹장 내용물에서 대조군에 비해 DFA군이 1.5배 높았는데, 이러한 결과는 DFA Ⅳ 공급이 장내에서 젖산균의 증식을 촉진한 결과임을 추측해 볼 수 있다.
- 2배 높은 결과를 보여 식이 DFA Ⅳ가 맹장에서 부티르산 생성을 크게 증가시켰다. 이러한 결과로부터 DFA Ⅳ는 체내에서 장 환경 개선 및 대장암 예방, 면역증강 및 무기질 흡수 증진 용도로 사용이 가능할 것으로 판단된다.
- 이상의 결과에 의하면 DFA Ⅳ 함유 식이는 장에서 단쇄지방산과 유기산 생성을 촉진하여 장의 pH를 산성화하여 장내환경을 개선하는데 기여하였다. 결론적으로 DFA Ⅳ는 프리바이오틱으로서 작용함으로써 장 건강에 유익한 기능성 식품소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 장 내용물의 pH는 DFA군에서 각각 6.19±0.15 (맹장), 6.48±0.36 (대장)으로 대조군의 80% (맹장), 82% (대장) 수준으로 감소하여, 대조군의 맹장과 대장이 알카리성 환경인 것에 비해 DFA Ⅳ 섭취에 의해 흰쥐의 장내환경이 산성화 되었다 (Fig. 4).
- 이러한 장내미생물들은 맹장과 대장에서 식이섬유를 발효시켜 유기산과 단쇄지방산을 생성하며, 생성되는 유기산 및 단쇄지방산의 양이나 비율은 식이섬유의 생리화학적 성질, 즉 식이섬유를 구성하는 단당류의 종류, 결합의 종류, 중합도, 용해도 등의 영향을 받는다 [1]. 장내 미생물 발효에 의하여 생성되는 주요 단쇄지방산에는 아세트산, 프로피온산, 부티르산 등이 있으며 [6], 본 실험 결과에서도 아세트산, 프로피온산, 부티르산이 주요 단쇄지방산으로 확인되었고, 주요 유기산으로 젖산이 검출되었다 (Fig. 3).
후속연구
- 이상의 결과에 의하면 DFA Ⅳ 함유 식이는 장에서 단쇄지방산과 유기산 생성을 촉진하여 장의 pH를 산성화하여 장내환경을 개선하는데 기여하였다. 결론적으로 DFA Ⅳ는 프리바이오틱으로서 작용함으로써 장 건강에 유익한 기능성 식품소재로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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