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문제 정의
- 한의에서는 통경약, 진통제, 건위약, 이뇨제, 정혈제 그 외에도 항암효과 등의 효능이 알려져 왔으나, 삼릉의 미백 작용에 대한 연구 결과는 없었다. 본 연구에서는 삼릉 추출물의 항산화 효과와 멜라닌 생성 억제 효과를 연구하여 미백화장품으로 응용하고자 하였다.
- 삼릉 추출물의 항산화효과 및 B16 melanoma 세포에서의 멜라닌 생성 저해 효과를 연구하였다. 삼릉추출물의 DPPH 와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의 존적 으로 소거효과를 나타냈으며 , 각각 IC50 값이 638 pg/mL (DPPH), 21.
제안 방법
- MTT (3-4, 5-dimethythiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoli- um bromide) 정량은 Mosmann[ll]의 방법을 변형하여 실시하였다. B16 melanoma 세포를 1 x 10° cells/well 농도로 24 well plate에 분주한 세포에 삼릉 추출물을 투여하고 24 h 동안 배양하였다.
- 5 min, 72 ℃ 1 min, 28 cycles로 반응시켰다. PCR에 의하여 생성된 산물을 1.5% agarose gel에서 전기 영동하여 tyrosinase, TRP-1, TRP- 2, 8-actin의 유전자 발현을 확인하였다.
- 5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany) 로 37 ℃ 에서 60 min, 93 ℃ 에서 5 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, 6-actin을 증폭하기 위하여 1 μL cDNA, 0.5 uM의 5, 과 3, primer, 10 X buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 μM dNTP, 25 mM MgCh, 2.5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, GermanyX 섞고 distilled water로 전체를 25 应로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR증폭은 94℃ 0.
- 이를 3% skim milk가 함유된 tris 완충용액에서 tyrosinase (sc-7833), TRP1 (sc-10443), TRP-2 (sc-10452), actin (sc-1616) 항체와 각각 반응시킨 후, alkaline phosphatase가 결합된 항체를 가한 후 5-bromo-4- chloro-3-indoly-1 -phophate/nitro blue tetrazolium (BCIP/ NBT)을 가하여 발색시켰다. Western blot 결과는 Calibrated densitometer GS-800 (Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 이러한 결과가 tyrosinase 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 tyrosinase 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다. 또한 TRP-1, TRP-2 발현에 대한 western blot도 함께 수행하였다(Figure 6). 그 결과 삼릉추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났다.
- 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH (in 10% DMSO) 200 μL 를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준품으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(1 X 104 cells)에서의 멜라닌 생성 량을 비교하였다.
- 멜라닌 표준품으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(1 X 104 cells)에서의 멜라닌 생성 량을 비교하였다.
- 의 뿌리줄기로 중국 북경대학에서 제공받아 사용하였다. 삼릉 100 g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로용해하여 사용하였다.
- 효소이다. 삼릉추출물을 처리한 세포를 수집하여 용해시킨 후 0.2% L-DOPA가 첨가된 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 넣고 37℃ 에서 배양한 후 흡광도를 측정하였다. Figure 5의 결과와 같이 삼릉 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성이 저해되었으며, 특히 100 μg/mL 농도에서 31% 가량의 저해 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 삼릉추출물의 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 삼릉 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다(Figure 7).
- 삼릉추출물의 세포독성측정과 더불어 실험에 사용될 농도 범위결정을 위해서 MTT assay를 시행하였다. B16 melanoma 세포에 내한 삼릉추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 삼릉추출물은 125 μg/mL 이하의 농도로 처리 시 세포 생존율이 90% 기상으로 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Figure 3).
- 또한 이에 따른 다양한 종류의 식물성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되어 있다[16, 17]. 삼릉추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다. 삼릉 추출물은 투여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타냈다(Figure 1).
- 삼릉추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 양을 측정하였다. 세포에 삼릉추출물을 30, 3), 100 ug/mL의 농도로 처리하고 48 h 종안 배양하였다.
- 세포에 삼릉추출물을 30, 3), 100 ug/mL의 농도로 처리하고 48 h 종안 배양하였다. 세포를 수집하여 펠라닌 양을 측정한 결과, 삼릉추출물 처리군 모두가 농도에 비례하여 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다(Figiue 4).
- 5%로 나타났다. 양성 대조군으로는 항산화 작용이 있는 것으로 알려진 butylated hydroxytoluene (BHT) 를 이용하여 삼릉추출물의 항산화 효과와 비교하였다. 그 결과 BHT는 647 *g/mL에서 삼릉추출물은 638 pg/mL 농도에서 50%의 DPPH radical을 소거하였다.
- 여기서 얻은 상층액을 12% SDS-PAGE 를 이용해 전기영동하고 이를 nitrocellulose membrane으로 이전시켰다. 이를 3% skim milk가 함유된 tris 완충용액에서 tyrosinase (sc-7833), TRP1 (sc-10443), TRP-2 (sc-10452), actin (sc-1616) 항체와 각각 반응시킨 후, alkaline phosphatase가 결합된 항체를 가한 후 5-bromo-4- chloro-3-indoly-1 -phophate/nitro blue tetrazolium (BCIP/ NBT)을 가하여 발색시켰다. Western blot 결과는 Calibrated densitometer GS-800 (Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
- B16F1은 쥐의 melanoma 세포주로 서울대학교 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 5% fetal bovine serum (Bio Whittaker, USA), 1% penicillinstreptomycin (Gibco BRL, USA), 200 pM a -MSH (Sigma, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 구입한 세포는 5% fetal bovine serum (Bio Whittaker, USA), 1% penicillinstreptomycin (Gibco BRL, USA), 200 pM a -MSH (Sigma, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, actin 항체는 Santa Cruz Biotechlology (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 5% fetal bovine serum (Bio Whittaker, USA), 1% penicillinstreptomycin (Gibco BRL, USA), 200 pM a -MSH (Sigma, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, actin 항체는 Santa Cruz Biotechlology (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- rhizoma)은 Scirpus flu- viatilis G.의 뿌리줄기로 중국 북경대학에서 제공받아 사용하였다. 삼릉 100 g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다.
- 삼릉 100 g을 분쇄하여 70% 에탄올 1 L로 환류하면서 3 h씩 2회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로용해하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균 土 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Student, s t-test로 하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- rhizoma in the NBT assay. Superoxide radical was generated by a xanthine/xantliine oxidase system and measured by NBT reduction method. The data were expressed as mean values (土 S.
- rlisorm for 24 h. The cell viability was measured by the MTT method. Data are normalized by taking 100% as a viability of non-treated cells.
- Xanthinexanthine oxidase 반응에서 형성된 superoxide radical 소거효과는 'litroblue tetrazolium (NBT) 방법에 의해 측정하였다[10]. 0.
- 멜라닌 정량은 Yasunobu[12] 방법을 사용하였다. 6 well plate에 3x10 cells/well로 세포를 '분주하여 배 양한 후 시료를 처리하고 48 h 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
- 세포 내 tyrosinase 활성 측정법은 Pawelek과 Pomerantz [13, 14] 방법을 사용하였다. 6 well plate에 5 乂 105 cells/ well로 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다.
- 감소시켰다. 이러한 결과가 tyrosinase 발현과도 연관성이 있는지를 확인하기 위해 tyrosinase 항체를 이용하여 western blot을 수행하였다. 또한 TRP-1, TRP-2 발현에 대한 western blot도 함께 수행하였다(Figure 6).
- 항산화 활성은 l, L-diphenyl-2-picryUiydrazyl (DPPH, Aldrich, USA)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하는 Blois법 [9]을 활용하였다. 0.
성능/효과
- B16 melanoma 세포에 내한 삼릉추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 삼릉추출물은 125 μg/mL 이하의 농도로 처리 시 세포 생존율이 90% 기상으로 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되었다(Figure 3).
- ZL 결과 삼릉추출물은 투여 농도 의존적으로 superoxide radical 소거작용을 나타내 10, 100, 1000 pg/ ml의 농도로 처리한 경우 각 superoxide radical 소거능은 37%, 84.2%, 91.9%로 나타났다. I*은 21.
- 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 삼릉 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다(Figure 7). 이것은 삼릉추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 tyrosinase를 직접적으로 저해하는 저해제로서의 기전이 아니라 멜라닌 형성세포의 멜라닌 생성에 관여하는 세포 신호 전달이나 유전자 수준에서 조절되는 것을 의미하며 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 또한 TRP-1, TRP-2 발현에 대한 western blot도 함께 수행하였다(Figure 6). 그 결과 삼릉추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났다. 하지만 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다.
- B16 melanoma 세포주에서는 100 eg/mL 농도를 처리한 실험군에서 멜라닌 생합성이 27% 감소되었다. 또한 세포내에 존재하는 tyrosinase 활성을 31% 저해하였으며, tyrosinase 단백질 발현량은 36% 감소, TRP-1도 30% 감소시켰다. 하지만 TRP-2에 대한 저해 효과는 나타나지 않았다.
- 하지만 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다. 또한 이에 대한 density를 측정한 결과, tyrosinase의 발현이 100 /7g/mL 농도에서 36%, TRPT의 발현은 30% 가량 저해됨을 확인하였다.
- 하지만 TRP-2에 대한 저해 효과는 나타나지 않았다. 또한, RT- PCR을 이용하여 유전자 발현을 평가한 결과 tyrosinase, TRP-1 의 mRNA 발현은 감소하였으나 TRP-2에 대한 유전자 발현은 영향이 없었다. 삼릉 추출물은 항산화 효과와 함께 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현 조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 감소 효과를 나타내는 것으로 보인다.
- 생성 저해 효과를 연구하였다. 삼릉추출물의 DPPH 와 superoxide radical 소거효과는 처리농도가 증가함에 따라 농도 의 존적 으로 소거효과를 나타냈으며 , 각각 IC50 값이 638 pg/mL (DPPH), 21.7 μg/mL (superoxide radi- cal)로 우수한 항산화 효과를 나타내었다. B16 melanoma 세포주에서는 100 eg/mL 농도를 처리한 실험군에서 멜라닌 생합성이 27% 감소되었다.
- 세포에 삼릉추출물을 30, 3), 100 ug/mL의 농도로 처리하고 48 h 종안 배양하였다. 세포를 수집하여 펠라닌 양을 측정한 결과, 삼릉추출물 처리군 모두가 농도에 비례하여 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였다(Figiue 4). 양성 대조군으로 사용한 arbutine 2 μg/mL에서 38% 멜라닌 감소 효과를 나타냈으나, 삼릉추출물은 arbutin보다 낮은 100 μg/mL 농도에서 27% 가량의 멜라닌 감소 효과를 나타냈다.
후속연구
- 삼릉 추출물은 항산화 효과와 함께 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질과 유전자의 발현 조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 감소 효과를 나타내는 것으로 보인다. 따라서 삼릉추출물은 우수한 미백 소재로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 결과 삼릉 추출물은 tyrosinase, TRP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났지만 TRP-2의 발현량에는 영향을 미치지 않았다(Figure 7). 이것은 삼릉추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 tyrosinase를 직접적으로 저해하는 저해제로서의 기전이 아니라 멜라닌 형성세포의 멜라닌 생성에 관여하는 세포 신호 전달이나 유전자 수준에서 조절되는 것을 의미하며 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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