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문제 정의
- 산화적 스트레스로 인해 DNA를 손상시켜 세포나 기관의 변형으로 인해 암, 당뇨와 같은 질병을 유발시킨다고 보고된 바 있다[7, 12]. 본 연구는 노화의 원인 중 한가지인 ROS 생성 억제효과와 melanin 합성 촉진 효과를 조사하여 바나나 껍질이 흑모 촉진제로서 적용 가능한지를 조사하였다. Melanocyte의 종류 중 하나인 B16F1 cell을 이용하여 독성이 없는 농도에서 진행되었다.
- 본 연구에서는 멜라닌 생성을 촉진시키는 양성대조군으로 α-MSH와 IBMX가 특히 TRP-2의 발현을 증가시키 는 것을 관찰하였다.
- Melanin은 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)가 tyrosinase 효소의 존재 하에 DOPA quinone로 합성된다. 이 실험은 in vitro에서 DOPA 산화에 관련된 melanin 생성에 미치는 MPEE의 영향을 조사하였다. 먼저 melanin 생성 증가를 평가하기 위해 음성 대조군 으로 0.
- 뿐만 아니라 바나나 껍질(Musaparadisiaca peel)에 존재하는 black sigatoka는 식물의 잎에서 자낭균(mycomosphaerella fijiensis)에 의해 생성되는 질환으로 검은 잎 줄무늬로 알려져 있으며 melanin을 생성한다는 연구가 보고 된 바 있다[4]. 이를 바탕으로 본 연구의 목적은 바나나 에탄올 추출물(MPEE)이 항산화 활성과 백발화와 관련된 melanin 합성 촉진 효과를 규명하고자 하는 것이다.
제안 방법
- B16F1 세포를 이용하여 tyrosinase의 존재 하에 DOPA를 자극시켜 melanin 함량을 측정 하였다. Fig.
- Brand-Williams [10] 실험방법을 변형하여 MPEE의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 3A에서 보는 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 MPEE는 최고 농도인 64 μg/ml에서 10%의 독성 효과가 있었고, 90% 이상의 세포가 생존하였다. MPEE가 세포 내의 H2O2 소거능력을 측정하기 위하여 DCFHDA가 H2O2와 반응하게 되면 DCF를 생성하며 형광을 띄게 얼마나 소거하는지를 확인하는 DCFH-DA 실험을 수행하였 다. Fig.
- Tyrosinase는 모발의 멜라닌을 형성하는 효소로, 멜라닌 합성 과정에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여한다. MPEE의 tyrosinase의 활성 효능을 조사하기 위해 tyrosinase activity 실험을 수행하였다. 먼저 실험의 정확성을 평가하기 위하여 음성 대조군으로 0.
- 19 μg/ml의 폴리페놀이 함유되어 있다. MPEE의 항산화 효능을 검증하기 위해 DPPH radical 소거능과 환원력에 대한 실험을 수행하였다. DPPH radical 소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH radical의 흡광도 변화의 정도를 통해 산화 억제 정도를 예측할 수 있다.
- Melanin 생성 신호 전달 기전과 관련된 tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2)와 항 산화 효소인 catalase와 superoxide dismutase (SOD)-2, SOD-3의 단백질 발현을 조사하였다.
- MPEE의 최고 농도인 64 μg/ml에서는 76%의 소거능이 나타났다. Potassium ferricyanide와 ferric chloride를 이용하여 MPEE의 환원력을 조사하였다. Fig.
- Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다.
- 10 μg의 세포 용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -1, anti-TRP -2, anti-SOD -3, anti-catalase, anti-beta-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA))를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 이전 연구에서도 바나나 껍질은 멜라닌 생성 합성 과정에 관여하는 tyrosine hydroxylase 효소의 활성을 촉진한다고 보고되었다[21]. 다음으로 MPEE의 멜라닌 합성 기전에 관여하는 효소 활성 증가 효과를 보다 자세히 조사하기 위해 Western blot을 이용하여 단백질 발현 수준을 조사하였다. 본 연구에서는 멜라닌 생성을 촉진시키는 양성대조군으로 α-MSH와 IBMX가 특히 TRP-2의 발현을 증가시키 는 것을 관찰하였다.
- melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(104 cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 바나나껍질 에탄올 추출물(MPEE)로부터 항산화 효능을 나타내는 MPEE의 총 폴리페놀함량을 측정하였다. Fig.
- 시료 내 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu 방법[34]을 변형하여 Gallic acid를 이용해 표준 물질로 사용하였다. 분광 광도계의 측정 가능한 범위 안에서 시료를 희석하여 사용하였다.
- Behring,Germany)를 이용 하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 L-DOPA 산화에 의한 melanin 생성력을 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
- 여기에 음성대조군인 vitamin C 1000 μl와 MPEE를 시험농도로 1 시간 동안 처리하였다.
- 세포 내에서 과산화수소는 DCFH- DA와 반응하여 형광을 띄는 DCF를 생성한다. 이를 multi-detection microplate reader (SynergyHtx)를 이용하여 excitation: 488 nm, emission: 530 nm 조건에서 형광정도를 측정하였다.
대상 데이터
- α-MSH, Imatinib mesylate (IMAT), IBMX, MTT reagent와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하였다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. α-MSH, Imatinib mesylate (IMAT), IBMX, MTT reagent와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
- 본 연구는 노화의 원인 중 한가지인 ROS 생성 억제효과와 melanin 합성 촉진 효과를 조사하여 바나나 껍질이 흑모 촉진제로서 적용 가능한지를 조사하였다. Melanocyte의 종류 중 하나인 B16F1 cell을 이용하여 독성이 없는 농도에서 진행되었다. 먼저, 항산화 활성에 영향을 주는 폴리페놀의 양을 측정하였고, MPEE의 ROS 소거능을 조사한 결과 MPEE은 DPPH radical assay와 reducing power test에서 양성 대조군으로 사 용한 vitamin C보다 큰 항산화 효과를 나타내었다.
- 세척·건조된 바나나껍질을 믹서기로 분쇄하여 분말로 제조 후 60 l 에탄올에 3일간 추출하고 여과하였다. 각 여과된 여액을 감압 농축하고 동결 건조하여 300 g의 분말 형태의 바나나껍질 에탄올 추출물(Musa paradisiaca peel ethanolic extract, MPEE)을 획득하였다. 바나나 껍질 에탄올 추출물의 수득률은 5%로 나타났다.
- 이 실험은 in vitro에서 DOPA 산화에 관련된 melanin 생성에 미치는 MPEE의 영향을 조사하였다. 먼저 melanin 생성 증가를 평가하기 위해 음성 대조군 으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. Fig.
- MPEE의 tyrosinase의 활성 효능을 조사하기 위해 tyrosinase activity 실험을 수행하였다. 먼저 실험의 정확성을 평가하기 위하여 음성 대조군으로 0.01% vitamin C와 0.02% arbutin을 사용하였다. Fig.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)로 부터 구입하였다.
- 양성 대조군으로 vitamin C 100 μl를 사용하였다.
- 바나나 껍질 에탄올 추출물의 수득률은 5%로 나타났다. 제조된 분말형태의 시료들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 시험 농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
- Level of significance was identified statistically (**p<0.01, ***p<0.001) using Student’s t test.
- Level of significance was identified statistically using Student’s t test.
- 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- B16F1 세포가 생존에 미치는 MPEE의 농도를 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig.
- Hansen [9]의 방법에 따라 MPEE의 세포독성을 측정하였다. 세포독성평가는 MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich, St.
- Oyaizu [14]의 방법에 따라 측정하였다. MPEE 1 ml에 pH 6.
성능/효과
- Fig. 1D에서 보는 바와 같이 양성 대조군으로 사용된 0.01%의 농도의 vitamin C는 약 318.47%의 환원력을 나타내었고, MPEE 처리군은 최고 농도인 64 μg/ml에서 양성 대조군보다 30% 큰 환원력을 나타내었다.
- 이전 연구에서도 바나나 껍질은 산화적 스트레스에 대한 세포 손상 억제 효과를 가지고 있으며 항산화 효과가 뛰어나다고 보고하였다[22, 25]. MPEE의 흑모 생성 촉진 효과를 조사하기 위해 melanin 합성 기전에서 중요한 효소인 tyrosinase 활성을 측정한 결과, MPEE가 체내에서 tyrosine에서 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로 DOPA에서 DOPA quinone으로 전환되는 과정에서 tyrosinase 활성을 증가시켜 멜라닌 생성을 촉진 시 키는 것으로 나타났다. 이전 연구에서도 바나나 껍질은 멜라닌 생성 합성 과정에 관여하는 tyrosine hydroxylase 효소의 활성을 촉진한다고 보고되었다[21].
- Superoxide (O2¯)를 제거시켜 과산화수소로 변화시키는 SOD-2의 발현을 조사한 결과 농도 16 μg/ml에서 대조군과 양성 대조군인 IBMX와 비슷한 단백질 발현을 나타내었다.
- 이러한 결과는 멜라닌 세포의 색소 침착, 생존에 관여하는 MITF의 전사인자에 의해 TRP-1과 TRP-2의 발현 조절이 촉진된다는 보고와 일치한다[30]. 그러나 MPEE는 과산화수소를 제거시켜주는 항산화 효소인 catalase의 발현에 영향을 미치지 못하였으나, superoxide를 제거 시켜 과산화수소로 변환시키는 SOD-2의 발현은 증가시키는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 MPEE가 모낭 내에 축적되는 과산화수소의 생성을 감소시켜 노화를 억제시키며 멜라닌 생성을 촉진할 수 있다는 가능성을 제시한다.
- 본 연구에서 사용된 MPEE는 DOPA chrom에서 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)가 생성되는 산화 과정에 관여하는 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 발현을 촉진시키며 양성 대조군과 유사한 효능을 나타내었다. 동시에 tyrosinase related protein-1 (TRP-1)의 단백질 발현도 증가시켜 MPEE는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 효소의 발현 조절에 관여함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 멜라닌 세포의 색소 침착, 생존에 관여하는 MITF의 전사인자에 의해 TRP-1과 TRP-2의 발현 조절이 촉진된다는 보고와 일치한다[30].
- Melanocyte의 종류 중 하나인 B16F1 cell을 이용하여 독성이 없는 농도에서 진행되었다. 먼저, 항산화 활성에 영향을 주는 폴리페놀의 양을 측정하였고, MPEE의 ROS 소거능을 조사한 결과 MPEE은 DPPH radical assay와 reducing power test에서 양성 대조군으로 사 용한 vitamin C보다 큰 항산화 효과를 나타내었다. 세포 내 과산화수소 생성을 측정할 수 있는 DCFH-DA assay에서 대조군과 비교하였을 때 MPEE가 과산화수소의 발생을 억제하는 것으로 나타났다.
- 이전 멜라닌 생성에 대한 연구에서 양성 대조군으로 사용된 α-MSH와 IBMX는 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 신호 경로에 의해 TRP-2의 발현을 증가시킨다고 보고된 바 있다 [13, 23]. 본 연구에서 사용된 MPEE는 DOPA chrom에서 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)가 생성되는 산화 과정에 관여하는 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 발현을 촉진시키며 양성 대조군과 유사한 효능을 나타내었다. 동시에 tyrosinase related protein-1 (TRP-1)의 단백질 발현도 증가시켜 MPEE는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 효소의 발현 조절에 관여함을 알 수 있었다.
- 먼저, 항산화 활성에 영향을 주는 폴리페놀의 양을 측정하였고, MPEE의 ROS 소거능을 조사한 결과 MPEE은 DPPH radical assay와 reducing power test에서 양성 대조군으로 사 용한 vitamin C보다 큰 항산화 효과를 나타내었다. 세포 내 과산화수소 생성을 측정할 수 있는 DCFH-DA assay에서 대조군과 비교하였을 때 MPEE가 과산화수소의 발생을 억제하는 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 MPEE에 함유되어 있는 폴리페놀은 in vitro 항산화 효과에 영향을 미치며, 세포 내에서 발생되는 ROS를 제거할 수 있다고 판단된다.
- 본 연구에서는 멜라닌 생성을 촉진시키는 양성대조군으로 α-MSH와 IBMX가 특히 TRP-2의 발현을 증가시키 는 것을 관찰하였다. 이 결과는 TRP-2가 멜라닌 생성 촉진에 중요한 역할을 한다는 것을 암시하고 있다. 이전 멜라닌 생성에 대한 연구에서 양성 대조군으로 사용된 α-MSH와 IBMX는 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 신호 경로에 의해 TRP-2의 발현을 증가시킨다고 보고된 바 있다 [13, 23].
- 그러나 MPEE는 과산화수소를 제거시켜주는 항산화 효소인 catalase의 발현에 영향을 미치지 못하였으나, superoxide를 제거 시켜 과산화수소로 변환시키는 SOD-2의 발현은 증가시키는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 MPEE가 모낭 내에 축적되는 과산화수소의 생성을 감소시켜 노화를 억제시키며 멜라닌 생성을 촉진할 수 있다는 가능성을 제시한다. 결론적으로 MPEE 는 TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 과산화수소의 발현을 감소시키므로 세포 내 멜라닌 생성을 촉진시키는 소재이자 항산화제로서의 활용가치가 있는 것으로 기대된다.
- 세포 내 과산화수소 생성을 측정할 수 있는 DCFH-DA assay에서 대조군과 비교하였을 때 MPEE가 과산화수소의 발생을 억제하는 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 MPEE에 함유되어 있는 폴리페놀은 in vitro 항산화 효과에 영향을 미치며, 세포 내에서 발생되는 ROS를 제거할 수 있다고 판단된다. 또한, 이를 통해 피부 노화 억제 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
후속연구
- 이러한 결과는 MPEE가 모낭 내에 축적되는 과산화수소의 생성을 감소시켜 노화를 억제시키며 멜라닌 생성을 촉진할 수 있다는 가능성을 제시한다. 결론적으로 MPEE 는 TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 과산화수소의 발현을 감소시키므로 세포 내 멜라닌 생성을 촉진시키는 소재이자 항산화제로서의 활용가치가 있는 것으로 기대된다.
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